黄香楝树皮提取物的多酚含量及抗氧化研究.docx

文章编号: 1004-1656( 2014) 04-0537-04黄香楝树皮提取物的多酚含量及抗氧化研究江珊，孙培冬*( 江南大学食品胶体与生物技术教育部重点实验室，化学与材料工程学院，江苏无锡214122)摘要: 本文采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水 4 种溶剂提取黄香楝树皮中的活性成分，Folin-Ciocalteu 法测定提取 物中的总酚含量，甲醇、乙醇提取物中酚类活性成分含量较高，总酚含量分别为 58. 59、50. 47mgg1 。采用 DPPH 自由基清除法、邻二氮菲-Fe2+ 氧化法、过氧化氢清除法、还原力法、磷钼络合物法等 5 种抗氧化性测定22方法研究提取物的抗氧化活性，乙醇提取物浓度为 1. 0mgmL1 时，对 DPPH、OH、H O的清除率均大于 190% ，对 DPPH、OH、H2 O2 的 IC50 值分别为 234. 2、555. 2、60. 1gmL 。关键词: 黄香楝; 提取物; 多酚含量; 抗氧化活性中图分类号: O629. 9文献标志码: AStudy on the polyphenolic contents and antioxidant activities of extracts from Hesperethusa crenulata barkJIANG Shan1 ，SUN Pei-dong1*( The Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology，Ministry of Education，School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)Abstract: The antioxidant activities of Hesperethusa crenulata bark extracts from methanol，ethanol，ethyl acetate and aqueous were investigated in this assay. The total polyphenolic contents of the extracts were evaluated，using the Folin-Ciocalteu method. The poly- phenolic contents of methanol and ethanol extracts were higher compared to ethyl acetate and aqueous extracts，which were 58. 59、50. 47mgg1 ，respectively. The antioxidant and free radical scavenging activities of extracts of the plant were also assessed against 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl( DPPH) ，10-phenanthroline-Fe2+ oxidative assay of hydroxyl radical scavenging activity，hydrogen peroxide-scavenging activity，reducing power and phosphomolybdenum method. The results indicated that the scavenging abilities of1ethanol extract on DPPH，OH、H2 O2 were above 90% at the concentration of 1. 0mgmL1 The IC50 of the ethanol extract on DP-PH，OH，H2 O2 scavenging activities were 234. 2、555. 2、60. 1gmL Key words: hesperethusa crenulata; extracts; polyphenolic content; antioxidant activities黄香 楝，属 芸 香 科 柑 果 子 属，学 名 Hespere- thusa crenulata( oxb. ) oem，别名特纳卡 ( Thana- kha) 。主要分布在缅甸全境、泰国、印度及斯里兰 卡等热带地区1。人们常将黄香楝树皮磨成粉与 水调和涂敷于面部，起到清凉解毒、活血化瘀、止 痒止痛的治疗效果，同时它还具有抗衰防皱、抗紫 外线、柔嫩肌肤等美容作用。