第9章 B 细胞.doc

第九章 B淋巴细胞B淋巴细胞（B lymphocyte）简称B细胞，由哺乳动物骨髓或鸟类法氏囊中的淋巴样干细胞分化发育而来。成熟B细胞主要定居于外周淋巴器官的淋巴小结内。B细胞约占外周淋巴细胞总数的20%。B细胞表面的多种膜分子在B细胞的分化和功能执行中有重要作用。B细胞不仅能通过产生抗体发挥特异性体液免疫功能，也是重要的抗原提呈细胞。第一节 B细胞的分化发育哺乳动物的B细胞是在中枢免疫器官骨髓中发育成熟的。骨髓中髓质基质细胞表达的细胞因子和黏附分子是诱导B细胞发育的必要条件。B细胞在中枢免疫器官中的分化发育过程中发生的主要事件是功能性B细胞（抗原）受体（B cell receptor, BCR）的表达和自身免疫耐受的形成。（一）BCR的基因结构及其重排BCR是表达于B细胞表面的免疫球蛋白，即膜型免疫球蛋白(membrane immunoglobulin, mIg)。B细胞通过BCR识别抗原，接受抗原刺激，启动体液免疫应答。编码BCR的基因在胚系阶段以分隔的、数量众多的基因片段（gene segment）的形式存在。在B细胞的分化发育过程中，这些基因片段发生重排（rearrangement）和组合，从而产生数量巨大、能识别特异性抗原的BCR。TCR和BCR的基因结构以及发生重排的机制十分相似，本节以BCR为例简述其基因结构和重排特征。1BCR的胚系基因结构 Ig轻链和重链基因位于不同的染色体上。人重链基因位于第14号染色体长臂，由编码可变区的V基因片段（variable gene segment）、D基因片段（diversity gene segment）和J基因片段（joining gene segment）以及编码恒定区的C基因片段组成。人轻链基因分为基因和基因，分别定位于第2号染色体长臂和第22号染色体短臂。轻链V区基因只有V、J基因片段。轻重链每种基因片段是以多拷贝的形式存在，其中编码重链V区的VH、DH和JH的基因片段数分别为40、25和6个；编码轻链V区的Vk和Jk基因片段数分别为40和5个，编码l轻链V区的Vl和Jl基因片段数分别为30和4个；重链C基因片段有9个，其排列顺序是5-Cm-Cd-Cg3-Cg1-Ca1-Cg2-Cg4-Ce-Ca2-3（见图9-1）。图9-1人BCR重链和轻链的胚系基因结构示意图2BCR的基因重排及其机制 Ig的胚系基因是以被分隔开的基因片段的形式成簇存在的，只有通过基因重排形成V D J（重链）或V J（轻链）连接后，再与C基因片段连接，才能编码完整的Ig多肽链，进一步加工、组装成有功能的BCR。Ig V区基因的重排主要是通过重组酶（recombinase）的作用来实现的，其作用包括识别位于V（D）J基因片段两端的保守序列，切断、连接以及修复DNA等。重组酶包括：重组激活酶基因（recombination activating gene，RAG）编码重组激活酶，有RAG1和RAG2两种，形成RAG1/RAG2复合物，只表达于不成熟阶段的T细胞和B细胞，可特异性识别并切除V、（D）、J基因片段两侧称之为重组信号序列（recombination signal sequence，RSS）的保守序列；末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）可将数个核苷酸（称之为N核苷酸）通过一种非模板编码（non-template encoded）的方式插入到V、D、J基因重排过程中出现的DNA的断端；其他如DNA外切酶、DNA合成酶等。通过重组酶的作用，可以从众多的V（D）J基因片段中将1个V片段， 1个D片段（轻链无D片段）和1个J片段重排在一起，形成V（D）J连接（图9-2），最终表达为有功能的BCR。Ig胚系基因重排的发生具有明显的程序化，首先是重链发生基因重排，随后是轻链重排。经过Ig胚系基因的重排，B细胞的DNA序列与其他体细胞有很大不同，这是存在于B细胞和T细胞中非常独特的生物学现象。图 9-2 重链可变区基因重排示意图3等位基因排斥（allelic exclusion）和同种型排斥（isotype exclusion） 一个B细胞克隆只表达一种BCR，只分泌一种抗体。对于遗传上是杂合子的个体来说，保证B细胞克隆单一的特异性以及只表达一种Ig型的轻链，主要是通过等位基因排斥和同种型排斥的机制来实现的。