微生物工程实验指导2011.doc

微生物工程实验指导实验一：接种工具的认识与使用 实验二：比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度实验三：测定菌体干重实验四：发酵过程中糖的利用实验五：淀粉产生菌的初筛实验六：淀粉酶活力的测定实验七：生产菌株发酵条件优化实验八：发酵污染的检测与判别实验九：乳酸菌的分离纯化与鉴别实验十：酸乳及酸乳饮料的制作实验十一：反应器设备的原理及使用实验十二：反应器电极的使用实验十三：抗生素产生菌初筛实验一：接种工具的认识与使用一、 实验目的1. 认识接种工具，学会使用方法，学习包扎接种针、移液管及灭菌方法。2. 学习接种的基本技能二、 实验原理接种是发酵技术的最基本操作，微生物的传代和扩大培养都需要接种或移种。接种是指将微生物接到适合于其生长的营养物上使微生物繁殖的操作。移种是指将已培养好的液体培养物转接到新鲜的液体培养基中，使其进一步扩大培养和生长繁殖的操作。接种工具常用的有接种针、接种环、接种铲，移液管等。接种和移种是将已培养好的菌种转接到新鲜培养基的过程，不同的菌，采用不同的接种方法。一般细菌和酵母菌由于菌落比较湿润，容易粘附到接种工具上，因此可以用接种针或接种环接种；而放线菌和霉菌的菌落比较干燥，不容易粘附在接种工具上，因此用接种铲产起斜面表层的一块菌苔作为接种物。接种过程是一个无菌过程，接种工具、接种环、接种环境以及培养基都应该保证无菌条件。三、 试剂与器材接种针、接种环、移液管、棉花、牛皮纸、试管斜面培养基、液体培养基四、 实验操作1. 认识接种针、接种环2. 接种针、接种环的包扎和灭菌3. 移液管的认识和包扎4. 接种与移种A两斜面之间的接种方法 (1)贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。(若用记号笔标记则不需标签)。 (2)点燃酒精灯。 (3)接种 用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。简述如下： 1)手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置(图2-11)。2)旋松管塞 先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。 4)拔管塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。见图2-12(a)所示。 5)接种环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。 6)取菌 待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。见图2-12(b)所示。7)接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。B 斜面转接摇瓶液体培养基1. 接种环接种2. 移液管接种种子培养物转接发酵摇瓶1） 用右手的无名指、小指、和手掌夹住种子瓶的棉塞，轻轻拔出，将瓶口过火后移开，但使瓶口仍靠近并面向火焰。2） 将移液管伸入种子摇瓶培养物中吸出要求量的培养物，食指按住移液管顶部，小心取出吸管。3） 用右手的无名指、小指和手掌夹住发酵摇瓶的纱布塞，轻轻拔出，将摇瓶过火后移开，但使瓶口仍靠近并面向火焰。4） 将带有菌体的移液管伸入待接种的摇瓶，放松吸管顶部，接入种子液，取出移液管，放入消毒水中。5） 摇瓶口包上纱布，放恒温摇床培养。5.五、 思考题灭菌后如果比较湿对接种有没有影响，怎么办？实验二： 比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度一、 实验目的学会比浊法测定发酵液中以单个细胞的分离形式存在的微生物浓度的方法。二、 实验原理大肠杆菌和酵母菌等在发酵液中以单个细胞的分离形式存在的微生物可以采用测定浊度的方法确定菌浓。具体方法是将发酵液适当稀释后，使用可见分光光度计在波长600660nm下测量发酵液吸光度，为了保证测定的准确性，吸光度值应在0.20.7之间，可以通过适当稀释发酵液来实现。三、 器材与试剂培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5,pH7.2摇瓶装量20%。37摇床恒温培养1012h。分析测定仪器：可见分光光度计四、 实验操作1. 取10支试管，分别在其中加入5ml，2.5ml，1.0ml，0.5ml，5、0.1ml大肠杆菌培养液。每支重复一次。2. 