艾德KRAS试剂盒说明书

【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase ChainReaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为1530%，在结直肠癌患者中的突变率为2050%。导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。KRAS基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变 突变名称 氨基酸变化 碱基变化 Cosmic ID 公司命名 Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸 GGTGAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸 GGTGCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸 GGTGTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸 GGTAGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸 GGTCGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸 GGTTGT 516 12-1-T Gly13Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGCGAC 53213-2-A【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用双环探针对扩增产物进行检测，结合特别的PCR反应程序和高特异Taq酶的使用，在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，以达到对稀有突变检测的高特异性和高灵敏度，即高的选择能力。【主要组成成份】试剂盒采用8联PCR管设计，每一个8联PCR管检测一个样品，8联管的1-7(或A-G，或8联PCR管两端各有一个小孔，小孔居侧端为1号管，小孔居中端为8号管)管内装有相应的KRAS基因7种突变检测和内控试剂，突变由FAM信号指示，内控由HEX（或VIC）信号指示；8（或H）号管作为DNA提取质量的外控检测管，亦由FAM信号指示，内控和外控作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控，选择的检测区域是人类KRAS基因相对保守的区段，约100bp，这样即便DNA有降解，外控和内控仍然能够最真实地反检测所用DNA的质量非常重要。由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品应KRAS基因有效的DNA量。每个PCR反应管内均含有510 pM特异性引往往会混有正常组织细胞，不同类型样品正常细胞混杂程度不同，而且提取的物、20 pM双环探针、12.5 M dNTPs、175 M氯化镁、1 mM硫酸铵、2.5 mMDNA纯度和质量也因样品类型而改变，尤其是用福尔马林固定的石蜡切片样氯化钾和纯化水等。（详见表2和表3）品，福尔马林会对DNA有交联和降解作用，因此请按下面推荐样品类型顺序表2 试剂盒组成收集样品并提取DNA用于检测，客户可根据临床实际样品的情况进行选择。试剂盒规格 12测试 1. 推荐样品类型顺序：新鲜病变组织冰冻病理切片石蜡包埋病理组织或切8联PCR管反应条 12条 片。Taq酶（KRAS） 35 L 2. 推荐使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA。所提DNA需用紫外分光KRAS阳性质控品250 L光度计测定浓度，其DNA的OD260/OD280在1.82.0。提取完的DNA建议立表3 8联PCR管反应条的组成即进行检测，否则请于-20以下保存，保存时间不要超过6个月。 管号 检测试剂 体积 荧光信号 3. 从新鲜病变组织中取样应确定至少含有30%肿瘤病变组织。1 A 12-2-A 35 L FAM，HEX/VIC 2 B 12-2-C 35 L FAM，HEX/VIC 4. 石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，所取部分尽量在3 C 12-2-T 35 L FAM，HEX/VIC 蜡块中部。4 或 D 12-1-A 35 L FAM，HEX/VIC 5. 所用石蜡包埋病理组织或切片样品一般请选择保存尚未超过3年的样品。5 E 12-1-C 35 L FAM，HEX/VIC 【检验方法】6 F 12-1-T 35 L FAM，HEX/VIC 建议在每次PCR反应中，每份样品和阳性质控品（STD）、阴性对照（NTC，7 G 13-2-A 35 L FAM，HEX/VIC自备纯化水）共同进行分析。8 H外控35 LFAM 1. 