由于它对皮肤无毒 副作用，是天然的化妆品，因而在当地广受欢迎。自由基是生物体氧化反应中产生的有害物 质，当体内自由基过多时会引起疾病和衰 老2。 大量的研究表明，植物多酚作为一类具有生物活 性的天然化合物，具有较强的抗氧化作用，能够有 效的清除体内过剩的自由基，进而起到预防、治疗 疾病，减缓机体衰老的功效3。黄香楝树皮中多 酚类化合物的研究尚无报道，本文拟研究黄香楝 树皮提取物中多酚的含量及其抗氧化性，以揭示 黄香楝树皮中的重要活性成分。收稿日期: 2013-09-05; 修回日期: 2013-11-20联系人简介: 孙培冬( 1967-) ，女，副教授，主要从事天然活性成分提取及有机合成研究。E-mail: sunpeidong2004 126. com7. 4 的 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 2mL、甲 醇 1mL 及11材料与方法0. 75mmolL硫酸亚铁 1mL，混匀，最后加入 1mL1. 1材料与试剂黄香楝树干( 缅甸) ; 没食子酸标准品( 中国药0. 01% H2 O2 ，混 合 溶 液 在 37 下 水 浴 1h，于510nm 处测吸光度值; 用 1mL 提取物溶液代替上 述步骤中的 1mL 甲醇进行实验，于 510nm 处测吸5，6品生物制品鉴定所) ; DPPH( Sigma Wolsen) ; 抗坏光度值。羟基自由基清除率的计算公式如下:血酸( Vc，纯度99. 7% ，江苏强盛功能化学股份有 限公司) ; 无水碳酸钠( A，上海虹光化工厂) ; 六 水合氯化铁、七水合硫酸亚铁( A，宜兴市展望化 工试剂厂) ; Folin-Ciocalteu 试剂( B) 、甲醇、乙醇、 乙酸乙酯、NaOH、H2 O2( 30% ) 、十二水合磷酸氢二 钠、二水合磷酸二氢钠、六氰合铁( ) 酸钾、1，10-羟基自由基清除率( % ) = ( A2 -A0 ) / ( A1 -A0 ) * 100%式中，A0 为加入 H2 O2 但未加提取物溶液的混 合液吸光度值，A1 为未加入 H2 O2 和提取物溶液的混合液吸光度值，A2 为加入 H2 O2 和提取物溶液 的混合液吸光度值。1. 3. 5过 氧化氢清除活性研究试 管 中 加 入1菲啰啉、四水合钼酸铵、磷酸钠、硫酸( A，国药集40mmolLH2 O2 的缓冲溶液( pH = 7. 4 ) 2mL、提团化学试剂有限公司) 。1. 2仪器与设备KH-100B 超声波清洗器( 昆山禾创超声仪器 有限公司) ; E-5203 旋转蒸发仪( 上海申顺生物 科技有限公司) ; TU-1900 双光束紫外-可见分光光 度计( 北京普析通用仪器有限责任公司) ; TG1650- WS 离心机( 上海卢湘仪离心机仪器有限公司) 。 1. 3实验方法1. 3. 1黄香楝树皮提取物的制备黄香楝树皮 干燥、粉碎，过 60 目筛。称取 4 份黄香楝树皮粉 末各 5. 000g，分别加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水 4 种溶剂 250 mL，在超声仪中 40 下提取 30min，抽 滤，旋蒸浓缩滤液，真空干燥后得粉末状提取物， 用甲醇溶解配制提取物溶液，备用。1. 3. 2总酚含量测定配制 5、10、20、25、30g mL1 没食子酸系列浓度的标准溶液。取标准溶液0. 5mL，加入 10% Folin-Ciocalteu 试剂 2. 5mL，混匀 后放置 6min，再加入 75mgmL1 碳酸钠溶液 2mL， 混匀后在室温下反应 2h，于 760nm 处测吸光度。 以没食子酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到 标 准 曲 线 Y = 0. 013 05X + 0. 192 84 ( 2取物的甲醇溶液 2mL，混匀后，于 210nm 处测定吸光度6。提取物过氧化氢的清除率公式如下:H2 O2 清除率( % ) = 1-( A1 -A2 ) / A0* 100%其中，A0 为 H2 O2 的吸光度值，A1 为提取液与H2 O2 的吸光度值，A2 为提取液的吸光度值。1. 3. 6总还原力测定提取物溶液 2mL、pH =6. 6 的磷酸盐缓冲溶液 2mL 及 1% 的铁氰化钾溶 液 2mL 混合后，50 下水浴 20min，取出后放入冰 箱迅速降温，此时铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾。 再向其中加入 10% 的三氯乙酸溶液 2mL，停止反 应。反应液在离心机中 4 000rmin1 下 离 心 10min。取 上 清 液 2. 5mL，加 入 蒸 馏 水 2. 5mL、0. 1% 氯化铁溶液 0. 5mL，显色生成普鲁士蓝。