顺序在其中加入0ml，2.5ml，4.0ml，4.5ml，4.9ml去离子水，分别稀释1、2、5、10、50倍。3. 以去离子水为参比，在波长600nm比色，测定吸光度值。五、 数据记录读取并记录每一次数据。稀释倍数 1 2 5 10 50A600A600稀释倍数计算：菌浓= A600稀释倍数实验三：测定菌体干重一、 实验目的学会测定菌体干重的方法，以及分析菌体干重与比浊法测定的吸光度之间的关系。二、 实验原理在不含固体的培养液中培养微生物，发酵液中的固体全市菌体，因此可以首先离心得到湿菌体后，用适当的方法干燥，得到干菌体的量可直接反映菌体生长的多少。三、 器材与试剂培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5,pH7.2分析测定仪器：恒温干燥箱，分析天平四、 实验操作1. 将2个干燥的10ml离心试管放入95烘箱烘2h取出，放入干燥器，待试管冷却后称重得到m空1，m空22. 在两试管中分别准确加入10ml发酵液，注意发酵液需摇匀。3. 放入离心机离心，3000r/min，离心15min，注意：离心之前要将预离心的试管平衡并对称放入离心机，以免损坏离心机。4. 同时测定该发酵液的A600值。5. 离心毕，拿出试管，弃去上清液，将试管和其中的菌体放入95烘箱烘干12h。6. 取出试管，放入干燥器，待冷却后称重，得到m菌1，m菌2。五、 数据记录记录：m空1，m空2, m菌1，m菌2, A600计算：m空均=（m空1+ m空2）/2 m菌均=（m菌1+ m菌2）/2菌体干重= m菌均- m空均 单位菌体干重=菌体干重1000/10（g/L）菌体干重除以A600即得到二者的对应关系。在测定发酵过程的菌浓变化时，只要测得A600就可以计算出菌体干重。实验四：发酵过程中糖的利用一、 实验目的1. 了解发酵过程中碳源的利用规律。2. 掌握用邻甲基苯胺法测定糖含量的方法。二、 实验原理糖类是微生物生命活动中主要的碳源和能源物质。一方面，微生物的生长需要糖类，另一方面，糖也构成了代谢产物中碳架的主体。所以在发酵过程中，糖的消耗是一项重要的生理指标，是判断发酵进程的主要依据。糖的定量测定方法很多。如斐林试剂法、碘量法、蒽酮比色法、3,5-二硝基水杨酸法等，它们各有优缺点。本实验采用邻甲基苯胺法测定。该法的特点是反应灵敏，操作简便，结果准确，稳定性好。邻甲基苯胺是一种芳香族伯胺，可与醛基反应生成希夫碱。在酸性溶液中，邻甲基苯胺与葡萄糖的醛基作用，生成葡萄胺和相应希夫碱的混合物。这一混合物呈绿色，颜色稳定，其深浅与葡萄糖的浓度呈正比，在一定范围内符合比耳-朗伯特定律，因此可用于测定还原糖的含量。三、 实验器材和试剂1. 器材721分光光度计，移液管，容量瓶，试管等。2. 试剂（1） 标准葡萄糖溶液：取分析纯葡萄糖置于105烘箱干燥2h，精确称取20mg，溶解后置于100ml容量瓶内，用蒸馏水定容至刻度，配成0.2mg/ml的标准溶液；（2） 邻甲基苯胺试剂：称取硼酸0.65g,溶于温热的210ml冰醋酸中，再加入1.25g硫脲，充分溶解后加入邻甲基苯胺37.5ml,用冰醋酸定容至250ml，储存与棕色瓶内；（3） 2mol/l HCl和2mol/l NaOH。3. 发酵液四、 实验步骤1. 葡萄糖标准曲线的制作（1） 取干净试管6支，按下表加入各溶液；（2） 将各试管内溶液摇匀，套上试管帽，置于沸水浴中加热10min；（3） 取出，用流水冷却至室温；（4） 用分光光度计在波长635nm下比色，读取吸光度，将结果填入表中；（5） 以吸光度为纵坐标，糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。葡萄糖标准曲线的制作管号12 34 5 6 葡萄糖/mg标准葡萄糖溶液/ml 蒸馏水/ml邻甲基苯胺试剂/mlA635002.040.05 0.251.754 0.10.51.540.21.01.040.31.50.54 0.42.0042. 发酵液含糖量的测定（1） 酸解：如果发酵培养基内含有双糖或多糖，应先将它们水解成单糖，然后进行测定。测定时发酵液先用滤纸过滤。取发酵中的发酵滤液2ml，置于干净试管中，加入2mol/l HCl 2ml，摇匀，套上试管帽，置于沸水浴内水解25min,使双糖或多糖水解为单糖；（2） 稀释：水解液用2mol/l NaOH调至中性，然后全量倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水冲洗水解液，合并洗液，并定容至刻度，充分摇匀；（3） 显色：吸取稀释后的水解液2ml，置于干净试管中，再加入邻甲基苯胺试剂，充分摇匀，套上试管帽，置沸水浴加热10min。