等位基因排斥是指B细胞中位于一对染色体上的轻链或重链基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达，先重排成功的基因抑制了同源染色体上另一等位基因的重排。同种型排斥是指k轻链和l轻链之间的排斥，k轻链基因的表达成功即抑制l轻链基因的表达。（二）抗原识别受体多样性产生的机制免疫系统中T细胞库和B细胞库分别包含了所有特异性不同的T细胞克隆和B细胞克隆，但在胚胎发育过程中，它们都来自于同一个祖细胞。淋巴细胞发育过程中造成抗原识别受体的多样性产生的机制主要包括组合多样性（combinational diversity）、连接多样性（junctional diversity）和体细胞高频突变（somatic hypermutation）。1组合造成的多样性 抗原识别受体的胚系基因以众多的V、D、J片段成簇存在，当发生V、（D）、J基因片段重排时，只能分别取用众多V、（D）、J基因片段中的1个，因而可产生众多V区基因片段组合。在人类Ig基因的重排中，以VH为例，其排列组合的种类可达40（VH）25（VD）6（VJ）=6000之多。以此类推，Vk和Vl 的V、J基因片段的组合种类分别达200种和120种。理论上Ig V区基因片段的组合加上轻重链组合后的多样性约为1.9106。2连接造成的多样性 Ig各基因片段之间的连接往往并不准确，有插入、替换或缺失核苷酸的情况发生，从而产生新的序列，称为连接多样性。在Ig V区基因重排过程中，V、（D）、J基因片段的连接处可以丢失或加入数个核苷酸。如末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）能将N-核苷酸加到V、D、J基因片段重排中出现的DNA断端，从而显著增加了BCR和Ig的多样性。3体细胞高频突变造成的多样性 体细胞高频突变造成的多样性是在已成熟B细胞即已完成V基因重排的基础上发生的，而且发生在抗原刺激后外周淋巴器官生发中心的B细胞。体细胞高频突变的主要方式是点突变，常发生在V区的CDR区，不仅能增加抗体的多样性，而且可导致抗体的亲和力成熟。（三）B细胞在中枢免疫器官中的分化发育B细胞在骨髓中的发育经历了祖B细胞（pro-B cell）、前B细胞（pre-B cell）、未成熟B细胞（immature B cell）和成熟B细胞（mature B cell）等几个阶段。1祖B细胞 早期祖B细胞(early pro-B cell )其重链可变区基因D-J开始重排，晚期祖B细胞(late pro-B cell )的V-D-J基因发生重排，但此时没有mIgM的表达。祖B细胞开始表达Iga/Igb异源二聚体，是B细胞的重要标记。Iga/Igb是BCR复合物的组成部分，主要介导抗原刺激后的信号传递。2前B细胞 前B细胞经历大前B细胞（large pre-B cell）和小前B细胞（small pre-B cell）两个阶段。大前B细胞可合成完整链，表达pre-B受体。pre-B受体由m链和替代轻链（surrogate light chain）所组成。替代轻链由l5和VpreB两种蛋白组成，在结构上与和轻链同源，但缺乏多样性（图9-3）。pre-B受体可抑制另一条重链基因的重排（等位基因排斥），促进B细胞的增殖和进一步发育。小前B细胞的轻链基因发生V-J重排，但依然不能表达功能性BCR。图 9-3 pre-BCR与 BCR结构示意图3未成熟B细胞 未成熟B细胞可以表达完整mIgM，此时未成熟B细胞如受抗原刺激，非但不能活化、增殖，反而引起未成熟B细胞发生凋亡而导致克隆清除，形成自身免疫耐受。4成熟B细胞 成熟B细胞又称初始B细胞（naive B cell）。B细胞Cm和Cd基因片段有一个共同的mRNA前体，通过差异剪接（differential splicing）分别形成mmRNA和dmRNA。成熟B细胞表面可同时表达mIgM和mIgD，其可变区完全相同。成熟B细胞离开骨髓，定居在外周淋巴器官，介导特异性体液免疫应答。B细胞在骨髓的分化发育过程不受抗原影响，称为B细胞分化的非抗原依赖期。B细胞在骨髓微环境诱导下发育为初始B细胞，离开骨髓，到达外周免疫器官的非胸腺依赖区定居，在那里接受特异性抗原的刺激而活化、增殖，进一步分化成熟为浆细胞和记忆性B细胞（图9-4），此过程为B细胞分化的抗原依赖期（详见第十三章）。图 9-4 B细胞的发育阶段（四）B细胞中枢免疫耐受的形成前B细胞在骨髓中发育至未成熟B细胞后，其表面仅表达完整的mIgM。