液相色谱和质谱联用技术结合化学计量学应用于代谢组学的研究进展.docx

液相色谱和质谱联用技术结合化学计量学应用于代谢组学的研究进展林艳萍 1 , 2司端运 23 2刘昌孝1 (天津大学化工学院制药工程系 , 天津 300072 )2 (天津药物研究院 ,天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室 ,天津 300193 )摘 要 代谢组学作为系统生物学的重要组成部分 ,已经成为继基因组学 、转录组学 、蛋白质组学之后兴起的一个新的组学研究热点 。准确全面的检测生物体液中浓度较低的代谢物变化是进行代谢组学研究的基础 。 液相色谱和质谱联用 (LC /M S)技术结合化学计量学很好地实现了对大量样品和微量代谢物的快速定性 、定 量分析 ,极大地推动了代谢组学的相关研究 。本文综述了 LC /M S与化学计量学相结合用于代谢组学研究的 现状 ,并对后续的研究进行了展望 。关键词 液相色谱和质谱联用技术 , 化学计量学 , 代谢组学 ,评述1 引言代谢组学 (m e tabonom ic s)是继基因组学 、转录组学 、蛋白质组学之后兴起的一个新的组学研究热点 ,是系统生物学的重要组成部分 13 。N icho lson等 4 在 1999 年提出代谢组学的概念 : 对病理生理刺 激或基因改变时生物体系的动态代谢响应所进行的多参数定量分析 ( the quan tita tive m ea su rem en t of thedynam ic m u ltip a ram e tric m e tabo lic re spon se s of living system s to p a thop hysio logica l stim u li o r gene tic mod ifi2 ca tion) 。体液中的代谢物与细胞 、组织中的代谢物处于动态的平衡当中 。当机体由于外界刺激或毒性 反应导致组织细胞出现异常的时候 ,正常的代谢过程出现障碍 ,生物的体液组成就会产生变化 。代谢组 学的研究目的就是从尿液 、血浆 、血清 、唾液和胆汁等生物体终端样本中检测代谢物 ,或跟踪代谢水平整 体的动态变化 ,提取“组学 ”信息 ,以此来反映生物体在外源刺激作用下的体内生物学过程变化情况 。 其中的一个基础研究过程就是全面准确的对生物体的终端代谢产物进行定性和定量分析 。由于生物体 内的各种代谢物往往以较低的浓度存在于复杂的生物介质中 ,使得有关代谢组学的研究工作进展缓慢 。随着分析技术的发展 ,近年来对大量样品和微量代谢物的分析技术取得长足进步 ,为代谢组学研究 的具体实施提 供 了 技 术 支 持 。代 谢 组 学 研 究 , 主 要 使 用 的 分 析 方 法 有 核 磁 共 振 波 谱 ( NMR ) 、质 谱 (M S) 、色谱 ( GC或 H PLC ) 、红外光谱 、库仑分析 、紫外吸收 、荧光散射及发射性检测和光散射等 5 ,其中 最为常用的方法是核磁共振分析和质谱分析 。上述分析手段的机制 、特点等各不相同 ,但都会在较短的时间内产生海量的多元性数据 ,需要对其 进行统计和归类分析 ,从中提取特征代谢物或代谢量的整体变化规律 。传统的人工提取信息的方法已 经远远不能满足要求 。近年来 ,研究者们多借助化学计量学原理编辑软件在计算机上实现该过程 。因 此 ,代谢组学研究就与高通量 、高灵敏度的分析手段以及准确 、迅速的信息提取方法实现了紧密地结合 。 许多基因组学 、转录组学 、蛋白质组学等研究无法察觉的变化 ,可以通过分析代谢组体现出来 ,再加上代 谢组学研究还具有无损伤 、可量化的特点以及高通量 、低成本的优势 6 ,近年来代谢组学研究在药物研 发 、药物安全性评价 7 , 8 ,环境外源物毒性检测 9 、营养分析 10 、疾病诊断 1113 及植物代谢组学 14 等领 域都彰显出巨大的科学潜力 。2 L C /M S技术的特点液相色谱和质谱联用技术在有关代谢物的分析研究中发挥着越来越重要的作用 。色谱是最常用的2006 211 215 收稿 ; 2007 202 228 接受本文系国家自然科学基金 (No. 20675056 , 30630075 )资助项目3 E2m a il: liuchangxiao163. com分 析 化 学第 35卷1536分离分析工具 ,与质谱联用则可以更高效 、快速的完成从分离到分析的一整套操作 。气相色谱与质谱联用 ( GC /M S)技术和 LC /M S技术可以同时检测出数百种化合物 ,包括糖类 、有机酸 、氨基酸 、脂肪酸和大 量植物的次级代谢产物 15 。 