胃肠道肿瘤仿真裸的鼠移植瘤模型在新型抗VEG靶向药物评价中的应用研究

胃肠道肿瘤仿真裸鼠移植瘤模型在新型抗VEGF靶向药物评价中的应用研究 胃肠道肿瘤仿真裸鼠移植瘤模型在新型一?抗靶向药物评价中的应用研究一论文作者签名:么笙歪葺鸯指导教师签名:必固论文评阅人:评阅人:评阅人:评阅人:评阅人:答辩委员会主席:教援浙江太堂匡堂院塞茂德委员:呈胜挂教援植州直笈二厶民医院委员:数援逝江省生医院郭 勇委员:巫函川 麴援浙医三院委员:俭盔数援逝匡院委员:呈壶筮教援逝医二院年月答辩日期:竺暮竺蓄竺亳竺盯一竺一亘型薹甜一菱眦一 一一一一一 叫童薹一竺霎叫一薰一掀堕垫皿 .:鱼鱼坌亟曼堑髓:坌丛垒砌 :丛堑坌丛坌卫曼:丛垒:已殴幽丛.: 浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得逝婆盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文储签名:仓舛泡签字醐:加?廿堋彳日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书导师签名:学位论文作者签名:簏研焉签字日期: 日弘、年 弓月签字日期:劲,年月日致谢浙江大学博士学位论文致谢首先,谨以最诚挚的敬意感谢我的导师滕理送教授。他大气、仁厚,勤奋、好学,一直用自己的实际行动诠释着一位优秀外科医师与肿瘤学家所应具备的素质与涵养,传达着我们应该学习的品质。在我三年半的学习和研究过程中,是导师的坚持与激励帮助我树立目标,坚定信念,战胜困难;是导师的不辞辛劳、认真负责指导我完成了学位论文的选题、实验的组织设计、实验中疑难问题的分析解决与论文撰写。这一切我将永远铭记在心,并以此激励我不断前行。衷心感谢浙江大学医学院附属第二医院的曹江教授。他坚定而冷静的科研追求,严谨的治学态度,帮我掠去了心中的浮躁与马虎,养成了追求完美的科研信仰.感谢浙江大学医学院附属第一医院外科实验室、浙江大学医学院附属邵逸夫医院生物治疗研究中心以及浙江中医药大学动物实验中心的各位老师在我实验过程中给予的热情支持与提供的无私帮助。感谢我的师弟章静博士、何奎锋博士、李广亮博士,助手徐珍珍学士、贾彬彬学士和浙江省肿瘤医院的韩娜硕士给予我在研究工作中的直接协助和无私帮助。感谢我的师兄王海勇博士、王伟斌博士、郑怡博士、王浩浩博士,师姐蒋海萍博士、毛晨宇博士对我研究工作的关心与帮助。感谢浙江大学医学院附属邵逸夫医院的滕荣跃博士、张盛洁博士、赵炎波博士、余路博士、徐晟杰博士、隋新兵博士、袁超硕士等实验室亲爱的兄弟姐妹们,他们的友情相伴与无私帮助,使研究工作充满欢笑与温情。感谢我的爱人蓝欢荣学士在我完成学业过程中倾注的无私爱心和做出的巨大奉献。感谢我的女儿,她的降临为我的生活增添了无尽的乐趣。感谢我的父母和兄嫂,他们默默的奉献和支持是我永远的动力浙江大学博士学位论文 致谢本课题受到计划.、计划.、浙江省重大科技专项.的资助.中文摘要浙江大学博士学位论文胃肠道肿瘤仿真裸鼠移植瘤模型在新型抗靶向药物评价中的应用研究浙江大学医学院 肿瘤学专业博士研究生 金科涛导 师 滕理送教授中文摘要背景:肿瘤动物模型一直以来是抗肿瘤药物临床前疗效预测和可能的毒性评价的有效工具。如果不能为每一种肿瘤找到一个与临床密切相关的肿瘤模型,那么将大大妨碍为某种特定的肿瘤类型找到一种具有普遍疗效的抗肿瘤药物。同样,如果不能为每一个肿瘤患者找到一个最能反映其个体特征的肿瘤模型,也就妨碍了为特定患者找到个体化的治疗药物.建立用于体内评价的代表每一种肿瘤类型的实验性动物模型将大大加快筛选有效的抗肿瘤药物的速度。