此时的mIgM若与骨髓中的自身抗原结合，不仅不能活化B细胞，还会导致该细胞的凋亡，形成克隆清除（clone deletion）。一些识别自身抗原的未成熟B细胞可以通过受体编辑（receptor editing）改变其BCR特异性。在受体编辑过程中，mIgM对自身抗原的识别将导致RAG基因重新活化，发生轻链VJ的再次重排，合成新的轻链，替代自身反应性轻链，从而得以进一步发育。若受体编辑不成功，则该细胞发生凋亡。未成熟B细胞与自身抗原的结合在某些情况下可引起mIgM表达的下调，这类细胞虽然可以进入外周淋巴器官，但对抗原刺激不产生应答，称为无能（anergy）。在骨髓中发育的未成熟B细胞通过上述的克隆清除、受体编辑和失能等机制形成了对自身抗原的中枢免疫耐受，成熟的B细胞到达外周淋巴组织后仅被外来抗原激活，发挥B细胞的适应性免疫应答。第二节 B淋巴细胞的表面分子及其作用B细胞表面有众多的膜分子，它们在B细胞识别抗原，B细胞的活化、增殖，以及抗体产生等过程中发挥着作用。（一）B细胞抗原受体复合物B细胞表面最主要的分子是B细胞（抗原）受体（B cell receptor, BCR）复合物。BCR复合物由识别和结合抗原的mIg和传递抗原刺激信号的Ig/Ig（CD79a/CD79b）异源二聚体组成（图 9-4）。1mIg mIg是B细胞的特征性表面标志。mIg以单体形式存在，能结合特异性抗原，但由于其胞质区很短，不能直接将抗原刺激的信号传递到B细胞内，需要其他分子的辅助来完成BCR结合抗原后信号的传递。在抗原刺激下，B细胞最终分化为浆细胞，浆细胞不表达mIg。2Ig/Ig Ig和Ig均是免疫球蛋白超家族的成员，有胞膜外区、跨膜区和相对较长的胞质区。Ig和Ig在胞膜外区的近胞膜处藉二硫键相连，构成二聚体。Ig/Ig和mIg的跨膜区均有极性氨基酸，藉静电吸引而组成稳定的BCR复合物。Ig/Ig胞质区含有免疫受体酪氨酸活化模体（immnoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），通过募集下游信号分子，转导特异性抗原与BCR结合所产生的信号（详见第十三章）。图9-5 BCR复合物结构模式图 （二）B细胞共受体B细胞共受体（coreceptor）能加强B细胞活化信号的转导。B细胞表面的CD19与CD21及CD81（TAPA-1）非共价相联，形成B细胞特异的多分子活化共受体,能提高B细胞对抗原刺激的敏感性（详见第十三章）。CD19/CD21/CD81复合体中，CD19胞质区可传递活化信号。CD21即CR2，可结合C3d，C3d是补体C3活化后的片段。CD19/CD21/CD81共受体通过CD21与C3d结合，发挥B细胞共受体的作用。此外，CD21也是B细胞上的EB病毒受体，与EB病毒选择性感染B细胞有关。（三）协同刺激分子抗原与B细胞的BCR结合, 所产生的信号经由CD79a/CD79b转导至细胞内，此即为B细胞活化的第一信号，但仅有第一信号不足以使B细胞活化, 还需要第二信号。第二信号主要由Th细胞和B细胞表面的协同刺激分子间的相互作用产生。1CD40 CD40属肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF），组成性地表达于成熟B细胞。CD40的配体（CD40L即CD154），表达于活化T细胞。CD40与CD40L的结合是B细胞活化的第二信号，对于B细胞分化成熟和抗体产生起着十分重要的作用（详见第十三章）。2CD80和CD86 CD80（B7.1）和CD86（B7.2）在静息B细胞不表达或低表达，在活化B细胞表达增强，其相应的受体是表达于T细胞上CD28和CTLA-4，提供T细胞活化的第二信号。3其他黏附分子 Th细胞对B细胞的辅助以及活化B细胞向T细胞提呈抗原，均需要细胞间的接触，黏附分子在此过程中起很大的作用。表达于B细胞的黏附分子有ICAM-1(CD54)、LFA-1(CD11a/CD18)等，这些黏附分子也具有协同刺激作用。（四）其他表面分子1CD20 表达于除浆细胞外的发育分化各阶段的B细胞，可调节跨膜钙离子流动，在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。CD20是B细胞特异性标志，是治疗性单抗识别的靶分子。