GC /M S技术需要先对样品进行衍生化预处理 。这一步骤耗时而且容易引起样品的变化 。受此限制 , GC /M S技术不能分析热不稳定物质和一些大分子的代谢产物 。而 LC /M S 技术不受此限制 ,又经济实用 ,适用于那些热不稳定 ,不易挥发 、不易衍生化和分子量较大的物质 16 。 质谱多通道监测的功能和色谱卓越的分离能力使 LC /M S技术对检测样品的浓度和纯度要求与 NMR 技 术相比明显降低 ,甚至对含量极低的物质也能通过优化质谱的扫描模式给出可视化响应 。同时 , LC /M S 技术又有较好的选择性和较高的灵敏度 ,得到了越来越广泛的应用 。LC /M S技术产生的数据信息有其自身的特点 ,所产生的数据由 H PLC 或 NMR 的二维数据 ,上升为 保留时间 、质荷比和信号强度组成的三维数据 。应用 LC /M S技术分析代谢产物时 ,要求必须同时采用 保留时间和质荷比二个参数才能准确地标识一个化学成分 ,无疑增加了 LC /M S谱图解析工作的难度 。3 基于化学计量学的信息挖掘化学计量学 ( chemom e tric s)是化学科学的一个分支 ,能够设计 、研究多种数学模型 (高通量模型 、统 计模型 、分析模型等 ) ,特别适用于处理大量的复杂数据 17 。借助化学计量学可以帮助代谢组学解决两 个棘手问 题 : 在 不 丢 失 关 键 信 息的前提下把化学问题抽象成合理 的数学模型 ;选用合理有效的数理统计方法对数学模型进行计算 ,给 出分析结果 。希望借助化学计量 学实现的理想的数据处理模式如 图 1所示 。3. 1 解析谱图建立数学模型要把 LC /M S 分 析 产 生 的 谱 图转变为合理的数学模型须对原图 1 理想的数据分析过程F ig. 1 Idea l system of da ta ana lysis始谱图进 行 预 处 理 , 其 中 包 括 两个关键步骤 :过滤噪音和峰匹配 。取平均过滤法 (m ed ian filte ring)是目前经常采用的一种过滤噪音方法 。它属于非线性滤过法 ,采用某一相应数 值 点 周 围 几 个 点 的 平 均 值 来 替 代 该 点 , 从 而 达 到 滤 噪 的 目 的 18 。另 一 种 是 匹 配 滤 噪(m a tched filtra tion) ,借助高斯函数建立一个标准峰模型 ,模型中的峰宽度与高斯函数相对应 19 。在原 始数据中 ,峰宽小于该函数的 ,一律被视为噪音而剔除 。在此方法的基础上 , A nd reev等 20 又发展了实 验确定噪音的匹配滤噪法 (m a tched filtra tion w ith exp e rim en ta l no ise de te rm ina tion, M END ) 。该方法可以 更好得识别出强度较弱的色谱峰 ,自然可以提供更多的信息 。噪音过滤主要根据色谱的保留时间进行 , 不会影响质谱给出的任何质荷比数据 。在峰匹配方面容易想到的方法是在待测的样品中加入内标 ,根据内标在同一检测条件下保留时间 相同的原理 ,来校正色谱峰保留时间的漂移 。例如 W a te rs公司的软件 M a rke rL ynx就是通过内部计算选 用一个“内标 ”完成该步骤 ,但是该软件只适用于 W a te rs公司仪器系统 ,其它型号的质谱仪产生的谱图 受到限制 。事实上 ,借助内标进行峰匹配有两大缺陷 21 : ( 1 )该方法首先假设色谱保留时间的漂移是线 性的假设与实际不相符 ; ( 2 )需要首先找到既稳定又不与目标化合物相互干扰的新化合物作为内标 ,增加了工作量 。为了避免这些缺陷 ,同时实现非线性滤噪 , N ie lsen 等提出了相关性优化偏移 ( co rre la tion op tim ized wa rp ing, COW )的方法 22 。该方法综合考虑全谱的每个峰宽 ,使用两个估计参数模拟峰偏移 , 建立一个去除峰偏移后的对应模型 ,然后把该模型与每张色谱图对照就得到峰偏移系数矩阵 。之后也 可以借助质谱图中包含的信息 ,进一步优化该系数矩阵 23 。 COW 方法以及与它相关的优化方法都是第 10期林艳萍等 :液相色谱和质谱联用技术结合化学计量学应用于代谢组学的研究进展1537建立在峰偏移的大小不超过两个相邻峰间隔的基础上 。另一种进行峰匹配的方法就是直接建立描述峰偏移的函数 ,使其系数的方差最小 ,从而使两张谱图里相同色谱峰的保留时间偏差最小 24 。 经过上述两个步骤后 ,还需要把 LC /M S技术给出的三维信息转变成二维数据矩阵 ,为后续的统计学处理做好准备 。