这些动物模型还可以有效降低药物开发的费用和减少所需的患者来源的肿瘤组织。同样,个体化的肿瘤模型还有利于为每个肿瘤患者选择最有效的个体化治疗药物。近年来,越来越锄 ,多的研究小组开始使用患者新鲜肿瘤组织来源的裸鼠移植瘤模型。这种模型比传统的细胞系模型更能反映人类肿瘤的生物学特征,在细胞增殖、组织形态学特征和分子特征与来源肿瘤组织具有高度的一致性。由于丌模型比细胞系模型更能反映体内状况,因此被有效地应用于潜在抗肿瘤药物的快速筛选。碳型具备四大应用前景:首先,这种模型可以作为抗肿瘤药物临床前筛选的工具。其次,这种模型可以用于评价、分析和筛选抗肿瘤治疗疗效和耐药的标志物。第三,啾型的理想特征也为研究肿瘤原发瘤与转移瘤之间的异质性浙江大学博士学位论文 中文摘要及这种异质性对抗肿瘤药物疗效的影响提供了一个有效的研究工具.第四,由于现有的个体化治疗方法的局限性,迫切需要一种新的方法来尽可能地实现肿瘤治疗的个体化。订模型将是一个为每一位患者预测治疗药物疗效从而实现个体化治疗的理想工具.血管生成是肿瘤多步骤发生发展过程中的八大标志之一.血管内皮生长因子嬲即.卿缸,是目前已知的唯一一个贯穿整个肿瘤生长周期的血管生长因子。因此,被认为是抗肿瘤血管生成药物开发的理想靶标。通过抗达到抗肿瘤血管生成进而实现抗肿瘤治疗的目的在实体瘤的治疗中具有广阔的应用前景。是一个靶向的全人源化的可溶性受体蛋白.它的结构包括了.的第二个胞外区域和.,的第三、四个胞外区域,将这些区域与人免疫球蛋白 的片段基因融合构建融合蛋白.前期研究发现对诱导的人脐静脉内皮细胞具有明显抑制增殖和迁移的作用;对诱导的大鼠动脉环出芽具有明显抑制作用。研究还发现具有明显抑制非小细胞肺癌,移植瘤生长的作用。并且发现,具有明显的体内抗血管生成作用。但是的确切抗肿瘤血管生成作用的机制目前尚未明了。而且,对胃肠道肿瘤的抗血管生成作用和抗肿瘤作用,以及联合化疗和其他靶向治疗的协同治疗价值亦未明确。第一部分:目的:本研究为了建立胃癌患者新鲜肿瘤组织来源的裸鼠移植瘤模型模型用于为肿瘤患者筛选个体化的治疗药物和评价一个新型的抗肿瘤靶向药物,。本研究主要采用胃癌模型评价的抗肿瘤血管生成的作用机制.研究主要观察对肿瘤血管血管内皮细胞和外膜细胞的影响。方法:胃癌患者新鲜肿瘤组织用于建立移植瘤模型。髓染色、免疫组织化学染色和蛋白质免疫印迹,曲珊等方法用于初步鉴定该模型在传代过程中的生物学稳定性。同时评价了该模型对西妥昔单抗、贝伐单抗和中文摘要浙江大学博士学位论文的治疗敏感性.应用胃癌模型采用荧光免疫组织化学方法评价了对肿瘤血管细胞水平的作用.结果:成功建立了胃癌患者模型,该模型在组织形态、蛋白表达方面显示出与患者新鲜肿瘤组织高度的一致性。药物敏感性试验表明西妥昔单抗、贝伐单抗和均显示出对该模型的疗效,而西妥昔单抗与贝伐单抗及西妥昔单抗与联合应用较单药应用具有明显疗效上的优势。治疗后明显影响了模型的肿瘤血管的生成,成熟血管内皮和新生血管内皮均受到明显影响,而对外膜细胞的影响不如内皮细胞,肿瘤血管经作用后显示出更为“正常”的特征。结论:本研究成功建立胃癌患者丁模型,并用于个体化抗肿瘤治疗药物的筛选。本研究表明对肿瘤血管的作用主要通过三个方面来实现,包括磐对成熟肿瘤血管的抑制作用、对新生肿瘤血管的抑制作用和对肿瘤血管的“正常化”作用。第二部分:静目的:本研究为了建立结肠癌患者新鲜肿瘤组织结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤来源的裸鼠移植瘤模型模型用于评价一个新型的抗肿瘤靶向药物,。