两种pHZ1358衍生物提高链霉菌基因敲除的效率.doc

推进链霉素基因敲除效率两种pHZ1358衍生物【摘要】链霉菌质粒pIJ101中sti基因的删除使其pHZ1358衍生物成为基因破坏和代替的有效载体。现在看来，pHZ1358被衍生的质粒pJTU1278进一步优化了，这种衍生质粒多为一个携带多个克隆位点和LacZ基因筛选标记的盒子，方便了在大肠杆菌中质粒的产生。此外，在pJTU1278的 oriT区域也已被删除，产生一个载体（pJTU1289），其可用于PCR定位的明确。这些载体的有效使用，证明了该基因删除与阿维链霉菌中阿维菌素的生物合成有关。【关键字】穿梭载体pHZ1358, pJTU1278, pJTU1289, 共轭 聚合酶链反应定位 链霉菌，土栖革兰氏阳性菌，因他们有能力生产出多种生物活性化合物，故在生物技术研究领域具有重要的意义。链霉菌也不同于一般的原核生物，因为它们得经历一个复杂的形态分化周期，在其生命周期的不同阶段形成孢子，营养基质菌丝和气生菌丝。尽管为了不同的研究目的而不断对这一方面开发新技术，但是基因缺失或基因崩解仍然是最有效的也是不可缺少的手段之一。为了对链霉菌类基因进行干扰和替代，pHZ1358已发展为一个有效率的pIJ101衍生载体，通过去除一个含有导致宿主体内积累的单链质粒的sti（强效的不相容轨迹）的DNA区域。36 - bp直接重复的进一步删除，使复制的质粒可在大肠杆菌里作一稳定的穿梭载体 在这里，我们报告两个pHZ1358衍生物，pJTU1278和pJTU1289，其具有复合多样的克隆位点和一个LacZ基因筛选标记（为大肠杆菌合成便捷），而后者已删除oriT，允许它是专门用于PCR的靶向点。对pJTU1289的使用情况也通过阿维菌素生物合成基因的删除得以证明。材料和方法本研究中运用了菌株和质粒DH10B（GIBCO - BRL）和ET12567（pUZ8002）分别被用来作为大肠杆菌的克隆和共轭。而阿维链霉菌NRRL 8165则用于基因删除。fosmid载体pCC2FOSTM（震源生物技术）被用来构建阿维链霉菌NRRL 8165的基因组文库。质粒pJTU412是来自于Sun等人的礼物。根据Sambrook 和 Russell对大肠杆菌的DNA的分离和质粒操纵进行了操作pJTU1278和pJTU1289的组建 对于pJTU1278的构型， pJTU412先对其用KpnI进行消化，接着大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段对其钝化，然后自行载入而产生pJTU1275 Klenow片段，并进一步与BglII和SphI消化。由此产生的来自pJTU1275的8.7-kb BglII - SphI片段，被与Klenow片段一起利用和自行载入而产生pJTU1276，其和XbaI一起消化，和Klenow片段一起被利用，最后自动载入而产生pJTU1277。来自pBluescript II SK(+)的585 - bp PCR片段利用基因引物LacZ-P1(5-AACAATTGCCATTCGCCATTCAGG-3)和LacZ-P2(5-AACAATTGCCCAATACGCAAACC-3)以与MunI消化以及插入pJTU1277的EcoRI位点而产生pJTU1278。lacZ基因和pJTU1278的抵抗Bla基因处于相同的区域。对于pJTU1289创建，pJTU1278被消化于Sse8387I，而来自pJTU1278的8.4-kb Sse8387I片段则自动载入而产生pJTU1289。aveA4（avermetilis HYL16）的基因删除 在4671 - bp的酶切片段中，包括部分来自阿维链霉菌NRRL 8165基因文库中的粘粒14A7，这个酶切片段用于克隆为pJTU1289而产生pJTU1314。aac(3)IV 和oriT盒子通过pIJ733中断盒运用引物aveA4-T1 (5-ACTCCCGCCTGCACGACGCCACTCCCCCAGCCCACAAGGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3)和aveA4-T2(5-GCGGAGCCATGGTGGCCATCGAGGCGTCCGAGGACGAGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3)而扩增长度.。