目前有两种思路实现数据降维 :将图谱按照时间分段然后建立矩阵 ,在每个特定的时 间段内 ,矩阵的每一行代表不同的样品 ,每一列代表该时间段内扫描检测到的质荷比 25 ;或借助 M a rk2 e rlynx软件 ,将保留时间和质荷比联合作为矩阵每一列的标识 ,不同的样品作为行 ,建立数据阵 26 。3. 2 数理统计方法已经建立的数据矩阵中还是隐含有大量的信息 ,需要借助数理统计方法才能给出化学意义明确的 结果 。常用于代谢组学研究的统计方法分为两大类 :有监督式 ( sup e rvised)模式识别和无监督式 ( un su2p e rvised)模式识别 27 。有监督式模式识别利用大量的样本 ,作为训练数据建立数学模型 ,并利用后续的检测数据优化模 型 ,从而提高样本类别判断和生物标志物识别的准确性和可靠性 。使用该类分析方法的前提是对样本 的分类已有初步判断 。所用到的具体方法包括软独立建模分类法 ( soft indep enden t mode ling of c la ss a2na logy, S IMCA ) 28 、偏最小二乘法判别式分析法 ( p a rtia l lea st squa re s d isc rim inan t ana lysis, PL S2DA ) 29 、 k最近邻法 ( k nea re st ne ighbo rs, kNN ) 30 和人工神经网络 ( a rtific ia l neu ra l ne two rk, ANN ) 31 方法等 。 无监督式模式识别应用于不具备任何相关知识背景的情况下 ,对生物样本进行类别归属和生物标志物( b iom a rke r)识别 ,也是目前代谢组学研究中较普遍采用的一类研究方法 ,常用的有主成分分析 ( p rinc i2p a l componen ts ana lysis, PCA ) 32 和簇类分析 ( h ie ra rch ica l c lu ste r ana lysis, HCA ) 33 等 。一般先采用 PCA 等无监督模式识别方法 ,将未知样品进行分类 ,同时找出异常点 ,即可能的生物标 志物 。但是传统的 PCA 方法存在先天的缺陷 ,比如易受数据尺度不同的影响而准确性比较低 34 ,新发 展的稳健 PCA、小波分析 35 等可对 PCA 实现补充 。在建立初步的分类模型之后可以借助有监督式模 式识别方法如 PL S2DA 等 ,对该分类模式用同种类的样品进行验证 ,剔除不合理假设 ,进一步优化模型 。 最后把数学结果回归成有化学意义的参数 ,给出易于研究者们理解的报告 。有关化学计量学的全部过 程基本是通过编辑软件在计算机上实现 。4L C /M S技术结合化学计量学方法在代谢组学研究中的应用4. 1 药物研究开发中的应用快速发展的药物研发对分析手段的效率和可靠性提出了更高的要求 。药物直接或通过某些代谢渠 道间接产生的代谢物积累可能造成毒理终点的产生 ;另外 ,药物通过代谢产生的物质进入血液 ,进而分布到一些组织器官发挥作用 ,也可能形成毒理终点 。而毒理终点造成的生化改变是 LC /M S技术所能检 测到的 。对 LC /M S分析产生的数据采用适当的化学计量学方法进行处理 ,就能提取出丰富的药物代谢 信息 ,使得代谢组学研究在药物研发阶段发挥作用 :进行早期活体毒理测试 ,而且能为药物分子的筛选 提供依据 ;帮助确定药物的安全性生物标记物和代谢表型 ,并能评价将动物模型实验应用于人类疾病的 可行性 。L u tz等 36 借助 M a rke r V iew 来识别色谱峰 ,利用 S IMCA 软件来进行 PCA 或 PL S2DA 分析 ,成功地 区分了男性和女性志愿者尿液中的类固醇葡萄糖苷酸 ; Sm ith等 21 借助基于 R 语言环境下的 XCM S软 件包实现对 LC /M S数据处理 。 P lum b等 37 应用 M a rke rlynx App lica tion M anage r V e rsion1. 0 (M ic rom a ss, U K) 进 行 峰 识 别 , 运 用 M a tL ab 软 件 包 (M a thwo rk s, N a tick ) 进 行 PCA 处 理 , 利 用 P iroue tle p ackage (V e rsion 3. 0; Info rm e trix, WA , U SA )进行后续的分析处理 ,验证了化学计量学方法处理 LC /M S数据的优势 。W agne r等 38 用线性离子阱质谱仪提供的中性丢失扫描模式 ,选用新的化学计量学方法处理数 据 ,区分了男性和女性病人在口服阿司匹林后的差异 。在最低服用剂量为 50 m g时 ,也成功找到阿司匹 林代谢的生物标志物 。