本研究为了评价与卡培他滨联合治疗对结肠癌结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型的协同治疗价值。本研究为了评价与西妥昔单抗联合治疗对翩野生型结肠癌结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型的协同治疗价值。本研究为了分析结肠癌原发瘤与转移瘤的异质性及这种异质性可能导致的抗和抗联合靶向治疗的疗效差异。方法:结肠癌患者新鲜肿瘤组织结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤用于建立移植瘤模型。染色、免疫组织化学染色、和蛋白质免疫印迹浙江大学博士学位论文 中文摘要碱、基因组芯片基因表达分析、焦磷酸测序、实时荧光定量.等方法用于鉴定该模型在传代过程中的生物学稳定性.同时评价了该模型对西妥昔单抗、贝伐单抗和的治疗敏感性.本研究评价了联合卡培他滨对结肠癌患者新鲜肿瘤组织结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型的治疗价值,以及联合应用对肿瘤生长、增殖相关因子的影响.本研究评价了联合西妥昔单抗对咒黝野生型结肠癌患者新鲜肿瘤组织结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型的治疗价值,以及联合应用对肿瘤生长、增殖相关因子的影响.本研究采用免疫组织化学染色、和蛋白质免疫印迹、基因组芯片基因表达分析、焦磷酸测序等方法评价了结肠癌原发瘤与淋巴转移瘤和肝转移瘤的异质性,并采用药敏试验评价了这种异质性对贝伐单抗和西妥昔单抗联合靶向治疗疗效的影响。结果:成功建立了结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型,该模型在组织形态、蛋白表达、基因突变和基因表达谱方面显示出与患者新鲜肿瘤组织高度的一致性。联合卡培他滨比单药治疗对结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型肿瘤生长的抑制作用具有明显优势。联合西妥昔单抗比单药治疗对咒列野生型结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型肿瘤生长的抑制作用具有明显优势。在、撕虹、砌铂、聊和/表达及基因表达方面,结肠癌原发瘤与淋巴转移瘤和肝转移瘤存在着明显的异质性。研究表明这种异质性可能导致来源于这些肿瘤组织的模型可能存在对抗和抗治疗疗效的差异。结论:本研究成功建立了结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型。该模型提供了一种评价新型抗肿瘤分子靶向药物的有效工具.与卡培他滨联合应用对结肠癌原发瘤、淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型具有协同抗肿瘤作用。和卡培他滨联合治疗可能是转移性结肠癌治疗的有效治疗方案。与西妥昔单抗联合应用对剃野生型结肠癌原发瘤、浙江大学博士学位论文 中文摘要淋巴转移瘤和肝转移瘤移植瘤模型具有协同抗肿瘤作用.和西妥昔单抗联合靶向治疗可能是足融野生型转移性结肠癌治疗的有效治疗方案。结肠癌原发瘤与淋巴转移瘤和肝转移瘤存在明显的异质性,这种异质性可能影响其对抗和抗联合靶向治疗的疗效差异.关键词: 肿瘤 胃癌结肠癌肿瘤移植瘤模型肿瘤个体化治疗血管、内皮生长因子 抗血管生成 卡培他滨 西妥昔单抗 贝伐单抗玎英文摘要浙江大学博士学位论文.? .锄:,时“劬硫”:删.嗍孤 ? 啪铋锄 句 肌印吐血 . 址句 够 唱趾 眦嘶曙 .