于700nm 处测吸光度，吸光度值越大表示该物质的 还原能力越强7，8。1. 3. 7总 抗氧化活性测定具塞试管中加入 0. 4mL 提取物溶液和 4mL 磷钼试剂( 0. 6molL1 浓硫酸、28mmolL1 磷酸钠和 4mmolL1 钼酸铵) ， 混合均匀，95 水浴中恒温 90min，抗氧化物将 Mo ( ) 还原成绿色的 Mo( ) 络合物。695nm 处测 吸光度，吸 光度值越大，表示抗氧化物质活性越 9，10= 0. 999 5) 。测定黄香楝树皮提取物溶液的吸光强。度，平行实验 3 次，取平均值，由标准曲线计算可 得提取物中的总酚含量。1. 3. 3DPPH 清除活性研究0. 6mL 提取物溶液 与 3. 0mL 40gmL1 的 DPPH 溶液混合，室温下 黑暗中放置 30min 后，于 517nm 处测吸光 度4。 DPPH 清除率的计算公式如下:DPPH 清除率( % ) = 1-( A1 -A2 ) / A0* 100%式中，A0 为未加提取物溶液的 DPPH 吸光度 值，A1 为加提取物溶液的 DPPH 吸光度值，A2 为 提取物溶液吸光度值。1. 3. 4邻二氮菲法羟基清除活性研究试管中 依次加入 0. 75mmolL1 邻二氮菲溶液 1mL、pH =1. 3. 8 黄香楝乙醇提取物与 Vc 的抗氧化性能对比 以 Vc 作为阳性对照物，配制成水溶液，按照 1. 3. 3 至 1. 3. 5 试验方法，测定 Vc 的 3 种抗氧化 性能指标，并与黄香楝树皮的乙醇提取物对比。2 结果与讨论2. 1 总多酚含量甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水 4 种提取物的总酚 含量依次为 58. 59、50. 47、34. 34、2. 04mgg1 。4 种溶剂所提取的黄香楝树皮提取物的总酚含量差 异较大，其中以甲醇为溶剂时提取物总酚含量最第 4 期江珊，等: 黄香楝树皮提取物的多酚含量及抗氧化研究539高，乙醇、乙酸乙酯及水提取物的总酚含量依次减 少，尤其是水提取物的总酚含量很低，这与酚类化 合物在水中微溶的性质吻合。2. 2 DPPH 自由基清除活性黄香楝树皮提取物的 DPPH 清除率如图 1 所 示。4 种溶剂提取所得的提取物随溶液浓度的升 高，对 DPPH 的清除活性增大，其中甲醇提取物和 乙醇提取物的 DPPH 清除活性较大，且清除率比 较接近，当提取物质量浓度大于 0. 6mgmL1 时， 清除率均达到 91% 以上，这与提取物中酚类活性 物含量相对较高有关。乙酸乙酯提取物、水提取 物的 DPPH 清除率小于前两者，显示出与总酚含 量的相关性，但水提取物的 DPPH 清除活性降低 与其总酚含量的减少并不成正比关系，因此，可认 为水提取物中可能存在其他非酚类抗氧化成分， 如还原性糖等。此外，由图 1 可得，甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水提取物对 DPPH 清除的 IC50 值依次为0. 19、0. 23、0. 40、0. 56mgmL1 。图 1 黄香楝树皮提取物的 DPPH 清除活性 Fig. 1 The DPPH scavenging activity of the bark extracts of hesperethusa crenulata2. 3 羟基自由基清除活性羟基自由基( OH) 是体内最活泼、进攻性最 强的活性氧，人体在生命活动中通过新陈代谢即 可产生，它能引起膜过氧化、蛋白质交联变性、核 酸损伤等，从而导致病变，其危害很大。因此，清 除过量的OH 对机体的健康尤为重要。由图 2 可 知，黄香楝树皮的甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取物均 有较好的清 除OH 活性，在 质量浓度为 1. 0mg mL1 时，乙醇提取物OH 清除率达98% ，甲醇及乙 酸乙酯提取物OH 清除率均达到88% 以上。水提 取物OH 清除率较低，随质量浓度的升高，清除率 变化不大，推测原因在于其中总酚含量大大低于 前三者，尽管提取物的质量浓度有所提高，但酚类 活性物的浓度依然很低，因而导致清除率偏低。 由图 2 所得，甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取物对OH1图 2 黄香楝树皮提取物的羟基自由基清除活性 Fig. 2 The hydroxyl radical scavenging activity of the bark extracts of hesperethusa crenulata2. 