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病毒学实验技术实验一 鸡胚接种器材：鸡胚 打孔器 注射器 针头 照蛋灯 蛋座 病毒液 石蜡 碘酊棉球 酒精棉球鸡胚孵化病毒接种（NDV、EDS76、IBV效价测定（HA、HI）一精卵的选择、孵育和检卵1. 受精卵的选择1） 最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响2） 最好是白克蛋3） 受精卵必须新鲜，保存在520不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。2. 孵育1） 孵箱温度保持37.538.52） 相对湿度：50-60%3） 保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后4） 孵育后第三天开始，每天翻卵一次3. 检卵孵育后第4天开始，每天检卵一次。4日卵可见血管。未受精卵不见血管鸡胚。死胚血管模糊，无胎动。二鸡胚的结构1卵壳 上有细孔，以行气体交换2壳膜 行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流3气室 呼吸和调节压力4绒毛尿囊腔 胚胎呼吸器官，膜血管O2卵壳孔交换5尿囊腔 胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。6羊膜腔 胚胎浸泡于其中羊水7卵黄 早期养分8卵白 晚期养分三接种前处理1做接种记号2消毒四接种途径 卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体1卵黄囊接种法 虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下 2）碘及酒精消毒气室端 3）钢锥在气室中央锥一小孔 4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚 5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚方法二：1）2）同一 3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒 4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚 5）封孔，续孵，弃24h内死胚2绒毛尿囊膜接种法 痘病毒和疱疹病毒分离和增殖方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒 2）在气室端开 一1.51.5口 3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物 5）胶布或透明纸封口方法二：（人工气室）1） 在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈2） 消毒，刀撬起卵壳造成卵窗3） 在气室端中央钻一个小孔4） 用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出5） 橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗6） 用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上7） 胶布或透明纸封口，熔蜡封孔8） 鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上3尿囊腔接种法 用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖1） 选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒2） 钢锥锥一小孔3） 注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚4） 熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒实验二 原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）器材：鸡胚 碘酊棉球，酒精棉球 照蛋灯 蛋座 大剪子 眼科剪 镊子 平皿 培养基 胰酶 水浴锅 大青霉素瓶 吸管 吸球 细胞瓶 瓶塞一实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途二实验步骤：1. 取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒2. 无菌夹起鸡胚置于无菌平皿3. 眼科剪镊去头、四肢及内脏，HankS洗液两次4. 剪碎近于乳糜状5. 将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，HankS两次，然后加入4倍量的（5ml）0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO3 5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37水浴20-30分钟，期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）6. 