鸟培哪趾锄 铲, 啪. 雒吐 邪.培岫 蛐献 】咂吼嬲础咖 虹谢印盯 妇删 .鼬也 姗蝴英文摘要浙江大学博士学位论文衄献 嬲 弱,蚰嬲蛐他廿行. ,锄 印眦印】吐咖璐. 船. 幽啮呻锄觚姗也 劬、,啪删.印.肌 弱孤 诵 捌聊,:锄 仃缸., 础体觚删嘶. 伊: 咖鹏, 塌锄 彘毋仃锄锄 觚卿咖., “ 咖印部. 谢锄锄玎印锄,舱 小锄 面 玛.】 锄印 廿印鹊 ?够 璐姐 .溅删口.犯饥讪砌 龇.咖, .嬲廿 觞 、, 鹕 锄砸 哪.浙江大学博士学位论文英文摘要埘 ,觚, 】铡麟 .够 嘶印 铋 . 坞 舳盯雎扛 删 .雒 【,圮.、, :觚觚妞】弱 锄骶 蛆呵撕啪.眦 ,“淞臼硒觚巧墒.增匝 蛐硼曲 廿,血 ,锄 ? 廿.、糯砸 血燃勰觚 位 卜锄 觚 圮 、 恤龃毹 .嘲础咖 锄如觚 丘 .枷觞 嘲:协 削酣芏蛳嬲 玛 :.证妇吐 舵 , ,蔚吐屺 肌啦 伊、, 协 砷.伽唿 玛嫩、糯: 砸 仃 础. 船 妣 ,雠 呻. 幻 ,】匝删 耵位赳:、柝 .浙江大学博士学位论文 英文摘要埝;础 刁,锄 . ,缸 虢也鲥 嬲.访 砌鹳 略劬嬲如: 献 砸巧 舢 劬.盯 硒哪 鳓 砌 岫岖 血够丽 谢 锄、析 . 舒,啪姆弱勰嬲埘洳 、析 嫡】曲曲乎.嬲洫面埝一讹 锄.:虹晰圮 .廿硒 仃缸:瓠盯够嬲觚 嬲 锄 雒饥 ,.丽融够.鲫 劬鼬.: 雠 砌 锄印 觚: : 嬲舔吨 缸. 鹕硼.觚 丘.鹊,、,:讲锄锄 锄 乏略,试姗.孕,孤 鼬:麟觚也锄锄玛 咄. 讪 甜.浙江大学博士学位论文 英文摘要 觚印 出 也 盯略.: 锄 【舡、】,:跚面唧锄 舾伦够砌彘驴撇锄?孤锄 砷.: 哪 峨胁舭 叫 佗 .最 锄 ,】啪唱,丽 鹏删,饿嘲.&趿 砌 锄协龇 毋也 缸锄.切【 、蕊 .廿,刚础 血哪劬嫩锄嬲 姐 .嬲 锄匮埘觚 舔撕 油时 洲 【讧.蚰舢商 仃绷耐,啪砥缸加姗【伊、懈 姆刀 岫.母坞删,锄 璐、 冯. 弘劬 鳓 砸, 觚 撕弱研 也 懿廿够【乏出.恤戤仃、航嬲, 玛加罂.皿始锄 趾 “. 时 瑚袱黔而 硼咖而,锄乏皿,趴、,.傩. .岫弘、 锣砸觚盯 僦 .眺,加眦疏趾彤 瑚英文摘要浙江大学博士学位论文酏啵删王,锄 伽淅 ,.锄. ;螂航时、 锄肌觚廿 瞰 妇谢【,丘: 邶犹切锄锄 砸 嬲 :屺 协妇锄. .: 缸 争 够晰撕龇、, 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言肿瘤动物模型一直以来是抗肿瘤药物临床前疗效预测和可能的毒性评价的有效工具。促使一个实验室候选药物进入临床试验的前提是来自动物模型的研究数据能够预测该药物在临床应用时的疗效捌.当药物研发人员开发一个新型药物时,摆在他们面前的其中一个最大的障碍是从动物实验中获得的药敏和毒理数据有时并不能完全验证在患者身上.如果不能为每一种肿瘤找到一个与临床密切相关的肿瘤模型,那么将大大妨碍为某种特定的肿瘤类型找到一种具有普遍疗效的抗肿瘤药物。同样,如果不能为每一个肿瘤患者找到一个最能反映其个体特征的肿瘤模型,也就妨碍了为特定患者找到个体化的治疗药物。很多已经进入临床试验的备选抗肿瘤药物却最终未能获得批准应用于临床。导致这一结果的主要原因不是因为这些药物的毒性不能耐受,而是因为从动物实验发现的抗肿瘤活性却不能在患者中获得重现。建立用于体内评价的代表每一种肿瘤类型的实验性动物模型将大大加快筛选有效的抗肿瘤药物的速度.这些动物模型还可以有效降低药物开发的费用和减少所需的患者来源的肿瘤组织。同样,个体化的肿瘤模型还有利于为每个肿瘤患者选择最有效的个体化治疗药物.目前用于药物筛选的肿瘤模型基本采用的是将成熟的肿瘤细胞系接种于免疫缺陷小鼠获得的.