本研究组采用 LC /M S技术结合化学计量学方法研究溴莫普林在大鼠体内的代 谢产物 。选用 XCM S软件包进行数据处理 ,并在 The rmoF inn igan公司的 Xca libu r 2. 0 质谱工作站中对结分 析 化 学第 35卷1538果的有效性进行了验证 39 。4. 2 病理学研究肌体任何部位出现异常 ,在体液组成上都会有所反映 。因此 ,由于病理原因造成的代谢紊乱同样也 在 LC /M S的检测范围之内 。W ang等 40 研究了 型糖尿病患者和健康志愿者血浆中磷脂水平的差异 ,并同时比较了 PCA 和PL S2DA 两种分析方法在 区别 两 类样 品时 的 优劣 , 希 望找 到 型 糖尿 病血 浆中 的 生 物 标 志 物 。 Shen 等 41 研究者从系统生物学的角度 ,探索了致命性脓血症的病理原因 。而 W an t等 42 借助 LC /M S技术 结合 XCM S软件包解析谱图 ,进行血清药理学的研究 。4. 3 营养学研究现代公共健康学认为 ,营养不再是食物摄取中数量和质量的最低限量 ,而是指可以影响基因 、蛋白 、 和代谢产物的饮食信号 43 ,它与基因组 、蛋白组 、转录组和代谢组紧密相关 。代谢组学研究作为表征肌 体最终反映的系统生物学方法 ,在现代营养学研究中也可以发挥关键作用 。我们的日常饮食并非是作 用于单一靶点的单一化合物 ,而是同时调节众多生化途径的复杂混合物 ,饮食不当往往会诱发多种慢性代谢疾病的发生 。而基于传统检测方法的食谱建议往往缺乏全面性和及时性考察 ,不能全面准确的反 映机体的营养情况 。代谢组学方法的建立 ,为安全 、有效 、合理的膳食建议提供了个性化的科学系统 44 。 脂类分析是营养学中最为重要的研究课题 ,代谢组学在这一领域的研究成果也最为显著 。W a tk in s等 10 用代谢组学研究了拮抗剂罗格列酮的慢性肝脂变的作用 ,从而确立了代谢组学分析体内脂类营养 物质的组学分析方法 。2003年 , Han等 45 进一步将这种脂类的整体分析命名为脂组学 ( lip idom ic s) 。在疾病的营养介入治疗方面 , L am e rs等 46 应用动物骨关节炎 ( o steoa rth ritis, OA ) 模型进行代谢组 学研究 ,发现乳酸等生物标志物与 OA 有关 。随后通过维生素 C 营养介入治疗后 ,代谢异常得到矫正 , 不仅证明了代谢组学在营养评价方面的可行性 ,也为维生素 C 营养介入治疗骨关节炎的分子机理研究 奠定了基础 。在转基因食品的安全评价方面 , Ca tchpo le等 47 应用代谢组学方法分析转基因马铃薯 ,发 现其与传统品种的代谢物成分在统计学范围内相同 ,从而证明了该转基因食品的安全性 ,同时表明代谢 组学分析在这一领域的巨大应用前景 。4. 4 环境安全评价在环境安全方面 ,随着环境污染的日益恶化 ,许多化学物质对人类环境的威胁已到了不容忽视的地 步 。阐明这些物质生理和毒理相互作用的过程 ,对阐释职业与环境疾病的病理 ,提出有效的治疗方案是 十分必要的 。L afaye等 48 应用 LC /M S技术分析重金属毒物对小鼠的慢性毒性 ,并进行了碰撞诱导解离实验 ,借助 Xca llibu r软件发现几十种物质有明显变化 ,是可能的生物标志物 。然后搜索化学或代谢物数据库 , 结合保留时间和碎片离子质谱图最终鉴定出尿酸等几大类化学成分 ,从而解决了代谢组学海量数据数 理的分析与化学意义识别问题 。5 研究展望综上所述 , LC /M S技术结合化学计量学已经对代谢组学领域的研究产生推动作用 ,但其本身仍然 有很大的发展空间 ,面临着理论突破和广泛应用两方面的挑战 。仪器制造技术的发展 ,和基于计算机的化学计量学方法的完善 ,极大地推动了 LC /M S技术应用于 代谢研究 。但是 LC /M S技术与化学计量学的结合仍有许多方法学上的问题需要解决 : 首先 ,生物体系 的复杂性决定了生物体液以及生物组织组成的复杂性 ,即使 LC /M S技术有较高的检测灵敏度 ,痕量物质的归属和精确定量也还存在不少困难 ; 其次 ,现有的化学计量学方法处理结果存在明显的“假阳性 ” 现象 ,而且只能很好的反映含量较高的物质的浓度变化 ,对低含量代谢物分析的准确性和可靠性显著下 降 。而这些低含量的物质往往携带了重要的信息 ;再次 ,应用 LC /M S技术确证化合物结构时不如 NMR 技术直接有效 ,而且可供搜索用于确定化合物结构的数据库有限 ,不能满足复杂多样的代谢物研究的需第 10期林艳萍等 :液相色谱和质谱联用技术结合化学计量学应用于代谢组学的研究进展1539要 ;最后 ,科研工作者已经总结了一些与病理和生理变化相关的标志性代谢产物 ,但是要建立完整的诊断专家系统 ,实现代谢组学诊断的常规化还需要做大量的工作 。