消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的HankS液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用7. 加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中8. 平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml HankS液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。使细胞量约为50万个/ml，再补加HankS生长液至10ml，37培养实验三 传代细胞培养（传代细胞=遗传突变/理化学物质作用/致瘤病毒作用=异倍体癌变细胞；多来自动物或人的肿瘤组织及部分来自突变的正常细胞。成长旺盛，繁殖快速，但易遭支原体和病毒污染细胞源性/非-细胞源性如毒种、血清、胰酶、操作人员口鼻手等）一、 试剂1细胞分散剂：0.25%胰酶，250ML装，4保存胰酶 2.5gNaCl 8.0gKCL 0.2gNa2HPO412H20 2.89gKH2PO4 0.2g加ddH20至 1000ml加压过滤除菌，分装于小瓶备用。（细胞消化液：将胰酶2.5g、NaCl 80.0g、KCL 4.0g、葡萄糖10.0g、NaHCO3 5.8g依次溶于900.0ml ddH2O中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，过滤除菌，分装后置-20保存备用）2培养基DMEM培养液 ：1袋DMEM干粉溶于950ml ddH2O中，加入3.7g NaHCO3，用1mol/l HCL调PH值至6.8-7.0，定容至1000ml，0.22m滤膜过滤除菌，室温保存备用。生长液：含10%犊牛血清的DMEM培养液（可室温保存）。（细胞生长液：在DMEM培养液中加入10%的新生牛血清，100IU/mL青霉素、100g/ml链霉素，4保存备用）3双抗：母液20000u（ug）/ml，用量：500ml DMEM 加入5ml，可4保存。4血清：500ML装，用前在56水浴灭活30MIN，每500MLDMEM加入50ML。5器材：吸管（5、10ml）、细胞瓶、胶塞（含盐水瓶塞）、吸球、75%酒精棉球等。二操作步骤1. 先配置生长液（500ml DMEM加入50ml血清和5ml双抗，混匀）2. 取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液，可用适量生长液冲洗。3. 吸弃，加入3-4ml胰酶/10ml 细胞浸没细胞层，亦可先洗涤细胞层后弃之），于37培养箱放置几分钟或室温3-5min（PK-15）（7-8min，Marc-145），镜下观察至细胞间出现空隙或稍松动或稍变圆或稍拉网（PK-15）或细胞变圆（Marc-145）后，尽弃胰酶消化液（注意：时间要掌握好，勿消化过头，如拉网状或脱落）。4. 加入生长液（约6-7-9ml/10ml瓶），反复吹打几次，（先正面吹打，在反面吹打）使细胞分散成游离单个细胞（镜检，细胞呈单个，成双、3-4个团块即可），然后分装于3个小瓶中（PK-15），补足生长液至10ml（或吹散成单个细胞后，加入3个细胞瓶所需生长液30ML再分装，10ml/瓶，要利用原瓶，其生长较好），37培养箱培养1-2天即可长成单层。如是分装6孔细胞板，每孔加入3-4ml，用吸管抽吸一下孔内细胞悬液使之均匀不成团生长。24孔板，1ml/孔。96孔板，一般将病毒与细胞同时接入，详见毒价测定法。细胞长好后，接毒前可用维持液洗涤并吸弃。接毒量根据病毒浓度而定，一般100-200ul/孔，吸附45-60min，然后加入维持液。37培养30-40h（PRV），观察CPE，出现70-80%CPE时可收获，不论如何，病毒于40h前收获，以免病毒释放到细胞外。对于污染孔，小心吸弃，加入适量双抗，首次作冲洗，二次作抗菌。对可能污染孔，加入适量双抗如10ul/24孔。细胞板的处理：胰酶处理自来水冲净用镊子夹棉球擦洗掉上面的细胞残留物浸泡酸液过夜自来水冲洗用双蒸水洗涤控干将细胞板和板盖正象平铺于干净或消毒过的报纸紫外灯下照射消毒杀菌过夜次日将盖合上用下面的报纸包好近期使用。 常用传代细胞：1IBRS-2（仔猪肾上皮传代细胞株）；2Vero（非洲绿猴肾细胞）；3Marc-145（MA-104进一步克隆而来）；4BHK-21（乳仓鼠上皮传代细胞株）；5.MDCK（犬肾上皮细胞）；6.F81（猫肾细胞）；7.PK-15（仔猪肾上皮传代细胞株）；8.Hela（人子宫颈癌细胞）；9.PAM（肺泡巨嗜细胞）；10.CL2621（猴肾细胞系） 实验四 细胞的冻存与复苏器材：吸球 离心管 细胞吸管 胰酶 血清 二甲基亚砜 细胞冻存管一细胞的冻存（缓慢的冰冻和迅速的融解）1细胞冻存液A液：含40%血清的DMEN培养液B液：含20%二甲基亚砜（DMSO，低温保护剂）的DMEN培养液2操作：取刚长满单层的细胞，加入胰酶消化后，用DMEN培养液吹散后装入离心管中，500-3000r/min 5-10min，用适量的A液悬浮，再加入等体积的B液，分装于细胞冻存管中，置4或液氮气相中，按5min 1cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存。