取出KRAS阳性质控品和Taq酶（KRAS），阳性质控品先解冻，再振荡混匀。其它需要自备的试剂和耗材有：阳性质控品和Taq酶（KRAS）需快速离心15秒待用。1. 石蜡切片样品DNA提取试剂推荐选用厦门艾德生物公司的核酸提取试剂2. 分别向体积均为45 L的待测样品DNA、KRAS阳性质控品和纯化水（NTC）（型号：FFPE DNA，Cat NO. ADx-FF01）；组织和胸水可使用厦门艾德中加入2.25 L Taq酶（KRAS），涡旋器上混匀15秒，然后快速离心15秒。 生物公司的组织、胸水样品DNA分离试剂盒（Cat NO. ADx-TI01）。 （1） 根据样品来源不同，可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。2. 无DNase和RNase移液器滤芯吸嘴。 新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。 3. 无DNase和RNase的纯化水。（2） 石蜡切片样品的DNA浓度推荐为1.53 ng/L，即每单个反应管添加【储存条件及有效期】的DNA量为7.515 ng。根据石蜡切片样品保存的年限不同，建议：须避光储藏在-205。有效期为10个月。开瓶后使用不影响产品有效保存不超过三个月的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度期。使用完毕后于-205保存。为1.5 ng/L；保存年限三个月至一年的石蜡切片样品每单个反应管试剂盒在运输过程中，需要泡沫箱加冰袋密封运输，运输时间不超过一周，添加的DNA浓度为2 ng/L；保存年限一年至三年的石蜡切片样品每运输温度不高于室温。单个反应管添加的DNA浓度为2.53 ng/L；不推荐使用保存超过三【适用仪器】年的石蜡切片样品。Stratagene Mx3000P?/3005P?、ABI7900HT、ABI7500、ABI StepOnePlus、（3） 非石蜡切片样品的DNA浓度推荐为0.41 ng/L，即每单个反应管添ABI7300、LightCycler480、Bio-Rad CFX96。加的DNA量为25 ng。注意：（4） 稀释样品DNA时推荐使用TE（pH8.0）。稀释方法不推荐跨数量级 使用ABI仪器时探针模式设置，Reporter Dye：FAM、VIC；Quencher 稀释，即每次稀释倍数控制在10倍以内；稀释时取样量体积不宜小Dye：TAMRA；Passive Reference：NONE。于5L，以免稀释后终浓度与预算值有偏差。 在ABI7900中，本试剂盒仅适用于ABI7900普通机型（非FAST机型），3. 在PCR管冰架上，轻轻揭开8联PCR管反应条的条盖。如发现管盖内侧有液反应程序模式为标准模式，反应体积选择40 L，且需要PCR 8联反应条辅助点，开盖前请先离心。器（BIOplastics 公司，Cat：7900RAN）。4. 将混好的DNA样品依次取5 L靠着PCR管上管壁加入8联PCR反应条中，然 适用于LightCycler480代仪器，若需在LightCycler480代仪器上使后小心盖上8联PCR管反应条管盖。用，则必须进行荧光校正。若LightCycler480代仪器也出现荧光交叉现象，注意：加好样品的PCR反应条应立即上机实验；若因特殊原因不能及时上则也需要进行荧光校正，且需要PCR 8联反应条辅助器（BIOplastics 公司，机反应，应将PCR反应条置于冰水混合物上或4冰箱（温度恒定）保存，Cat：B-79480）。保存时间不宜超过12个小时。 在使用Stratagene Mx3000P?/3005P?仪器时若发现荧光净升信号5. 离心8联PCR管反应条。（dR）较低且本底荧光（R）非常高，应适当降低仪器的增益设置。6. 将8联PCR管反应条放入实时PCR仪器。PCR反应板布局见表4中推荐方法。 有关各仪器的具体设置方法可从厦门艾德生物医药科技股份有限公司网站资料下载区获得。 PCR仪器在使用过程中应至少每年校准一次。【样本要求】1 / 2表4 PCR仪96 孔板建议布局名 称 1 2 ? 10 11 12 12-2-A 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-2-C 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-2-T 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-1-A 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-1-C 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-1-T 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 13-2-A 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 外控 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 7. 