围绕着上述亟需解决的问题 ,合理有效地结合 LC /M S技术和化学计量学各自的优势检测生物体液 中代谢物的分布 、变化 ,尽量全面准确地对代谢物进行定性 、定量分析是未来代谢组学研究方向之一 。Referen ce sL iu Chang2X iao (刘昌孝 ) . Ch inese T rad itiona l and H erba l D rugs (中草药 ) , 2004 , 35 ( 6 ) : 601605L iu Chang2X iao (刘昌孝 ) . T ian jin Pha rm acy (天津药学 ) , 2005 , 17 ( 2 ) : 16X ie Yue2Sheng (谢 跃 生 ) , Pan Gu i2X iang (潘 桂 湘 ) , Gao X iu2M e i (高 秀 梅 ) , L iu Chang2X iao (刘 昌 孝 ) . C h inese J. A na l. Chem. (分析化学 ) , 2006, 34 ( 11 ) : 16441648N icho lson J K, L indon J C, Ho lm e s E. X enobiotica, 1999, 29: 11811189Xu Guo2W ang (许国旺 ) , Yang J un (杨 军 ) . Ch rom a tog raphy (色谱 ) , 2003 , 21: 316320Thom a s G H. T rends M icrobio. , 2001 , 9: 255L indon J C, N icho lson J K, Ho lm e s E, A n tti H , Bo lla rd M E, Keun H , B eckone rt O , Ebbe ls T M , R e ly M D , Robe rtson D , Steven s G J , L uke P, B reau A P, Can to r G H , B ib le R H , N iede rhau se r U , Senn H , Sch lo tte rbech G, Side lm ann U G, L au rsen S M , Tym iak A , Ca r B D , L ehm an2M cKeem an L , Co le t J M , Loukac i A , Thom a s C. Tox icol. A ppl. Pha rm acol. ,2003 , 187: 137146L indon J C, Keun H C, Ebbe ls T M , Pe rce J M , Ho lm e s E, N icho lson J K. Pha rm acogenom ics, 2005 , 6: 691699L afaye A , J uno t C, R amoune t2L e Ga ll B , F ritsch P, Tabe t J C, Ezan E. R apid Comm un. M ass S pectrom. , 2003 , 17:25412549W a tk in s S M , R e ifsnyde r P R , Pan H J , Ge rm an J B , L e ite r E H. J. L ipid R es. , 2002, 43: 18091817B rind le J T, N icho lson J K, Schofie ld P M , Gra inge r D J , Ho lm e s E. A na lyst, 2003, 128: 3236Griffin J L , Bonney S A , M ann C, H ebbach i A M , Gibbon s G F, N icho lson J K, Shou lde rs C C, Sco tt J. Physiol. Genom 2ics. , 2004, 17: 140149B rind le J T, A n tti H , Ho lm e s E, Tran te r G, N icho lson J K, B e the ll H W , C la rke S, Schofie ld P M , M cKilligin E,12345678910111213Mo seda le D E, Gra inge r D J.N a t. M ed. , 2002, 8: 