或：配制含10%DMSO和20%血清的DMEN培养液，按10ml细胞瓶制备1-2个冻存管计，一般配制10ml，取刚长满单层的细胞，加入胰酶消化后，先加入生长液终止胰酶作用，去掉首瓶生长液，加入冻存液吹散后，移入第二瓶吹打，依此类推，处理完所有细胞瓶，分装于细胞冻存管中，1.8ml/管，置-40过夜或置液氮中长期保存。二细胞的复苏将冻存于液氮中的细胞取出，迅速置于37-40左右水浴中，并不停地摇动，使其快速解冻融解（40-60秒内），然后加入10倍量营养液后，500r/min离心10min，去掉上层冻存保护液，用生长液悬浮（由10ml细胞培养物制成的冷冻细胞，在融解和离心沉淀后可再悬浮于10ml营养液中），再置于细胞瓶中培养（可预先用成长液洗涤一下）。或不离心直接转移到细胞培养瓶中，每毫升细胞悬液加入10倍量预热至37的培养液（血清量可提高至10-15%）。等其贴壁几小时后（4-12小时，一般6小时左右贴壁），再换入新的生长液继续培养至长成单层后换液，并考虑传代。附：细胞室温保存：将已长成单层的细胞于换液后（维持液含血清5-10%），置室温或20-22避光保存，一般可保持细胞的生活力达半个月以上（但BHK-21最多能保存7天左右）。不宜在4保存，因4保存易发生退化，并较快从培养瓶壁脱落；继续传代培养时，细胞活力也明显降低。三细胞的保存：1细胞培养物的常温短期保存1）实验室中细胞短期保存 将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22下避光保存，可达15天以上。 将细胞培养温度由37降至32甚至30，可隔15-30天传代一次。2）长途运送细胞培养物的保存取刚刚长成单层的细胞培养物，弃去营养液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留空气，随后用橡皮塞紧瓶口，并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15-25左右，到达目的地后，置37培养一天，再行传代。2细胞培养物的长期保存将刚长满单层的细胞，按细胞传代方法消化吹散后，装入离心管中，1500-3000rpm 5-10min，用适量含有20%犊牛血清、10%二甲亚砜的DMEM悬浮，分装于细胞冻存管中，置4 2h，-20 2h，-70过夜，然后置于液氮中长期保存。或置于液氮气相中按5min 1cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存。实验五 病毒在细胞中的的培养1. 取长满单层的细胞一瓶（100ml），倒去培养液。加入适量液冲洗并吸弃。2. 加入2ml的病毒液，使铺满细胞单层，37感作45-60min3. 取出，加入维持液至10ml，然后再置37培养箱培养4. 待75-85%以上细胞出现病变时，收毒（一般于40h前收毒，以免病毒释放出细胞外）实验六 病毒感染力（TCID50）的测定器材：细胞 胰酶 培养基 吸管 吸球 96孔细胞培养板 移液器 吸头 青霉素瓶 一实验步骤1. 在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-102. 将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100UL3. 然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3*105个/ml4. 设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排5. 逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天6. 结果的计算，按Reed-Muench两氏法或KABER法进行二计算方法1Reed-Muench两氏法病毒液稀释度出现CPE孔数未出现CPE孔数累计出现CPE孔 所占的%出现CPE孔数 未出现CPE孔数10-18 87310 001578 270100（27/27）10-2190100（19/19）10-311191.6（11/12）10-44640（4/10）10-51130.7（1/14）10-60210（0/21）距离比例= 高于50%病变率的%-50% = 91.6-50 0.8高于50%病变率的%-低于50%病变率的% 91.6-40IgTCID50=距离比例*稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8（-1）+（-3）=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml （10-4.8/ml）2Karber法病毒稀释度 出现CPE孔的比率 10-1 8/8=1 10-2 8/8=1 10-3 7/8=0.875 10-4 3/8=0.375 10-5 1/8=0.125 10-6 0/8=0IgTCID50=L-d（s-0.5）L=最高稀释度的对数；D=稀释度对数之间的差；S=阳性孔比率总和IgTCID50=-1-（-1）（3.375-0.5）=-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml实验七 中和实验（固定病毒稀释血清法）器材：细胞 胰酶 培养基 吸管 吸球 96孔细胞培养板 移液器 吸头 青霉素瓶 病毒液 被检血清 标准阳性（阴性）血清一原理 动物感染病毒后，体内能产生抗病毒抗体，抗体能与病毒粒子特异性的结合，使病毒丧失感染力。