4过氧化氢清除活性如图 3 所示，4 种溶剂提取所得的黄香楝树皮 提取物中，以甲醇、乙醇提取物的过氧化氢清除活 性为优，当提取物质量浓度为 200gmL1 时，清除 率达 99% 以上; 乙酸乙酯提取物的活性次之，提取 物浓度为 200gmL1 时，清除率为 89% ; 水提取 物活性最小，但清除率也随提取物浓度的上升有 明显提高，说明其中起过氧化氢清除作用的活性 成分除酚类化合物外，还存在其他抗氧化性成分。由图 3 可得，甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水提取物对 过氧化氢清除的 IC50 值依次为 72. 7、60. 1、83. 4、153. 7gmL1 。图 3 黄香楝树皮提取物的过氧化氢清除活性Fig. 3 The hydrogen peroxide scavenging activity of the bark extracts of the hesperethusa crenulata2. 5总还原力如图 4，总还原力随着提取物浓度的升高而增 大。总还原力以甲醇提取物为最优，乙酸乙酯提 取物、乙醇提取物次之，水提取物较差。总还原力 与提取物中多酚含量不成相关关系，与 2. 2 中结 果相似，推测其原因仍是提取物中存在其他非酚 类抗氧化性成分。当浓度为 100gmL1 时，提取 物总还原力实验的吸光度依次为 0. 519、0. 472、 0. 464、0. 337，虽然甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取物的 总还原力数据不同，但差异不大。清除的 IC50 值依次为 0. 60、0. 56、0. 71mgmL 。图 4 黄香楝树皮四种提取物总还原力 Fig. 4 The reducing power of the bark extracts of hesperethusa crenulata2. 6总抗氧化活性黄香楝树皮提取物的总抗氧化能力如图 5 所 示。4 种提取物的总抗氧化能力从大到小的顺序 为: 乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇提取物、水 提取物; 在浓度为 300gmL1 时，4 种提取物的总 抗氧 化 实 验 的吸光度值依次为 0. 260、0. 252、 0. 220、0. 199。总抗氧化能力的大小顺序与总酚 含量的多少不一致，表明不同提取物中所含抗氧 化成分存在差异，与氧化物的反应也不相同，但总 体具有明显的抗氧化能力。2. 7黄香楝乙醇提取物与 Vc 抗氧化性能对比DPPH234. 211. 817. 0羟基自由基555. 228. 065. 0过氧化氢60. 13. 01 156. 5黄香楝树皮的甲醇、乙醇提取物中总酚含量物中酚类化合物对 DPPH、OH、H2 O2 清除的 IC50 值分 别 为 11. 8、28. 0、3. 0gmL1 ，低 于 Vc 的 17. 0、65. 0、115 6. 5gmL1 。但从上述抗氧化实 验结果可知，各溶剂提取物的抗氧化性能与其多 酚含量并不完全成相关关系，所以提取物中存在 的其他抗氧化成分有待进一步研究。总体而言， 黄香楝树皮中多酚粗提物具有较强抗氧化活性， 能够作为一种有潜力的新型天然抗氧化剂。图 5 黄香楝树皮提取物总抗氧化能力 Fig. 5 The total antioxidant activity of the bark extracts of hesperethusa crenulata表 1 黄香楝树皮乙醇提取物与 Vc 对抗氧化性能的 IC50 值Table1 The IC50 of antioxidant capacity of the bark ethanol extract of hesperethusa crenulata and Vc 乙醇提取物 提取物中的总酚Vc抗氧化指标比较接近，且两者的抗氧化性能相当，因此选择毒 性较小的乙醇为溶剂的提取物，与阳性对照 Vc 进行抗氧化性能 IC50 值的对比 ( 见表 1 ) 。结果表 明，黄香楝树皮的乙醇提取物对氧化物的 IC50 值均高于 Vc，若以提取物中的总酚含量计算，则提取参考文献:gmL1gmL1gmL11Sakulna Wangthong，Tanapat Palaga，Sirirat engpipat，et al Biological activities and safety of Thanaka ( Hespere-thusa crenulata) stem barkJ J Ethnopharmacol，2010，132: 466-4722来吉祥，何聪芬，董银卯 皮肤衰老机理和抗衰老化妆 品的研究进展J 北京日化，2009，3: 11-183谭榀新，叶涛，刘湘新，等 植物提取物抗氧化成分及机 理研究进展J 食品科学，2010，31( 15) : 288-2924 Snchez-Vioque，M F odrguez-Conde，J V eina-