取出后用流水冷却至室温；（4） 比色：以2ml蒸馏水代替水解液作对照管，在635nm波长下测定吸光度；（5） 计算:根据样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖毫克数，然后按下列公式算出每100ml发酵液中的含糖量。发酵液含糖量（g/100ml）=(AN)/(V1000)100式中：A为由吸光度查标准曲线所得糖毫克数； N为样品稀释倍数； V为测定时所取的样品毫升数。五、 注意事项1. 葡萄糖必须经过干燥才能配成标准溶液，否则误差较大。2. 试管必须洗干净，不能留有残糖。实验五：淀粉酶产生菌的初筛一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。二、 实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域具有广泛的用途。可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。本实验以淀粉酶产生菌的筛选为例，介绍发酵菌种的初步筛选。三、 实验器材与试剂1.菌株土壤、水、湖泊沉积物或其他富含微生物的样品2.培养基（1）淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.2%，琼脂2%，pH7.27.4（2）高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g ,K2HPO4 0.5g ,MgSO47H2O 0.5g ,NaCl 0.5g,FeSO47H2O 0.01g,琼脂20g，加水至1000ml，pH7.27.43.器材高压蒸汽灭菌锅，恒温干热灭菌箱，超净工作台，天平，电炉，1 mol/L HCL, 1 mol/LNaOH, pH试纸、量筒，玻棒，三角瓶，玻璃珠，试管，培养皿，移液管等四、 实验步骤1. 培养基的制备通过称量、溶解、调节pH等步骤，配制上述培养基，并配制45ml无菌水（内装几颗玻璃珠）一瓶，4.5ml无菌水若干支，0.1MPa灭菌30min后备用；另包扎好培养皿、移液管和涂布棒等，灭菌，烘干备用。2. 倒平板将灭菌后的培养基冷却至5060，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干的培养皿中，每皿约20ml。为了防止非目的菌株的生长，可在细菌和放线菌培养基中加入制霉菌素使之达到100mg/L，以抑制真菌生长。冷却凝固待用。3. 微生物分离（涂布法）（1） 称取样品5g，放入装有45ml无菌水的三角瓶中，震荡10min，即为10-1的土壤稀释液。（2） 取4.5ml无菌水4支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。（3） 去10-1的稀释液，震荡后静止2min,用无菌移液管吸取0.5ml上层细胞悬液加至装有4.5ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液。同法依次稀释至10-3、10-4、10-5稀释液。在稀释过程中，因从高浓度到低浓度，每稀释依次应更换一支移液管。（4） 另取移液管，分别以无菌操作法吸取10-5，10-4，10-3的稀释液0.1 ml，加至制备好的平板上，用涂布棒涂布均匀。从低浓度到高浓度，可以用同一根移液管或涂布棒。（5） 将培养皿倒置培养于恒温培养箱中，30培养57d后观察。（6） 根据菌落形态特征，挑取有代表性的单菌落，在相应的培养基平板上划线，直至得到纯培养。纯化后的菌株应及时转接到斜面培养基上保存。4.分离纯化的菌株可点种与淀粉培养基平板上（每皿点种5点），形成菌落后，在平板上滴加卢哥碘液，以铺满平皿为度，如果菌落周围有透明圈出现，说明淀粉被水解，该菌能产生淀粉酶，透明圈与菌落直径之比越大，说明淀粉酶活力越强。五、思考题分离设计时应怎样安排较为合理，是多皿一次分离为佳，还是少皿多次为佳？实验六：淀粉酶活力测定一、 实验目的1. 掌握分光光度法测定液化性淀粉酶活力的基本原理和方法。2. 从初筛所获的菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。二、 实验原理淀粉酶（amylase）是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括淀粉酶，淀粉酶，糖化酶和异淀粉酶。淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化性淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定淀粉酶活力。三、 实验器材与试剂1. 菌种实验五中筛选到的淀粉酶产生菌。2. 培养基（w/v）豆饼粉5%，玉米粉7%，Na2HPO4 0.8%,(NH4)2SO4 0.4%,NH4Cl 0.15%,用自来水配制。250ml三角瓶中装培养基25ml，8层纱布封口，0.1MPa灭菌30min。3. 试剂（1） 碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中；（2） 比色用稀碘液：取原碘液2ml，加碘化钾20g,用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中；（3） 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g,用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml。需当天配制。（4） pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml;（5） 标准糊精溶液：称取纯糊精0.06g，悬浮于少量水中，调匀后倾入90ml沸水中，冷却后加水定容至100ml。加几滴甲苯防腐，冰箱保存；（6） 0.5mol/l乙酸溶液，0.85%生理盐水。4. 器材恒温水浴锅、白瓷板、分光光度计等。四、 实验步骤1. 摇瓶培养挑取经活化后的斜面菌苔3环，悬于5ml无菌生理盐水中，吸取0.5ml接入上述培养基中，30摇瓶培养（180r/min）。每隔8h取出一瓶，将发酵液过滤后直接作为粗酶液。2. 酶液稀释用pH6.0缓冲液将粗酶液做适当稀释。3. 标准曲线的制作（1） 将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；（2） 吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，再加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40水浴保温5min；（3） 加蒸馏水1ml，40保温30min后加入0.5mol/l乙酸10ml;（4） 吸取反应也1ml，加稀碘液10ml，混匀，在660nm下测得吸光度A（用2.0ml蒸馏水代替步骤（2）中的淀粉稀释液作为对照）（5） 以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。4.淀粉酶活力测定 用2%可溶性淀粉溶液按3（2）操作，用稀释后的粗酶液1ml代替3（3）中的蒸馏水，测得吸光度A660，从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。液化性淀粉酶活力测定管号1 234567（样品）淀粉稀释液/ml缓冲液/ml蒸馏水/ml粗酶液/ml稀碘液/mlA660211010211010 2110102110102110102110102101105.酶活力计算酶活力以每毫升粗酶液在40，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。五、 注意事项1. 淀粉一定要用少量冷水调匀后，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。2. 酶液应进行适当稀释。实验七：生产菌株发酵条件优化一、 实验目的1. 了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子实验找出筛选所得菌株的最佳发酵条件。2. 掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。二、 实验原理发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH、培养温度和通气状况是三类主要的发酵条件。培养基pH一般指灭菌前的pH，可通过酸碱调节来控制，由于发酵过程中pH会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节；通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，另外，瓶口布得厚薄也会影响到氧气的传递，为了防止杂菌污染，瓶口布以8层纱布为好。