2CD22 特异性表达于B细胞，其胞内段含有ITIM模体，是B细胞的抑制性受体，能负调节CD19/CD21/CD81共受体。基因敲除CD22的小鼠其B细胞活化增强。3CD32 即FcgR，其中FcgRB亚型能负反馈调节B细胞活化及抗体的分泌（参见第十六章）。第三节 B淋巴细胞的亚群根据是否表达CD5分子，B细胞可分为CD5+B-1细胞和CD5-B-2细胞两个亚群。B-1细胞（B-1 cell）主要产生低亲和力的IgM，参与固有免疫；B-2细胞即通常所指的B细胞，是参与适应性体液免疫的主要细胞。（一）B-1细胞B-1细胞约占B细胞总数的5%-10%，主要定居于腹膜腔、胸膜腔和肠道固有层中。B-1细胞出现较早，在个体发育胚胎期即产生，具有自我更新（self-renewal）能力。慢性淋巴细胞白血病中的B细胞均表达CD5，一般认为其来源于B-1细胞。B-1细胞表达的免疫球蛋白可变区相对保守，主要针对碳水化合物（如细菌多糖等）产生较强的应答，无需Th细胞的辅助，不发生免疫球蛋白的类别转换。B-1细胞所合成的低亲和力IgM能与多种不同的抗原表位结合，表现为多反应性（polyreactivity）。在无明显外源性抗原刺激的情况下，B-1细胞能自发分泌针对微生物脂多糖和某些自身抗原的IgM，这些抗体称天然抗体（natural antibodies）。B-1细胞属固有免疫细胞，在免疫应答的早期发挥作用，尤其在腹膜腔等部位能对微生物感染迅速产生抗体，构成了机体免疫的第一道防线。B-1细胞也能产生多种针对自身抗原的抗体，与自身免疫病的发生有关。（二）B-2细胞B-2细胞是分泌抗体参与体液免疫应答的主要细胞。B-2细胞在个体发育中出现相对较晚，主要定居于淋巴器官。在抗原刺激和Th细胞的辅助下，B-2细胞最终分化成抗体形成细胞浆细胞（plasma），产生高亲和力的抗体，行使体液免疫功能。B-1细胞和B-2细胞在表面特征、免疫应答等多方面存在着明显的不同（见表9-1）。表9-1 B-1细胞和B-2细胞亚群的比较性质B-1细胞B-2细胞CD5分子表达+-更新的方式自我更新由骨髓产生自发性Ig的产生高低针对的抗原碳水化合物类蛋白质类分泌的Ig类别IgMIgGIgGIgM特异性多反应性单特异性体细胞高频突变低/无高免疫记忆少/无有第四节 B淋巴细胞的功能B细胞的主要功能是产生抗体介导体液免疫应答。此外，活化的B细胞还可提呈可溶性抗原。（一）产生抗体介导体液免疫应答B细胞产生的抗体主要以下列几种方式介导体液免疫应答。1中和作用 病毒和胞内细菌必须感染细胞才能复制及生长繁殖，并在细胞间传播。这类病原体是藉与靶细胞表面的特异分子（如受体）结合而感染细胞的。某些针对病原体的抗体，可阻断病原体与靶细胞的结合，抗体的这种作用称为中和作用（neutralization）。抗体的中和作用主要针对病毒和胞内细菌的感染，在中和细菌外毒素作用中也起重要作用。2调理作用 抗体与病原体表面结合，其Fc段又可与吞噬细胞表面的Fc受体结合，将病原体带至吞噬细胞处，使之易被吞噬，抗体的这种作用称为抗体的调理作用(opsonization)。此外，抗体与病原体表面结合后，激活补体，并形成抗原-抗体-补体复合物，复合物中的补体成分与吞噬细胞表面的相应补体受体结合，把病原体“带”至吞噬细胞处，使之易被吞噬。3参与补体的溶细胞或溶菌作用 IgG和IgM抗体结合细胞或细菌可通过经典途径激活补体，最后形成攻膜复合物（MAC），导致细胞或细菌的溶解。4ADCC IgG抗体结合病毒感染细胞或肿瘤细胞后，NK细胞可通过表面的Fc受体与IgG的Fc段结合，从而杀伤靶细胞。（二）B细胞提呈可溶性抗原无论是巨噬细胞还是树突状细胞，都不能有效地摄取可溶性抗原，而活化的B细胞则可藉其表面的BCR结合可溶性抗原，并内化BCR-可溶型抗原复合物，对其加工、处理后，以抗原肽-MHC分子复合物的形式提呈给T细胞。活化B细胞表达的CD80和CD86，在B细胞提呈抗原过程中充当协同刺激分子，与T细胞表面CD28分子结合为T细胞活化提供第二信号。在自然界，大多数病原体(如细菌和病毒)为颗粒性抗原，可溶性抗原仅见于昆虫毒素、吸血昆虫吸血时注入机体的抗凝剂、蛇毒及一些变应原等物质。B细胞并不组成性表达协同刺激分子，但在多种微生物组分（如脂多糖）的诱导下可表达B7.1（CD80），特别是B7.2（CD86），这表明只有活化B细胞才能提呈可溶性抗原。这也解释了为什么在正常情况下，静息的B细胞不能把可溶性自身抗原提呈给T细胞，以诱导相应