二步骤1. 将测好TCID50病毒稀释成200个TCID50病毒悬液2. 在96孔微量培养板中将灭活作连续倍比稀释（在96孔微量培养板中先加入50ul的生长液，再加入50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此直至（1256）每个稀释度作4孔3. 在上述各孔中加入50ul稀释好的200个TCID50D的病毒悬液，混匀后放入375%CO2培养箱中作用45-60MIN4. 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照（0.2 TCID50，2 TCID50，20 TCID50，200 TCID50）和正常细胞对照5. 感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放入375%CO2培养箱中培养，逐日观察并记录结果6. 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Kaber法进行三、计算方法 Reed-Muench 两氏法血清稀释度 CPE孔数 无CPE孔数 累计 CPE孔数 无CPE孔数 保护率（%）14（10-0.6） 0 4 0 9 100116（10-1.2） 1 3 1 5 83164（10-1.8） 2 2 3 2 401256（10-2.4） 4 0 7 0 011024（10-3.0） 4 0 11 0 0距离比例= 高于50%保护率的%-50% =83-50/83-40=0.7高于50%保护率的%-低于50%保护率的%高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比率*稀释系数的对数=-1.2+0.7（-0.6）=-1.66 -1.66的反对数=1/46即：146稀释的待检血清可保护50%的组织培养免于CPE。用途：中和实验用于1. 疾病诊断2. 病毒分离株的鉴定3. 不同病毒分离株的抗原关系研究4. 疫苗免疫原性的评价5. 免疫血清的质量评价6. 测定实验动物血清中抗体的存在例：PRV中和实验1. 材料准备 0.25%胰酶、BHK-21细胞、微量移液器、96孔细胞培养板、CO2培养箱，倒置显微镜2. 操作步骤2.1 TCID50测定2.1.1 病毒培养和收获PRV接种于长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养液的10%，37培养，待出现CPE后，冻融，收获病毒2.1.2 病毒的测定DEME 10倍稀释病毒，每个稀释度取100ul加入96孔细胞培养板中然后加入经0.25%胰酶的BHK-21细胞100ul（细胞含量以105/ml左右为宜），每个稀释度作8个重复，设空白细胞对照。375%CO2培养箱中1.1.3 TCID50测定 逐日观察CPE，并记录CPE孔数，直到对照细胞老化脱落为止，按Reed-Muench法计算2.2中和实验将无菌采集的待检血清56水浴灭活30min，用DMEM作倍比稀释，在96孔微量培养板中先加入50ul的生长液，再在第一孔加入待检血清50UL，吸50UL至下一孔，如此直至（1：256）每个稀释度作2-4重复。在上述各孔中加入50ul稀释好多200个TCID50的病毒悬液，混匀后放入375%CO2培养箱中作用1小时，同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常对照，感作完成后每孔加入经0.25%胰酶消化的BHK-21细胞悬液，放375%CO2培养箱中培养，逐日观察并记录结果2.3计算抗体中和效价 逐日观察CPE，并记录CPE孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按Reed-Muench 法计算抗体中和效价。如抗体中和效价为12及12以上，则判为PRV抗体阳性。例：微量中和实验 （改良法）首先在MARC-145细胞上增殖病毒，并测定其TCID50值，分离被检血清，56灭活30MIN后在96孔细胞培养板中将血清作连续倍比稀释，从12到1256，每个稀释度作4个重复，每孔50.0l ，375%CO2培养箱中作用1h，再于每孔中滴加2-5105个/ml的Marc-145细胞悬液100.0l，轻轻摇匀后，放回培养箱中继续培养4-6天，观察细胞病变情况，按Reed-Muench两氏法计算被检血清中抗PRRSV的特异性中和抗体的滴度。同时设有血清毒性对照，标准阴、阳性血清对照以及病毒和正常细胞对照。鸡胚孵化鸡胚成纤维细胞制备病毒接种（PRV）TCID50中和实验测血清效价实验八 乳胶凝集实验一乳胶的处理（一）乳胶的预处理1将10%空白乳胶轻轻摇匀，吸取2ml于试管内，加PBS 8ml使乳胶浓度为2%2在2%空白乳胶内加入10%胰蛋白酶1.1ml，充分混合均匀，置56水浴18h，其间摇动5-6次，使其作用完全。