发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮量高，还应增加培养基中的氮源比例。但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压太高，又反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可考虑用流加的方法逐步加入碳氮源。培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。选择碳源时常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉，而用豆饼粉、黄豆粉等作为氮源；此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基的优化实验。发酵培养基中的原料是大分子物质，微生物一般不能直接吸收，必须通过胞外酶的作用后才能被利用，所以用一些“迟效性”营养物质。而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖，可适当在培养基中添加一些速效营养物。三、 实验器材与试剂1. 菌种筛选得到的菌种2. 培养基（1） 蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.2%，琼脂2%，pH7.27.4（2） 发酵培养基：由可溶性淀粉作为碳源，黄豆饼粉、蛋白胨和酵母膏作为复合营养源，它们的配比根据正交实验确定，另加0.5%磷酸氢二钾，0.05%氯化钠和0.05%硫酸镁作为无机矿质元素，调节pH至7.2四、 实验步骤1. 培养基初始pH对发酵的影响将种子培养基配好，用酸碱分别调节培养基pH至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分装至250ml三角瓶中，灭菌。冷却后接种，通过测定相应的数值确定生产菌的最佳培养基pH。2. 培养温度对发酵的影响接种后的三角瓶在25、30、35、35、40、45下培养，通过测定相应的数值确定生产菌的最佳培养温度。3. 培养基装液量对发酵的影响在250ml三角瓶中分装培养基，装量分别为20ml、25 ml、30 ml、35 ml、40 ml，分装，灭菌，接种后培养。通过测定相应的数值确定生产菌的最适培养基装量。4. 摇床转速对发酵影响接种后在150r/min、180 r/min、210 r/min、240 r/min培养。通过测定相应的数值确定生产菌的最适摇床转速。5.最适培养基配方的正交实验（1）将可溶性淀粉作为碳源，黄豆饼粉、蛋白胨和酵母膏作为培养基的主要影响因素，每一因素设定3个水平，按下表配制9组培养基，另加入0.5%磷酸氢二钾，0.05%氯化钠和0.05%硫酸镁，分装于250ml三角瓶中，每瓶25ml。包好灭菌。发酵培养基优化用四因素三水平正交实验表组别因素A淀粉因素B黄豆饼粉因素C蛋白胨因素D酵母膏测定值115%13%10.2%10.4%215%25%20.4%20.6%315%37%30.6%30.8%427%13%20.4%30.8%527%25%30.6%10.4%627%37%10.2%20.6%739%13%30.6%20.6￥839%25%10.2%30.8%939%37%20.4%10.4%（2）接种（3）发酵（4）取下摇瓶测定，确定最佳培养基配方。实验八：发酵污染的检测与判别一、 试验目的1. 了解发酵染菌的危害。2. 学习检测发酵污染的基本方法。二、 实验原理微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。规范了管理措施，涉及了一系列设备和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。但是某些发酵工业还遭受着染菌的危胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒灌”，不但浪费了大量原材料，造成严重经济损失，而且还污染了环境。及早发现染菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。因此检查方法要求准确、快速。发酵污染可发生在各个时期。种子培养期染菌的危害最大，应严格防止。一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子灌及其管道进行彻底灭菌。发酵前期营养丰富，容易染菌，应将发酵液补足营养后迅速灭菌，并重新接种发酵。