这种模型已经用于抗肿瘤新药的筛选达数十年之久州.虽然这种模型在揭示肿瘤转移的细胞和分子机制中显示出其优势,但是在预测抗肿瘤药浙江大学博士学位论文 引言物的临床疗效时,这种模型的价值却非常有限.经过体外几十代的培养,恶性肿瘤细胞已经呈现出高度未分化的状态,细胞系在体外培养的选择压力下表现出均一的组织学特征,其生物学特性和分子特征已经和原发肿瘤相差甚远.而且体外培养的细胞系缺乏肿瘤的闻质成分,而这种间质成分被认为在肿瘤转移的病理过程中起到很关键的作用蜘。鉴于此,很多研究小组开始尝试建立一种直接接种来源于肿瘤患者新鲜肿瘤组织撕朗【椭哪呲,的裸鼠移植瘤模型,即移植瘤模型。这种移植瘤模型将患者的新鲜肿瘤组织穿刺标本或手术标本接种于免疫缺陷小鼠皮下或肾包膜下形成肿瘤。模型比传统的细胞系模型更能反映人类肿瘤的生物学特征,这种模型不仅保留了与原发肿瘤组织相似的增殖和组织病理学特征,而且在生物学行为上,包括肿瘤的基因,蛋白质等分子特征与来源肿瘤组织具有高度的一致性嘲。由于模型比细胞系模型更能反映体内状况,因此被有效地应用于潜在抗肿瘤药物的快速筛选.模型具备四大应用前景:首先,这种模型可以作为抗肿瘤药物临床前筛选的工具。其次,这种模型可以用于评价、分析和筛选抗肿瘤治疗疗效和耐药的标志物。第三,模型的理想特征也为研究肿瘤原发瘤与转移瘤之间的异质性及这种异质性对抗肿瘤药物疗效的影响提供了一个有效的研究工具。第四,由于现有的个体化治疗方法的局限性,迫切需要一种新的方法来尽可能地实现肿瘤治疗的个体化。模型将是一个为每一位患者预测治疗药物疗效从而实现个体化治疗的理想工具.早就发现肿瘤患者之间的个体差异将影响患者对相同治疗的敏感性。大量的抗肿瘤药物仅仅对一部分肿瘤患者是有效的。就目前的技术手段和对肿瘤生物学的了解而言,我们很难为每个患者找到一种最适合他的治疗方案。然而,临床肿瘤学家却在努力为每一位患者找到最有效和最合适的治疗方式和药物,即肿瘤的个体化治疗。肿瘤的个体化治疗与传统的抗肿瘤治疗的区别之处在于它可以为肿瘤患者提供更为精确的治疗。抗肿瘤药物的治疗敏感性是临床抗肿瘤治疗中的一个最为基本的概念,而又是一个最难洞悉的概念.究其精髓而言,治疗敏感性描述的是一种现象,即一些患者对某种治疗有效,而另一些患者却无效.在抗肿瘤浙江大学博士学位论文 引言药物的疗效和毒性评价中发现了大量的个体差异的存在.大部分原因在于患者的遗传变异.这些都要求临床肿瘤学家为患者提供个体化的抗肿瘤治疗.基因组学和蛋白质组学等组学技术的飞速发展为实现肿瘤的个体化治疗开辟了新纪元们.大部分肿瘤学家认为现在可以根据患者的基因和蛋白表达特征来指导选择一些特异性药物,并且认为肿瘤的个体化治疗时代已经到来.然而,基因组学和蛋白质组学的发现转化为肿瘤个体化治疗的临床实践之间的距离依然非常遥远.实现肿瘤个体化治疗的第一步是找到可以预测抗肿瘤治疗效果的分子标志物.然后再将实验室的发现转化为临床实践.众多的基础和临床肿瘤学家为寻找可以预测抗肿瘤治疗疗效的分子标志物付出了巨大的努力,但仅仅在针对某些肿瘤的某些治疗中获得了成功删.对于某些肿瘤类型和某些抗肿瘤药物而言,虽然肿瘤的分子标志物的确可以帮助筛选患者和指导治疗,但这些预测因子对治疗敏感性的预测还远没有达到完美的境界。举例来说,只有%的觚印咖 、池印姒阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗敏感川。同样的现象也发生在埃罗替尼或吉非替尼治疗非小细胞肺癌,以及西妥昔单抗或帕妥珠单抗治疗咒己野生型结直肠癌中钙删。鉴于现有的肿瘤个体化治疗手段的局限性,迫切需要一种新的方法来改进目前的现状。