3取出乳胶，4保存备用（二）乳胶的致敏1吸取经预处理的2%空白乳胶9.6ml于小玻璃瓶内2用微量移液管吸取150ul 40倍浓缩的PRV-Ag溶液滴加到盛有等量（9.6ml）2%空白乳胶的小玻璃瓶内，边滴边摇动，使其充分混合均匀，置37作用15-30min或室温2h，即为乳胶抗原。可分装于小离心管，4保存备用，切勿冻结二、乳胶凝集实验操作方法1定性实验用微量移液器吸取待检材料、阳性血清、阴性血清各20（约1滴）分别滴于载玻片不同位置上，然后在各液滴旁加量（20ul）乳胶抗原（如乳胶抗原出现分层，轻摇匀即可使用），用牙签将其搅匀，摇动载玻片1-2min，3-5min内观察结果，但有些弱阳性反应者需在20min时再观察一次，如不凝集，判为阴性。如待检材料为新鲜血液，为防止血液凝固，应先滴加乳胶抗原于载玻片上，然后吸取血液与乳胶抗原迅速混匀，摇动玻片观察结果如待检材料为乳汁，最好先离心，去沉淀，吸取上清作LAT检测2定量实验先将血清在微量反应板或小试管内做倍比稀释，吸取各稀释度血清1滴（约20ul）于载玻片上，各滴加等量（20ul）乳胶抗原于一旁，如上述方法进行，判定，以出现“+”以上凝集者为阳性+ 全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边沿，液滴完全透明+ 大部分乳胶凝集，颗粒明显，液滴稍浑浊+ 约50%乳胶凝集，但颗粒较浑浊+ 有少许凝集，液体仍浑浊 乳胶致敏（PRV）乳胶凝集实验测血清效价并与中和效价进行比较实验九 HA、HI实验器材：血凝板 吸头 青霉素瓶 吸管 吸球 红细胞 离心管一蚀斑技术V蚀斑，即空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒作10倍连续的倍比稀释，随后各取定量，接种于已长成的单层的敏感细胞上，并覆盖一层固体介质中性红琼脂糖，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能感染和破坏附近的细胞。经过几个增殖周期后，形成肉眼可见的变性细胞内即蚀斑后计数，即可计算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位用途：1）病毒纯化（克隆）；2）测定病毒悬液中感染病毒的含量（蚀斑减数实验）；3）检测不产生CPE的病毒，因有的在一般单层细胞上不形成CPE，但可以在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。二蚀斑减数实验将病毒正常血清混合物以及病毒待检血清混合物分别接种到单层的敏感细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基维数，进行蚀斑测定，比较病毒正常血清组以及病毒待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以实验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定的依据，血清稀释度就是其蚀斑减数实验效价。三交叉保护实验先将实验动物进行主动或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检病毒的种类或类型。但周期长，需大量实验动物。应用：用已知病毒/已知血清鉴定未知血清（未知病毒）/未知病毒。实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系、以及适宜的接种途径和剂量。用途：1）分离病毒，并借助干扰那范围实验鉴定病毒2）培养病毒，制造抗原和疫苗3）测定各毒株之间的抗原关系（中和实验和交互保护实验）4）制备高免血清和单克隆抗体5）作V感染的实验研究，包括V毒力测定、建立病毒病模型动物病毒的分离和鉴定：（方法途径）细胞病变；电镜观察；TCID50测定；中和实验；免疫荧光实验；对理化学因子的敏感性；核酸类型测定；PCR；核酸杂交；动物实验。病毒材料的准备1. 脑、肝、肌肉等器官或组织充分研磨后加入5倍量的HankS液（含P.S各200/ml），冻融3次，2000rpm 10min，取上清作接种物2. 鼻液、乳汁、浓汁等分泌物或渗出物：HankS液（含P.S）各100/ml）稀释3-5倍，混匀后，4感作2-4h或过夜，2000rpm 10min取上清作接种物。3. 咽喉拭子或鼻拭子：冻融3次，收集液体部分，用棉拭子查擦拭咽喉部，速泡入盛有2-5mlHankS液（含P.S各200-500ul/ml）试管内，涮洗之，2000rpm 10min，取上清作接种物4. 粪便：HankS（含P.S 各100ml）液稀释10-20倍，4感作2-4h，2000rpm 10min，取上清作接种物5. 无菌的体液或鸡胚：直接接种用接种方法1、 实验动物2、 鸡胚 正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、脑炎病毒及禽类V3、 细胞培养病毒增殖的判定1、 CPE2、 抗原的测定3、 中和试验4、 病毒间的干扰现象（乙脑V和脊髓灰质炎V，流感V和西方马脑炎V，TGEV和牛病毒性黏膜V）5、 EM观察6、 实验动物或鸡胚接种病毒理化学特性的测定1毒核酸型的测定原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ul/ml。