发酵中期染菌由于营养已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。如果发酵后期染菌，此时产物已积累较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重可继续发酵；若污染严重，可提前放罐。三、 实验器材与试剂1. 培养基（1） 营养琼脂培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH7.2；（2） 葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨0.8%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，1%酚红溶液0.4%，pH7.22. 器材：显微镜，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台等。四、 实验步骤1. 显微镜检查（1） 用无菌操作方式取发酵液少许，涂布在载玻片上；（2） 自然风干后，用番红或草酸铵结晶紫染色1-2min，水洗；（3） 干燥后在油镜下观察。如果从视野中发现有与生产菌株不同形态的菌体则可认为是污染了杂菌。2. 平板检查（1） 配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板；（2） 取少量待检发酵液经稀释后涂布在营养琼脂平板上，在适宜条件下培养；（3） 观察菌落形态若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察。3. 肉汤培养基检查法（1） 配制葡萄糖酚红肉汤培养基；（2） 将上述培养基装在吸气瓶中，灭菌后，置37培养24h，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，可用于杂菌检查；（3） 把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变浑，表明空气中有细菌，应检查整个过滤系统，若培养液未变浑浊，说明空气无菌。此法可用于空气过滤系统无菌检查。4. 发酵参数判断法（1） 根据溶解氧的异常变化来判断（2） 根据排气中CO2含量的异常变化来判断。（3） 根据pH的变化及菌体酶活力的变化来判断。五、思考题是否可用营养肉汤代替葡萄糖酚红肉汤培养基进行空气过滤系统及培养基的无菌检查？为什么？实验九：乳酸菌的分离纯化与鉴别一、 实验目的初步掌握乳酸菌分离的一般方法。二、 实验原理乳酸菌的细胞形态为杆状或球状，一般没有运动性，革兰氏染色阳性，微需氧、厌氧或兼性厌氧，具有独特的营养需求和代谢方式，都能发酵糖类产酸，一般在固体培养基上与氧接触也能生长。酸乳风味的形成与乳酸菌发酵过程代谢的多种物质有关，而这些物质的产生与发酵速度等活力指标有密切关系。乳酸菌的活力可由多种参数确定，如细胞生长情况，细胞干重和光密度（OD值）等。由于乳液不透明，不能直接测OD值，可用NaOH和EDTA处理使其澄清后再测。较简便的活力测定包括凝乳时间，产酸和活菌数量等指标的检测。三、实验器材与试剂1实验材料 市售酸奶、鲜牛奶。2培养基（1） BCG牛乳培养基A）溶液： 脱脂乳粉100g，水500Ml，加入1.6%溴甲酚绿（B. C. G）乙醇溶液1mL，80灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8，121湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。（2）乳酸菌分离培养基：牛肉膏 5 g，酵母浸膏 5 g，蛋白胨 10g，葡萄糖10g，乳糖5 g，NaCl 5 g, 琼脂20g , 水1000Ml ，调pH值为 6.8，121，灭菌20分钟后倒平板。3 实验设备 超净工作、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜显微镜、碱式滴定仪、天平、培养皿、移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接种针、载玻片等。四、实验方法与步骤1.分离：取市售新鲜酸乳液稀释至10-5，取其中的10-4 10-5 2个稀释度的稀释液各0.1-0. 2mL，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接灌注法分离，置40培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。2.