14391444141516To lstikov V V , F iehn O. A na l. B iochem. , 2002, 301: 298307Taylo r J , King R D , A ltm ann T, F iehn O. B ioinform a tics, 2002, 18: S241248Yin H eng (尹 恒 ) , L i Shu2Guang (李曙光 ) , B a i Xue2Fang (白雪芳 ) , D u Yu2Guang (杜昱光 ) . Ch inese B u lletin ofB otany (植物学通报 ) , 2005 , 22 ( 5 ) : 532540W o ld, S. C hem om etrics and In telligen t L abora tory S ystem s, 1995, 30: 109115H a stings C A , No rton S M , Roy S. R apid Comm un. M ass S pectrom. , 2002 , 16: 462467D an ie lsson R , B ylund D , M a rk ide s K E. A na ly tica Ch im ica A cta, 2002, 454: 167184A nd reev V P, R e jta r T, Chen H S, Mo skove ts E V , L vanov A R , Ka rge r B L. A na l. C hem. , 2003, 75: 63146326Sm ith C A , W an t E J , OM a ille G, A bagyan R , Siuzdak G. A na l. Chem. , 2006 , 78: 779787N ie lsen N V , Ca rsten sen J M , Sm ed sgaa rd J. J. Ch rom a tog r. A , 1998 , 805: 1735B ylund D , D an ie lsson R , M a lm qu ist G, M a rk ide s K E. J. C h rom a tog r. A , 2002, 961: 237244Yang J , Xu G W , Zheng Y F, Kong H W , W ang C, Zhao X J , Pang T. J. Ch rom a tog r. A. , 2005, 1084: 214221Jon sson P, B ruce S J , Mo ritz T, Trygg J , Sj str m M , P lum b R , Grange r J , M a ibaum E, N icho lson J K, Ho lm e s E, A n ttiH. A na lyst, 2005, 130: 70170717181920212223242526272829303132Yin P, Zhao X, L i Q , W ang J , L i J , Xu G W.J. P roteom e R es. , 2006, 5: 21353143L indon J C, Ho lm e s E, N icho lson J K.W o ld S. Pa ttern R ecogn ition, 1976 , 8: Ge lad i P, Kowa lsk i B R. A na l. Ch im.P rog ress in N uclea r M agnetic R esonance S pectroscopy, 2001 , 39: 140127139A cta. , 1986 , 185: 117Kowa lsk i B R , B ende r C F. J. Am erican C hem. S ociety , 1972, 94: 56325639Bo sque M. U nde rstand ing 99 % of A rtific ia l N eu ra l N e two rk s: In troduc tion & Trick s. N ew Yo rk: iU n ive rse, 2002: 1722Jo lliffe I T. P rinc ip a l Componen t A na lysis. 