2脂溶剂敏感试验1）、乙醚敏感试验取同批病毒分状分装于两个青霉素瓶中，16ml/瓶，1瓶加入麻醉用乙醚至终浓度为20%，橡皮塞紧，424h，期间不时摇动，2000rpm 20min。用毛细管吸取病毒液至另一个小瓶内，适当吹打使残余*醚挥发尽，然后测定两组病毒的TCID50 。2）、氯仿敏感性试验向病毒液内加入分析纯氯仿，浓度为4.8%，4震荡混合10min。然后500rpm 5min，吸取上层液体，滴定病毒TCID50。对照组病毒加入终浓度为4.8%的生理盐水，同样自理和滴定。3）胰蛋白酶敏感试验脊髓灰质炎病毒、TGEV抵抗胰酶，痘病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒易被胰酶灭活。取病毒液两瓶，每瓶，其中1瓶加入1%的trypsin至终浓度为0.5%，加一瓶加入1ml培养基，橡皮塞紧瓶口，倒转混合，371h，随即加入灭活血清8ml，混匀，终止胰酶的作用。测定两瓶的TCID50。4）耐酸性试验PH3.0 2h或PH5.0 1h取等量病毒液两瓶，用0.1MHCL将1瓶病毒液调PH值3.0/5.0，另1瓶加入等量培养基做对照，372h/1h，再用5.6%NaHCO3调PH值回7.2左右，对照组加入等量的培养基，测定两瓶的TCID50。5）耐热性试验将病毒液分成等量的11个小瓶，其中4瓶分别置50、60、70、80水浴1h，另6瓶置50水浴分别感作5、10、15、30、60和180min，然后测定病毒的感染力6）病毒粒子大小测定1）EM（透射EM、鳞钨酸负染） 2）超速离心 3）滤过试验例：PRV的分离鉴定1材料准备DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青链霉素溶液、微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。2操作步骤2.1病料的采集 对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾、脑，尤其三叉神经节、嗅球，4送检2.2样品处理 于灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃沙研磨，用生理盐水或DMEM 15稀释，-70反复冻融，3000rpm 30min，取上清经0.22um微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至终浓度为100u/ml，-70保存作为接种材料2.3病料接种 将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，吸附后，加入含新生犊牛血清（经过56水浴灭活30min，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，37温箱培养。2.4观察结果 接种后24-48小时，BHK-21细胞应出现典型CPE，表现为细胞变圆、脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传3代，如仍无CPE，则判为PRV阴性。2.5病毒的鉴定 将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用PCR、荧光抗体试验等两种方法中的任一种方法作进一步鉴定。ELISA1） 间接法：检测Ab。用Ag包被板子+Ab（未知）+抗Ab+酶底物显色2） 双抗体夹心法：检测Ag。用Ab（已知）包被板子+Ag(未知)+抗Ab+酶底物显色操作步骤1.预备试验：确定酶结合物、包被抗原/抗体的最适浓度，底物的最适反应时间2.包被（载体、包被液ph9.5-9.6、吸附4过夜/371-5h、Pr浓度）3.洗涤4.封闭1%-3%牛血清白蛋白，3%-5%脱脂奶，10%牛/马血清5.判定 目色比色-定性，光电比色-P/N2.0为阳性例：猪瘟病毒强毒强弱毒鉴别诊断ELISA/PRV-ELISA（间接法）1、材料准备：抗原、酶标抗体、底物（OPD-H2O2）、酶联检测仪2、操作步骤2.1包被：将PPV抗原加入酶标板孔内，每孔100ul，37作用1h后置4冰箱过夜2.2洗涤：弃去孔内液体，用洗涤夜洗3次，每次3分钟，用吸水纸拍干2.3封闭：各孔加入封闭液100ul。371h按2.22.4加入待检血清：待检血清经56 30分钟灭活后用洗涤液稀，每孔加入100ul，37 1h重复2.22.5加入酶标抗体：用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100ul，37 1h，重复2.22.6加入底物（OPD-H2O2）：每孔100ul室温避光显色25分钟2.7终止反应：每孔加50ul终止液反应终止反应 2.8测定OD值：在上酶联检测仪490nm波长处读数2.9血清阴阳性判定标准的确定取60份经中和实验检测为PRV抗体阴性的猪血清，按120稀释后作间接ELESA实验，测定490nm波长处OD值，规定以60 份血清的平均OD值加上3倍标准差作为判定阴阳性的临界值IFA将分离毒第5代毒接种于Marc-145，培养，培养48h，冷丙酮固定10min，分别加入120的PRRSVHCV、PPVPRV高免血清，PRRSV阴性血清，371h，0.01mPH7.2 PBS洗涤3次，再加入140莹光标记兔抗猪IgG，37 1h,0.01m PH7.2PBS洗涤3次，甩干，荧光显微镜下观察。