鉴别选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40培养8-24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），保加利亚乳杆菌呈杆状，单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌呈球状，成对、短链或长链状。革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。3 观察与测定（1）观察： 观察并记录各试管的凝乳时间。（2）酸度测定：用NaOH滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度。（3）计数：采用倾注平板法，测定活菌数量。五、实验结果1、比较凝乳时间、滴定酸度和活菌数量，确定菌种活力。2、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的分离需要使用何种培养基？实验十：酸乳及酸乳饮料的制作一、 实验目的了解酸乳的制作方法二、 实验原理酸乳是牛奶经过均质、消毒、发酵等过程加工而成的。酸乳的品种很多，根据发酵工艺不同可分为凝固性酸乳和搅拌型酸乳两大类。凝固型酸乳在接种发酵菌株后，立即进行包装，并在发酵容器内发酵、成熟。搅拌型酸乳先在发酵罐中接种、发酵，发酵结束后再进行无菌罐装并后熟。嗜热乳酸链球菌和保加利亚乳杆菌是两类最常用的酸乳发酵菌种。近年来，人们又将双歧乳酸杆菌引入酸乳制造，使传统的单株发酵，变为双株或三株共生发酵。双歧杆菌菌体尖端呈分枝状，是一种无芽孢革兰氏阳性厌氧菌，最适生长温度3741，最适生长pH6.57.0，能分解糖产酸，不产CO2。双歧杆菌产生的双歧杆菌抑菌素对肠道中的致病微生物具有明显的灭杀效果，双歧杆菌还能分解积存于肠胃中的致癌物N-亚硝基胺，防治肠道癌变，并能促进免疫球蛋白的产生，提高人体免疫力，使酸乳在原有的助消化、促进肠胃功能的基础上，又具备了防癌和抗癌的保健效用。三、 实验器材与试剂1. 原料市售酸乳或其他乳酸菌活菌制品、脱脂奶粉、全脂乳粉或鲜牛奶、蔗糖等。2. 器材恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、一次性塑料杯、培养皿、试管、三角瓶等四、实验步骤1.基料配制将全脂乳粉、蔗糖和水以10：5：70的比例混合。2.菌种扩大 将分离到得嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌用上述培养基进行扩大培养。3.巴氏杀菌通常在6065下保持30min。4.牛乳冷却牛乳经巴氏杀菌后用水冷却，至4045时接种。5.接种经培养好的嗜热乳酸链球菌+保加利亚乳杆菌及其等量4菌混合菌液以5% 的接种量分别接入上述培养基料中，摇匀。 6.罐装和发酵若要生产凝固型酸乳，接种后应立即分装到已灭菌的酸乳瓶或一次性塑料杯中，以保鲜膜封口；将接种后的酸乳置于40恒温箱中培养至凝乳块出现（约34小时），然后转入4冰箱中后熟（24小时以上），使酸度适中，凝块均匀细腻，无乳清析出，色泽均匀，无气泡，获得较好的口感和特有风味。7.品尝乳酸菌类 凝乳情况 口感 香味 异味 pH 结论球菌杆菌球杆菌混合（1：1）五、思考题酸乳发酵过程中为什么会引起凝乳？实验十一 发酵设备的原理及其使用一. 实验目的1. 掌握发酵设备工作原理2. 能够单独操作使用机械搅拌发酵罐二. 实验原理发酵工程的目的是利用微生物进行生产或某些生物处理。在生物过程中，反应器具有中心的作用，它既是连接原料和产物的桥梁，也是多种学科的交叉点。在反应器中，通过产物的合成，廉价的原料升了值。因此，发应器的设计和操作则是发酵工程中的一个重要问题，它对产品的成本和质量有着很大的影响。发酵设备必须具有适宜于微生物生长和产物形成的各种条件，促进微生物的 新陈代谢，使之能在低消耗下获得高产量。因此，优良的发酵设备应具有严密的结构，良好的液体混合性能，较高的传质、传热速率，同时还应具有配套而又可靠的检测及控制仪表。判断发酵设备好坏的唯一标准应是能否适合工艺要求，以获得最大的生产效率。另外，由于发酵采用的菌种不同，产物不同或发酵类型不同，发酵条件又各不相同，应根据发酵过程的特定和要求来设计和选择发酵设备的型式和结构。对微生物反应器设计的基本要求 1. 避免将需蒸汽灭菌的部件与其它部件连接，因为即使阀门关闭，细菌也可在阀门内生长； 2. 尽量减少法兰连接，因为设备震动和热膨胀会引起连接处的移位，导致染菌。应全部焊接结构（焊接部位磨光），消除积蓄耐灭菌物质。3. 