移植瘤模型可能为预测抗肿瘤药物的敏感性提供了一种有效的方法。这种模型可以通过临床前的体内药物敏感性筛选试验帮助临床医师选择最有效的治疗药物或治疗方案引。肿瘤组织内部的异质性是人类恶性实体瘤的一大特征。这种异质性表现在多个方面,包括基因水平、蛋白水平和组织形态学水平,体现在大量已知的实体肿瘤中,包括乳腺癌麟、结直肠癌、非小细胞肺癌删,前列腺癌蜊、卵巢癌删、胰腺癌甜,、胃癌鲫、脑癌蝴和肾透明细胞癌吲等。近年来,研究者开始关注肿瘤原发病灶与转移病灶之间的分子差异,试图通过这种分子差异来解释不同肿瘤患者对相同治疗存在敏感性差异的原因。许多研究者对多种实体瘤的原发灶和转移灶的分子差异进行了研究,这些肿瘤包括乳腺癌辨删、结直肠癌晦删和非小细胞肺癌帕,们。这些研究进一步证明了肿瘤的原发瘤与远处转移瘤在组织形态学水平、分子和基因水平存在着明显的异质性,并且提示这种异质浙江大学博士学位论文 引言性可能影响患者对抗肿瘤药物的敏感性.研究肿瘤原发瘤与转移瘤的异质性的主要目的在于分析这种异质性可能导致的对抗肿瘤药物疗效和肿瘤患者预后的影响。正如前面提到的,肿瘤原发瘤与转移瘤之间的异质性表现在一些特征性分子标志和基因上,而这种异质性则很可能影响抗肿瘤药物治疗的效果。衄 等人的研究表明,肺癌原发瘤中的印酬妒删触 印水平和阳明基因突变状态并不能提示其在转移瘤中的水平或突变状态列.他们的研究结果可能对抗靶向治疗产生重要影响.一项回顾性研究探讨了结直肠癌原发瘤和远处转移瘤中孤丢失、妯汀磷酸化和魁基因突变对西妥昔单抗联合伊立替康疗效的影响。这项研究的结果为我们提供了直接证据证明结直肠癌原发瘤和远处转移瘤的遗传异质性将导致患者对抗靶向治疗敏感性的差异。众所周知,某些肿瘤在转移过程中会进一步分化,这将进一步影响肿瘤患者的预后。到目前为止,研究实体瘤原发瘤与转移瘤的异质性进而评价这种异质性对患者预后的影响的报道非常有限,尚没有相关的临床研究报道。虽然大量的研究报道证实了肿瘤原发瘤与转移瘤之间的异质性,但是在我们做出临床决断之前,依然需要一种有效的方法来评价这种异质性对抗肿瘤治疗疗效的影响,以及来探究其潜在的作用机制。如前所述,移植瘤模型由于其健全而有效的建模方法和能够完整保存来源肿瘤组织的组织形态和分子特征将使其可能成为研究肿瘤原发瘤和转移瘤异质性及研究这种异质性可能产生的对药物治疗敏感性差异的有效工具.肿瘤血管生成是肿瘤多步骤多阶段发展过程中的八大标志之一,是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的先决条件棚。与正常组织一样,肿瘤依靠血管网络来实现对营养物质的吸收和代谢产物的排泄。在众多调控血管生成的内源性因子中,血管内皮生长因子廿伊、砒鼢,是目前研究最为彻底的一个。在胚胎发育和肿瘤的新生血管生成中起到了关键的作用。主要通过激活血管内皮细胞的增值和迁移,保持血管内皮细胞的完整和存活中发挥作用引,是目前已知的唯一一个在肿瘤的整个生命周期中均有持续表达的血管生长因子,引.基于上述研究证据,被认为是抗肿瘤血管生成的一个理想的浙江人学博:学位论文治疗靶点枷。通过抗来达到抗肿瘤血管生成的目的进而实现抗肿瘤的治疗目的在实体瘤的治疗中具有广泛的应用前景,并且已被研究证明是非常有效的,。临床研究表明,应用人源化的靶向的单克隆抗体是一种新的重要的抗肿瘤治疗途径。利用抗靶向治疗达到抗肿瘤血管生成进而治疗肿瘤的方法在恶性实体瘤治疗中具有广泛的应用价值,。目前,国际上研制针对的靶向制剂已是如火如荼,包括罗氏公司的贝伐单抗和赛诺菲一安迈特公司联合开发的阿立普西印, 已经上市或正在进行期临床试验,。