打开仪器窗口，按照下图中说明的扩增程序图进行设置。 第一阶段：95 5分钟，1个循环；第二阶段：95 25秒，64 20秒，72 20秒，15个循环； 第三阶段：93 25秒，60 35秒，72 20秒，31个循环； 信号收集：第三阶段60时收集FAM和HEX（或VIC）信号，执行实 时PCR，保存文件。8. 实验结束后，使用2层PE手套包扎好PCR反应条（使用Mx3000P仪器时应该待热盖冷却后再处理，以免烫伤，同时可避免由于PCR管盖较热易开造成污染），并按生物垃圾处理。如非特殊需要，严禁打开PCR管盖，以防造成污染。1. 阴性对照(NTC)的1-7（或A-G）号管的FAM信号应无曲线升起。若7管其中任一管FAM信号升起，则此次实验结果无效，同时建议重做一次。若1-7（或A-G）号管的HEX（或VIC）信号及8（或H）号管的FAM信号偶尔升起，此属正常现象，不影响对突变检测结果的判断。2. 阳性质控品(STD)的Ct值一般小于20，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。3. 确定试验是否成功可信：（1）外控对照反应孔的FAM信号应该升起。若为石蜡切片样品，则其Ct值应在1521之间；若为非石蜡切片样品，其Ct值应在1319之间。（2）若能满足1）的要求，则继续进行分析。（3）如果其Ct值小于（1）规定的范围，说明加入的DNA过量，应减少DNA加入量再进行试验。但突变信号无升起或者落在阴性区，该试验结果仍然可信。（4）若外控对照分析为阴性或Ct值大于1）规定的范围，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量过少，需要重新提取DNA或增加DNA上样量再进行试验。但突变信号有升起且落在强阳区，该试验结果仍然可信。（5）待测样品的内控HEX（或VIC）信号应升起。若内控对照分析为阴性或部分管分析为阴性，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量不够，需要重新提取DNA后再进行试验。但如果管内FAM有信号，可能是由于突变序列的扩增抑制了内控序列的扩增，结果仍然可信。4. Ct值的确定：确认未选择校正荧光参照，按管号顺序依次选择单一检测【阳性判断值及检验结果的解释】 版本号：P4.2 生效日期：2015.09 货号：ADx-KR01表5 结果判定 8联管编号 突变名称 强阳 弱阳 阴性 突变Ct值 突变Ct值 Ct Cut-off值 突变Ct值 1 12-2-A Ct 26 26Ct 28 9 Ct28 2 12-2-C Ct 26 26Ct 29 10 Ct 29 3 12-2-T Ct 26 26Ct 28 11 Ct 28 4 12-1-A Ct 26 26Ct 29 10 Ct 29 5 12-1-C Ct 26 26Ct 29 9 Ct 29 6 12-1-T Ct 26 26Ct 28 10 Ct 28 7 13-2-A Ct 26 26Ct 29 9 Ct 29 地点相隔离。不要使用超过有效期的试剂。8. 应该严格区分阳性质控品和反应试剂的使用，防止污染试剂，造成假阳性。9. 实验时注意防止外源DNA对试剂的污染，注意先加完样品DNA后再进行阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加DNA模板时，使用单独、专用的移液枪和滤芯枪头。进行反应试剂制备的地点应当与添加模板的反应管进行检测分析。需要同时选择阳性质控品反应孔、阴性对照孔和样【检验方法的局限性】品反应孔，然后用户可根据实际情况确定扩增曲线升起的拐点处，得到Ct值。5. 突变结果的确定：首先确定样品各个反应管各自的突变Ct值，然后确定该样品的外控Ct值。由于样品中突变百分含量各不相同，所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值，把样品检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判定见表5。（1） 当样品突变Ct值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。（2） 当样品突变Ct值小于阴性临界值时，进行下列判断：a） 当某个反应管的突变Ct值小于阳性临界值时，则该样品为该反应管对应的突变阳性，即强阳。b） 当反应管的突变Ct值大于或等于阳性临界值时，则计算该反应管的Ct值。若反应管的Ct值小于相对应的Ct Cut-off值，则该样品也为该反应管对应的突变阳性，即弱阳；反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。6. Ct值的计算：Ct值=突变Ct值-外控Ct值。突变Ct值是指样品突变信号（FAM信号）对应的Ct值；外控Ct值是指样品对应的外控信号（FAM信号）的Ct值。一个样品可能同时含有2个或多个突变类型。7. 某些强阳性样品可能会导致个别突变反应管之间出现交叉信号。