2 nd ed. , N ew Yo rk: Sp ringe r2V e rlag, 2002: 19分 析 化 学第 35卷15403334John son S C. Psychom etrika, 1967, 2: 241254L i J ing (李 晶 ) , W X iao2J ian (吴晓健 ) , L iu Chang2X iao (刘昌孝 ) ,S in ica (药学学报 ) , 2006, 41: 4753Yuan Ying2J in (元英进 ) . A cta Pha rm aceu tica353637W u X J , L in Y P, Song N N , Yuan Y J. A sian J. D rug M etab. Pha rm acok inet. , 2005, 5: 287293L u tz U , L u tz R W , L u tz W K. A na l. Chem. , 2006 , 78: 45644571P lum b R S, Stump f C L , Grange r J H , Ca stro2Pe rez J , H a se lden J N , D ea r G J. R apid Comm un. M ass S pectrom. , 2003 ,17: 26322638W agne r S, Donegan M , B u rton L , W inga te J , V lke l W. A na l. Chem. , 2006 , 78: 12961305L in Y P, Si D Y, L iu C X. A sian J. D rug M etab. Pha rm acok inet. , 2006, 6: 280W ang C, Kong H W , Guan U F, Yang J , Gu J , Yang S L , Xu G W. A na l. Chem. , 2005 , 77: 41084116Shen Z , W an t E J , Chen W , Kea ting W , N u ssbaum e r W , Moo re R , Gen tle T M , Siuzdak G. J. P roteom e. R es. , 2006 ,5: 31543160W an t E J , Sm ith C A , Q in C, V anHo rne K C, Siuzdaak G. M etabolom ics, 2006 , 10: 10071016M u lle r M , Ke rsten S. N a t. R ev. Genet. , 2003 , 4: 315322Ge rm an J B , Robe rts M A , W a tk in s S M. J. N u tr. , 2003, 133: 2078 S2083S H an X, Gro ss R W. J. L ipid R es. , 2003, 44: 10711079L am e rs R J , D egroo t J , Sp ie s2Fabe r E J , J e llem a R H , Krau s V B , V e rzij l N , Tekopp e le J M , Sp ijk sm a G K, Voge ls J T, van de r Greef J , van N e sse lroo ij J H. J. N u tr. , 2003 , 133: 17761780Ca tenpo le G C, B eckm an M , Eno t D P, Mondhe M , Zvw ick i B , Taylo r J , H a rdv N , Sm ith A , King R D , Ke ll D B , F iehnO , D rap e r J. P roc. N a tl. A cad. S ci. U SA. , 2005, 102: 1445814462L afaye A , J uno t C, Ga ll B R , F ritsch P, Tabe t J C, Ezan E. R apid Comm un. M ass S pectrom. , 2003, 17: 254125493839404142434445464748A dvan ce s of L iqu id C hrom a togra phy /M a ss Spec trom e try C om b in ed w ithC hem om e tr ic A pproa che s A pp l ied to M e ta bon om ic sL in Yan2P ing1, 2 , Si D uan2Yun2 , L iu Chang2X iao3 2