由此产生的PCR产物用来取代pJTU1314中的aveA4 1,150 bp的DNA区域而产生pJTU1317，然后改变NRRL 8165产生avermetilis HYL16。接着对天然的和突变的avermetilis HYL16通过发酵，提取，和LC - MS分析进行了对比。S. avermitilis的培养 Kieser等人描述了链霉菌的培养条件。一种SFM的固体培养基用于培养阿维链霉菌孢子，发酵，以及大肠杆菌和链霉菌之间的共轭。一种以TSB培养并辅以蔗糖10.3和1的酵母以促进菌丝体的生长，以及对总DNA进行分离提取。为了在必要时对接合子进行筛选，在固体和液体培养基中加入浓度为12.5 g/ml和 15 g/ml的硫链丝菌素和安普霉素。阿维菌素（Avermitilis）的分析 经过七天琼脂板生长，接着收集和用乙醇提取在琼脂板上的S.avermitilis 和S. avermetilis HYL16S突变菌丝体。提取液经减压产生一种油性物质，并对油性物质进一步用1ml的甲醇提取浓缩。对甲醇提取物进行分析，直接用HPLC - MS 安捷伦1100采用Zorbax SB - C18（2.1 150毫米）列及使用acetonitrile/H2O线性梯度程序配备：60乙腈超过3分钟，60-90 超过5分钟，90超过2分钟，90-100超过2分钟，和不断的0.5ml/min流量的100乙腈。iontrap质谱仪运用于干燥气体流量为8 l/mi，雾化器压力为30磅，干燥气体温度为325oC，而碎片振幅在1.0v和1.8v之间的电喷雾离子源正离子模式结果与讨论pJTU1278和pJTU1289的创建从pIJ101 pHZ1358衍生出来的是一种有效的有针对性的基因缺失和破坏的大肠杆菌或链霉菌穿梭载体。然而，对pHZ1358进一步改善将降低36-bp的直接重复率，这往往导致大肠杆菌质粒重组的一系列问题 为了方便基因的克隆，有一个复合多样的克隆位点是必要的。因此，向量优化是从pHZ1358衍生到pJTU412的。通过与KpnI消化，然后填充在pJTU412消除的 KpnI位点而钝结束，紧接着通过与BglII - SphI进一步消化和通过填充和再连接消除的 KpnI位点的钝结束，介绍携带多个克隆位点的盒子，且伴有质粒pBluescript II SK（+）的PCR片段。(图一)克隆成功证实了酶切和测序（图2）。 在上述操作的基础上，pHZ1358衍生为pJTU1278有下列特点：以操纵链霉菌的pIJ101和抗性基因TSR;操纵大肠杆菌的 LacZ基因和抗性基因；以及大肠杆菌与链霉菌的共轭基因。此外，由于其起源基因pHZ1358 分离的不稳定，它可用于高效的基因缺失或链霉菌的破坏。由于单个COS的被列入，也可用于粘粒文库的组建。 对于PCR靶向目标的特殊目的，一个pJTU1278的额外优化用于生成pJTU1289，其中含有ori T的0.8 kb Sse83871片段被删除。aveA4的删除pJTU1278和pJTU1289作为基因载体的使用被证明基因的删除对S. avermitilis MA-4680的阿维菌素生物合成是必不可少的。如3图所示，aveA4 的1,150 bp DNA区域被oriT-aac(3)IV盒子所代替来生成avermetilis HYL16。S.avermetilis HYL16的成功事例就被证实运用了PCR（图3b），以及aveA4成功删除被证实是通过代谢产物的比较实现的，通过高效液相色谱法分析对天然的和突变的avermetilis HYL16进行比较。显然，avermetilis的产物在S. avermetilis HYL16中完全没有了，形成鲜明对比的是野生型菌株，而在S avermetilis HYL16中仍然产生了oligomycin和野生型菌株NRRL 8165处于同一水