前期研究中我们成功克隆了靶向的抗肿瘤药物。是一个靶向的全人源化的可溶性受体蛋白。它的结构包括了.的第二个胞外区域和也?,的第三、四个胞外区域,将这些区域与人免疫球蛋白 的片段基因融合构建融合蛋白见图引。前期研究发现对诱导的人脐静脉内皮细胞具有明显抑制增殖和迁移的作用;对诱导的大鼠动脉环出芽具有明显抑制作用引。研究还发现具有明显抑制非小细胞肺癌,移植瘤的作用,。并且发现,具有明显的体内的抗血管生成作用引。然而,对于在体内对肿瘤血管的细胞水平的抑制作用目前尚不明确。前期研究中的基于肿瘤体积和血管密度的评价手段还不足以完整揭示的抗血管生成效应。虽然成熟的血管对于肿瘤的存活是至关重要的,但是如果没有新生的肿瘤血管,肿瘤同样不能进一步的生长、播散和转移引。虽然我们已经初步明确了对肿瘤血管的抑制作用引,但是当其停药后是否会导致肿瘤血管的继续生长,以及其再次用药时是否还能抑制新生血管的生成,目前尚未明确。传统观点认为,抗血管生成药物对肿瘤血管的作用主要是破坏血管进而阻止肿瘤获取氧和营养。这一传统观点目前受到了一些新的挑战。越来越多的研究发现,抗血管生成药物可以在短暂的“治疗时间窗”内逆转肿瘤血管,使其向正常血管网的结构发展,有利于化疗药物和其它药物进入肿瘤内部进而产生协同抗肿瘤作用,这种现象被称为“正常化作用,引。基于我们前期得到的关于对肿瘤血管作用的研究结果,浙江人学博:学位论文 引言我们推测同样有可能存在这种“正常化”作用。而研究对肿瘤血管的“正常化”作用将有利于其未来在临床与其它药物联合应用,从而增加其临床适应症。因此,研究对肿瘤血管特别是基于细胞水平的对血管内皮细胞和外膜细胞的短期效应是完整揭示其抗血管生成作用所必须的。本项目通过建立胃癌仿真裸鼠移植瘤模型移植瘤模型来研究一个新型抗靶向药物的体内抗肿瘤作用和抗血管生成作用机制,并利用该模型开展了对肿瘤个体化治疗药物筛选的探索性研究见图技术路线;通过建立结肠癌多病灶仿真裸鼠移植瘤模型移植瘤模型来研究在转移性结肠癌治疗中的价值,以及联合化疗和抗靶向治疗的协同抗肿瘤作用及其机制,并利用该模型开展了对肿瘤异质性及其与肿瘤靶向治疗差异相关性的初步探索性研究见图技术路线。研究旨在通过为抗肿瘤治疗研究提供一个更可信更合理的动物模型,来评价一个更有效的抗肿瘤靶向治疗药物;来更深入地研究肿瘤的异质性及其导致的对治疗效果的影响;来更深入地探讨肿瘤的个体化治疗模式,以实现更有效更合理更彻底地治疗肿瘤的目的见图研究目的。瓜 书小, 列图 分子结构示意图浙江人学博:学位论文 引言模型的建立组织病理学鉴定模型生物学稳定性的鉴定 免疫组织化学鉴定蛋白质免疫印迹鉴定体内抗肿瘤血管作用机制研究的个体化治疗筛选研究 对肿瘤对成熟 对新生治疗 治疗血管的“正血管的抑制 血管的抑制作用荧光 常化刀作用作用荧光免疫组化 免疫组化 荧光免疫选择最敏感的治疗方案组化图技术路线望釜塑墨兰薹塞免疫组织化学鉴定茎里壅奎鳖壅篁堕墼塑壁模型生物学稳定性的鉴定茎里耋竺堂兰塞茎里堇苎萄甄蕊画丽翮肿瘤异质性所的抗肿瘤 联合化疗的抗 联合抗 作用及其相关 肿瘤作用及其相关 靶向治疗的抗肿瘤 致的靶向治疗机制研究荧 机制研究荧光免 作用及其相关机制 差异性研究光免疫组化、 疫组化、 研究荧光免疫组 焦磷酸测序, 让.、图技术路线浙江人学博:学位论文图研究目的第一部分材料与方法浙江大学博士学位论文第一部分胃癌仿真裸鼠移植瘤模型在新型抗靶向药物评价中的应用研究第一部分基于胃癌仿真裸鼠移植瘤模型的个体化治疗药物筛选研究肿瘤个体化治疗的目标是为每一位患者找到最有效和最合适的治疗方式和药物。肿瘤的个体化治疗与传统的抗肿瘤治疗的区别之处在于它可以为肿瘤患者提供更为精确的治疗.