当样品在2个或2个以上反应管出现阳性结果（按照表5判读）时，先确定突变反应管中Ct值最小的为真阳性，再计算各反应管的Ct值（突变Ct值-外控Ct值），并按照表6所列交叉信号阈值来判定其它反应管是否为交叉信号。（1） 若Ct值小于交叉信号阈值，则认为是真阳性信号，可判为该突变 反应管阳性；（2） 若Ct值大于或等于交叉阈值，则认为是交叉信号，可判为该突变反应管阴性。表6 交叉信号阈值表* 交叉 交叉反应管的阈值 真阳性 12-2-A 12-2-C 12-2-T 12-1-A 12-1-C 12-1-T 13-2-A 12-2-A - - - - - - 12-2-C - - - 11.12 10.95 - 12-2-T - - - - 11.98 - 12-1-A - - - 9.7 10.97 - 12-1-C - - - - 5.58 - 12-1-T - - - - 12.09 - 13-2-A - - - - - - 备注：“-”表示无交叉反应。“*”根据人工合成标准品的实验数据获得1. 本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者个性化治疗的选择应结合其症10. 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。状、体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。 11. 所有化学药品都具有潜在的危险性。具有PCR实验室上岗证的人员才能使2. 强阳，弱阳区分仅为检测人员提供结果判读方法，其阳性结果区分不能反用本试剂盒。在首次使用本试剂盒前，公司技术支持人员对操作者进行映临床意义的变化。培训。操作时，请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护3. 阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中肿瘤细胞过少、核酸过性措施。产品在正确使用过程中不慎溅入眼内应立即用冲眼器或大量清度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。 水冲洗眼睛。4. 肿瘤组织（细胞）可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到不同的12. 所有检测样本和试剂盒中的阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和检测结果。废弃物处理均需符合相关法规要求：卫生部微生物生物医学实验室生5. 不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作和实验环境均有可物安全通用准则和医疗废物管理条例。能导致假阴性或者假阳性结果。13. 临床实验室应严格按照医疗机构临床基因扩增实验室管理办法（卫6. 本试剂盒仅用于人类KRAS基因突变的定性检测，不可用于基因分型；仅能办医政发2010194号或现行有效版本）等有关分子生物学实验室、临检测本试剂盒所包括的已知基因型，不能检测其他未知分型。床基因扩增实验室的管理规范执行。 7. 该检测仅限于规定的样本类型及检测系统（包括适用机型、核酸提取试剂、【标识的解释】检测方法等）。：保持干燥；：向上；：易碎，小心轻放。8. 对于保存年限过久的石蜡组织样品所提取的DNA的检测能力不能按照本【参考文献】说明书进行。1. FDA website：/AboutFDA/CentersOffices/CDER/ucm .htm.2. McGrath JP, Capon DJ, Smith DH, Chen EY, Seeburg PH, Goeddel DV, 1. 试剂盒外观整洁，标记清晰，无漏液。试剂融化后，无混浊，无沉淀。 Levinson AD, 1983. Structure and organization of the human Ki-ras 2. 检测分别含有7种突变类型的7份阳性参考品，阳性参考品符合率100%； proto-oncogene and a related processed pseudogene. Nature 304 (5926): 5016. 3. Livre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. 2006. KRAS mutation status is 3. 检测10份阴性参考品，阴性参考品符合率100%。predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 4. 可以耐受10 ng野生型人类基因组DNA，无非特异；可以检出10 ng DNA样(8): 39925.品中含量低至1%的KRAS基因突变。4. James RM, Arends MJ, Plowman SJ, et al. 2003. KRAS Proto-Oncogene exhibits tumor suppressor activity as its absence promo