设PRRSV美洲株和未接毒细胞对照病毒的粗提纯浓缩（中性盐沉淀法）（以伪狂犬病病毒为例）原理：病毒在45%以上饱和的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。一实验步骤：将病毒液反复冻融3次按42.5g硫酸铵/100ml病毒液的量加入硫酸铵，于4 冰箱搅拌沉淀过夜离心沉淀弃上清用适量的水或（PBS）悬浮装透析袋透析以除去硫酸铵-再浓缩到原液的40倍。1病毒材料：将伪狂犬病病毒接种于BHK-21细胞，病变后收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材料。2病毒提纯浓缩先将细胞培养物3000rpm离心30min(4)，弃去细胞碎片及杂质，收集上清夜，按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入硫酸铵，搅匀后置4冰箱搅拌沉淀过夜。然后5000rpm离心40min（4），去上清，沉淀用适量的灭菌ddH2O悬浮（如原体积的20%），装与透析袋中，于ddH2O中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次，第5次透析过夜，透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病毒浓缩至原体积的1/40，即得初步提纯的病毒液。分子病毒实验技术一PCR(一)PCR步骤：1） 变性 加热至90-95，氢键断裂，双链解离成单链。2） 复性 降温至42-55-62，使引物与其互补的摸板在局部形成杂交DNA双链。3） 延伸 72，在DNA聚合酶、4种dNTP、Mg+2存在条件下，引物延长，新链合成。（二）几种PCR摸板的处理方法1）细菌：挑细菌于离心管中，加适量ddH2O，涡悬，于沸水浴中变性10min（电炉，饭盒，带孔泡沫块）速置冰浴中，12000rpm 离心数秒，取上清作模板。或取细菌培养液200ul，12000rpm 2min去上清，加80-100ul水悬浮，于沸水浴中变性10min，迅速置冰浴中，12000rpm离心数秒，取上清作模板。2）细胞培养物：收集病变细胞（勿冻融）悬液，10000rpm离心数秒，取细胞沉淀用适量sample Buffer 悬浮(也可用472.5 ulTEN或生理盐水悬浮，后同病料处理)，加入蛋白酶K至终浓度为100ug/ml，371h，取出于沸水浴中变性10min，迅速置冰浴中，3000rpm离心数秒，取上清作模板。 Sample Buffer 终浓度KCL 50mM Tris-HCl(PH9.0) 10mM 明胶 0.01%Triton x-100 0.1%NP-40 0.45%Tween 20 0.45%3) 质粒、病毒基因组DNA 沸水浴中变性10min，迅速置冰浴变性10min,迅速置冰浴中备用4） 料与鼻拭子（1） 匀浆器将病料组组织充分匀浆，用TEN缓冲液/生理盐水按1:5稀释（2） 收集悬液于离心管内，-20冻融3次（3） 5000rpm5min（4） 取472.5ul上清液于另一离心管内，加入25ul的10%SDS（终浓度为0.5%，破外细胞组分）和2.5ul20mg/ml蛋白酶K（终浓度为100ug/ml，消化去掉蛋白质，尤其是与DNA给合的组蛋白），混匀。（5） 50水浴过液（6） 用等体积（500ul）的苯酚：异戊醇、苯酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇名抽提一次（去掉蛋白质和细胞膜组分）(7) 吸取上清，加倍量 无水乙醇、0.1倍的3M NaAc于-20沉淀30min，10000rpm 10min,（8） 沉淀用70%洗一次，真空干，用20ul ddH2O溶解，-20保存备用注：快速简便的方法：检测样品可为纯化DNA，亦可为细胞、组织、任何含病毒的样品。一般无须提取DAN,直接取少量样品（少于10ul）,高温低渗液体（如水煮沸变性10分钟后）溶解细胞制备摸板进行PCR。（三）病料中RNA提取1）取样品（病料上清和鸡胚液）125-250-200ul/样，加入375-750-400ulRNA 提取裂解剂（TRIZO）(13)RNA ex Reagant Ls。混匀，涡悬，静置5-10min。2）加入氯仿100-200-200ul（51），手摇颠倒混匀，涡悬静置5-10min。12000r/min离心10-12min。3）取上清（先调枪为100ul，共取得300-600ul）,加入等两量的冰冻的异丙醇（吸去取异丙醇时平移枪头哦，以免枪头滴液），震荡，混匀，室温5-10min 或-2030min(梢长无妨，如过夜)。置室温溶解，412000r/min 10-12min,弃上清，吸干管口余液。4）加入适量冰冻75%乙醇或1ml 75% DEPC 水处理乙醇（750ml 无水乙醇+250DEPC水）洗涤，47500-12000r/min 6-10min,弃上清。放置于平铺的一张洁净纸上，置超净台风干（约10-20min）.5）加入10-15-20ul的nuclease-free water 即DEPC水/(15ulTE PH8.0) /样品，于38-56水浴溶解约10min。