抗肿瘤药物的治疗敏感性是临床抗肿瘤治疗中的一个最为基本的概念,而又是一个最难洞悉的概念。究其精髓而言,治疗敏感性描述的是一种现象,即一些患者对某种治疗有效,而另一些患者却无效。众多的基础和临床肿瘤学家为寻找可以预测抗肿瘤治疗疗效的分子标志物付出了巨大的努力,但仅仅在针对某些肿瘤的某些治疗中获得了成功峨拍,亿卅.对于某些肿瘤类型和某些抗肿瘤药物而言,虽然肿瘤的分子标志物的确可以帮助筛选患者和指导治疗,但这些预测因子对治疗敏感性的预测还远没有达到完美的境界,阚。鉴于现有的肿瘤个体化治疗手段的局限性卅,迫切需要一种新的方法来改进目前的现状。预测肿瘤对治疗的敏感性是临床处理肿瘤患者的基本工作,其最初的目的是为了发现不敏感的患者以便尽早停止无效的治疗和避免不必要的因肿瘤进展而导致的并发症。缺乏合适的肿瘤动物模型来帮助临床肿瘤科医师预测患者对治疗的敏感性是目前抗肿瘤个体化治疗的巨大缺憾。移植瘤模型可能为预测抗肿瘤药物的敏感性提供了一种有效的方法,珏明。 碳型比传统的细胞系模型更能反映人类肿瘤的生物学特征,这种模型不仅保留了与原发肿瘤组织相似的增殖和组织病理学特征,而且在生物学行为上,包括肿瘤的基因,蛋白质等分子特征与来源肿瘤组织具有高度的一致性,甄殍枷,因而这种模型可以通过临床前的体内药物敏感性筛选试验帮助临床医师选择最有效的治疗药物或治疗方案陬.浙江大学博士学位论文 第一部分材料与方法在本项研究中,我们按照前期工作中建立的移植瘤模型构建技术路线,建立胃癌的移植瘤模型,并将该模型用于胃癌患者个体化治疗药物的筛选,同时将该模型用于评价一个新型抗分子靶向药物的抗肿瘤作用.材料与方法.材料.动物实验与免疫组织化学相关试剂量吉诺生物医药技术公司青霉素、链霉素 公司,美国胎牛血清 公司,美国甲醇、乙醇 杭州长征化工厂二甲基亚砜舯瓜司,美国异氟醚肿论司,美国成都康弘生物科技公司沁公司,美国贝伐单抗西妥昔单抗 公司,德国注射用生理盐水 杭州民生医药集团抗体 公司,美国.抗体 公司,美国抗体 公司,美国抗体 公司,美国抗体 公司,美国抗体 公司,美国抗体 公司,美国抗体 公司,美国浙江大学博士学位论文第一部分材料与方法傩锄 抗体公司,美国吁驴抗体 公司,美国触叶研抗体 公司,美国抗体公司,美国组化试剂金 中杉金桥,苏木素等染色试剂中杉金桥二甲苯浙江衢州巨化.蛋白质电泳及相关试剂十二烷基硫酸钠栅公司,美国甘氨酸触公司,美国晰三羟甲基氨基甲烷触公司,美国二硫苏糖醇触公司,美国丙烯酰胺加公司,美国,一亚甲双丙烯酰胺加公司,美国触公司,美国.过硫酸铵公司,美国、.华美生物工程公司. 华美生物工程公司小牛血清白蛋白公司,美国甲醇杭州长征化工厂冰醋酸杭州长征化工厂无水乙醇杭州长征化工厂蛋白定量试剂盒.聊公司,美国缸. .公司,美国低分子量蛋白标准肋公司,立陶宛触公司,美国浙江大学博士学位论文 第一部分材料与方法。坞觥司,美国醋酸钾触公司,美国脱氧胆酸钠 触公司,美国甘油 上海化学试剂采购供应站试剂厂.宁波市化学试剂厂湖州化学试剂厂宁波市化学试剂厂湖州化学试剂厂扣杭州大方化学试剂厂抗体锄协公司,美国中杉金桥玎姆标记的抗小鼠抗体标记的抗心单克隆抗体上海康成生物技术有限公司蛋白酶抑制剂 公司,瑞士化学发光底物 舭公司,瑞士膜.公司,美国.动物实验所用裸鼠雌性.周龄购于上海斯莱克公司弱批咖,觚,】【岫.常用试剂配制方法.柠檬酸盐缓冲液先配制储备液:液,.柠檬酸溶液;柠檬酸.,加蒸馏水至;液,.柠檬酸三钠溶液,柠檬酸三钠.,加蒸馏水至“;.柠檬酸盐缓冲液:液础,液.,加蒸馏水至“%中性福尔马林浙江大学博士学位论文 第一部分材料与方法甲醛溶液 毫升无水磷酸氢二钠 .克磷酸二氢钠