防止死角、裂缝等一类情况，以避免固体物质在此堆积，形成使杂菌获得热抗性的环境； 4. 发酵系统的某些部分应能单独灭菌； 5. 与反应器相通的任何连接能应采用蒸气加以密封，如取样口在不取样时也要一直通蒸气； 6. 所有阀门要易清洗、易使用、易灭菌，球阀、隔膜阀和截止阀比较好； 7. 反应器应始终保持正压以排除渗漏； 8. 为了便于清洗，反应器主体应尽量简单。三. 发酵设备结构： 四. 发酵设备操作方法1. 使用前1) 检查所有阀门螺帽是否拧紧2) 下位机电源接通3) 打开总水源开关，打开蒸汽发生器电源4) 空气压缩机电源待空消时再打开2. 空气过滤系统的空消1) 关闭“进水阀” 2) 打开“罐底总阀”、“夹层排污阀”和“罐底排污阀”，放净罐内水分3) 关闭“进气总阀”，开“空气蒸汽阀” 4) 打开“一级过滤排污阀”、“二级过滤排污阀”、“三级过滤排污阀” 5) 打开“通风排气阀”和其上的“小阀”，这时观察压力表的指数，当压力升至0.1MPa时，控制进蒸汽或出气阀来维持压力2030分钟6) 打开空气压缩机电源7) 空消结束后，先关“通风排气阀”和“小阀”，再关三个“过滤排污阀”和“空气蒸汽阀” 8) 保证压强不要降为零，打开“进气总阀”，三个“过滤排污阀”和“通风排气阀”用空气吹10分钟，吹干管内水分，而后关掉所有排气阀三个“过滤排污阀”和“通风排气阀”，进行保压。（注：减压阀也称油水分离器顺时针压力大，逆时针压力小。） 3. 罐体空消1) 关闭“罐底排污阀” 2) 打开“罐体蒸汽阀”、“罐底总阀”和“罐底蒸汽阀” 3) 打开“罐顶排气阀1”（注意要拔下塑料管）、“罐顶排气阀2”、“罐顶排气阀3” 4) 观察温度与表压，通过控制“罐体蒸汽阀”、“罐底蒸汽阀”或“灌顶排气阀”来控制压强维持在0.1MPa，30分钟5) 结束罐体空消时，直接关闭“罐体蒸汽阀”、“罐底蒸汽阀”，其他不动。使压力降为零。6) 加入pH探头和溶氧探头（注：pH探头需校正两点pH之后，再安装进去；溶氧探头隔一段时间校正100%） 7) 关“罐底总阀” 8) 自进料口向罐内倒入培养基（注：培养基配制时需考虑冷凝水的量）。4. 罐体实消A. 夹层预热12 1) 开“夹层排污阀”、“夹层进蒸汽阀” 2) 点击“生产”使搅拌开始3) 观察罐内液体温度，待上升至90C，关闭“夹层进蒸汽阀” B实消4) 开“罐体蒸汽阀”、“罐底蒸汽阀”和“罐底总阀”（注：罐底总阀不要开得过大，以免难以控制压强的大小。） 5) 打开“通风排气阀”上的“小阀” 6) 通过调节进或出气阀来维持压强在0.1MPa，30分钟7) 实消结束后，先发“小阀”，再关“排气阀1、2、3”，同时关“罐体蒸汽阀”和“罐底蒸汽阀”。5. 接种发酵1) 点击“发酵”，打开“进水阀”，关“夹层排污阀”，此时自动降温至设定温度2) 通气，开“通风排气阀”进行保压在0.05MPa左右3) 待温度稳定后，开始接种，点击“停止”来停止搅拌，调节“通风排气阀”使压强降低到0.01MPa，开始接菌。4) 接上排气塑料管，调节“流量控制阀”，在“发酵”状态下，点“生产”（注:此时罐压一般在0.05MPa，且出气也能达到要求）。6. 排料1) 点“停止”，并使下位机处于“灭菌状态”，保证所有仪器都不工作了，进行放料。2) 关进气阀3) 洗罐，擦干罐体4) 拔掉下位机、蒸汽发生器和空气压缩机的电源5) 关闭水源五要求： 1掌握发酵罐的原理，能够独立完成发酵罐的操作，包括：空消和实消，掌握发酵罐的控制技术。实验十二：反应器电极的使用一 目的要求分别了解pH电极和溶氧电极（DO）的结构和基本原理；掌握pH电极和溶氧电极的校正方法。二 实验内容pH和溶氧（DO）是发酵中重要的调控参数，它的准确与否直接影响发酵过程能否正确反映。每次上罐前都需要对pH电极和溶氧电极（DO）进行标定。所以十分有必要了解两种电极的正确标定方法。三 主要仪器设备及试剂pH电极 溶氧电极 标准缓冲液 无水亚硫酸钠四 操作步骤4.1 pH电极标定根据发酵过程的pH变化的范围偏酸还是偏碱来选择缓冲液，如果发酵过程pH值大部分在6.0以下，则用6.86和4.00两点来标定。4.1.1零点标定：通电30min后，将电极从缓冲液中取出，用蒸馏水冲洗干净，拿吸水纸吸干，然后插入6.86的零点缓冲液中，并将零点的值设为6.86，待显示基本稳定不变后，根据控制器的操作步骤，确认pH零点“标定开始”；等到pH值稳定后确认pH零点“标定结束”。此时测量值显示变为输入的零点值。4.1.2斜率标定 将电极从6.86的零点缓冲液中取出，用蒸馏水冲洗干净，拿吸水纸吸干，然后插入4.00的零点缓冲液中，并将零点的值设为4.00，待显示基本稳定不变后，根据控制