（最佳-70保存）.抽吸混匀,进行下一步实验如RT-PCR。Rnase:无处不在（如人是皮肤，故需作戴手套）及难于灭活（高压灭菌和蛋白抑制剂不能使所有的RNA完全失活）。氯仿擦拭处理的用具，通常可消除Rnase的活性。注意：PCR产物电泳中在目标带前可可能出现引物二聚体的带，而提质粒电泳在目标带前可能出现RNA带。准备物品：枪头（200UL/1000UL）、枪（200UL/1000UL）、RNA抽提试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（用无水乙醇配制如750ML无水乙醇+250DEPC水）等。PCR 模板的组成，欲扩增片段的长度及其不同的使用目的，对引物的要求是不一样的；基因组DNA作模板时，由于其数量的膨大及结构复杂，除特异扩增外，易产生非特异扩增产物。总原则：提高扩增效力和特异性。（四）引物1据DNA（DNA-V）或CDNA（RNA-V）的已发表的相关序列（病毒独特的基因区域）来设计2如为诊断用PCR，直接设计即可。3如要酶切鉴定及克隆PCR产物，加入保护碱基和酶切位点5端（酶切位点的选择要考虑序列内部自身已有的酶切位点，以免多点切割基因）。4如要将目的序列（PCR产物）进行表达，加入保护碱基和酶切位点，起始子和终止子密码，终止子TAA、TAG、TGA，起始子：ATG5上游引物P1与序列5端序列相同（ATG），下游引物P2与序列3端互补且反向（TTA，CTA，TCA）。例：PRV-EPO基因的克隆表达及序列分析PCR扩增：据国外报道的INFH株EPO基因的核苷酸序列，设计一对能包括EPO基因完整编码区的特异性引物，上、下游引物分别设计了ECOR I和Xba I酶切为点。上游引物P1：5TTTGAATTCACCATGGGCTGCACGGTC3 保护碱基 EcoR I 起始子 与Epo基因的核苷酸序列相同下游引物P2：TTTTCTGAGTCAGTCGTCGTCGTGGGTG3 保护碱基 Xba I 终止子 与Epo基因的核苷酸序列互补且反向EPO序列：5ATG GGCACGGTCCACCCAGGACGACGACTGA （互补且反向）3引物设计原则：1）长度以15-30nt为宜。增加长度并提高退火温度，或选择其他DNA序列合成新的特异引物可提高特异性。2）扩增片段在300-1000bp为宜；RT-PCR以500bp为宜；过短不易检 测，过长不易扩增。优化条件下，可扩增大于10Kb的片段。3）引物碱基组成随机分布，避免嘌呤或嘧啶堆聚现象。G+C含量在45-50%左右为宜；4）引物间尤其3端不应有互补序列（4个碱基以上），以免形成二级结构；5）引物序列必须是被检病毒特异的，在待扩增区域的两边均找出约20 个核苷酸（G+C）含量相近的合适序列。引物的碱基顺序不与非扩增区域有同源性，要求用计算机进行补助检索分析。6）原则上引物3末端碱基与模版DNA一定要配对，3末端碱基不选A（选T、C、G）。5端可不与模版匹配。如PCR产物用于克隆，在5端加上单一的酶切位点。可加错配碱基，造成突变。可加ATG其使密码。最多可游离10个bp。7）退火温度（15-25bp）Tm=4（G+C）+2（A+T），一般1Kb以内，延伸1min足够，多于1Kb，则延长时间，扩增10Kb，延伸15min。不管模版浓度多少，20-30次循环较合理。8）PCR产物bp相差不大，如26bp与71bp，可用较高浓度的琼脂糖18-20g/L电泳分离，效果较好。PCR反应各组分浓度：1）MgCL2：Mg+过多则非特异扩增，过少则扩增效率较低。可预实验确定最佳Mg+浓度，终浓度一般为1-4mmol/L，工作浓度一般为25mmol/L.（3ul）2）引物：终浓度一般为0.1-0.5umol/L（100-500nmol/L），既100pmol或0.5ug（500ng）工作浓度一般为0 umol/L（1ul）。一般将5个OD值（33ug/OD）用400ulddH2O溶解，计算出其浓度，一般用500ul溶解50uM，分装保存。取其一做5倍稀释（一般为10uM）作为工作浓度近期保存使用。3）dNTP：终浓度一般为50-200umol/L工作浓度一般为2mmol/L（1ul）、1.25mmol/L4）TaqE：终浓度一般为2.5U，工作浓度一般为5U/uL（0.5ul）5）变性剂：加入适量者如（二甲亚砜DMSO（50ul jia 2.5ul）、5%甲酰胺、尿素等）可减少模版二级结构提高特异性尤在RT-PCR加入5%甲酰胺提高特异性且cDNA产量大增。5）PCR的条件优化：通过改变退火温度或Mg+浓度来获得真实的扩增结果对于复杂的 混合物，采用另一对嵌套引物可改善其特异性。循环参数：变性温度92-95 ，40-60Sec， 退火温度55 ，30-50Sec， 延伸温度72 ，60-90Sec 循环次数25-40 次注意：PCR有0.3-0.5%（250：1）左右误差，如克隆PCR片段，制备点突变或缺失突变株时，用具校对错误碱基功能的VentDNA聚合酶，合成误差比TaqE：小得多。合成的引物进行PCR反应时无目的带？1）引物和模板是否配对，同源性有多大？2）引物本身是否有立体结构，或两条引物间是形成高次结构？3）PCR试剂/PCR仪是否正常？重新合成引物一试核酸定量：1mg./mldsDNAA260=20； ssDNARNA