试谈我国榉树组织培养研究进展.doc

试谈我国榉树组织培养研究进展育龙网校 WWW.CHINA- B.C0M 2009年05月07日来源： 互联网育龙网核心提示： 论文关键词：榉树；组织培养；研究进展论文摘要：榉树具有较高的经济、生态、景观利用价值，市场需求量极大，野生资源已日趋枯竭。利用组-论文关键词：榉树；组织培养；研究进展论文摘要：榉树具有较高的经济、生态、景观利用价值，市场需求量极大，野生资源已日趋枯竭。利用组织培养技术对榉树进行快速繁殖是势在必行的。文章对国内榉树组织培养研究进展概况进行了综述，指出了榉树组织培养过程中存在的一些问题，提出了部分建议。引言榉树，又叫大叶榉，属于榆科榉属中，榉树被列为国家二级重点保护的野生植物。组织培养是优良树木得以大量繁殖的有效方式。到目前为止，已对大量的林木树种进行了组织培养的研究，少数树种已进入到工厂化生产阶段。在我国，桉树和杨树的快速繁殖技术已经用于工厂化生产，并产生了显著的经济效益。国内对榉树的研究主要是集中在栽培和生物学特性方面。据道，目前国外只有日本福冈县林业中心成功的进行了榉树的组织培养研究。在国内，金晓玲等对榉树的生物学特性和微繁技术进行了初步的研究，取得了一定的进展。1.植物组织培养技术概况植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的环境里培养成完整的植株。植物组织培养的依据是植物细胞“全能性“及植物的“再生作用“。1.1植物组织培养的用途植物组织培养的用途可分为四大类：第一类是，利用植物组织培养技术可以对植物体进行体外无性快速繁殖；第二类是，大规模细胞培养可以用来生产次生代谢物质；第三类是，用于育种，如花药、花粉培养产生单倍体，胚乳培养产生三倍体，胚培养拯救杂种胚，原生质体培养进行体细胞杂交等；第四类是，用于理论研究，如将植物组织培养应用于植物生理学、病理学、胚胎学、细胞与分子生物学等的研究。1.2植物组织培养的基本过程1.2.1外植体材料的选取对大多数种子植物来说，茎尖是最好的部位，但往往受到材料来源的限制，为此茎段也得到了彻底的应用，而叶片的培养利用更为普遍，材料来源也较丰富。子叶和下胚轴的培养对于难培养的植物很有效。选材时应注重选取带菌少、生长时间短、生长旺盛的材料，还应注重取材的时期。大多数植物应在生长开始的季节进行采样，生长末期或休眠期的外植体对诱导反应迟饨。1.2.2材料的灭菌处理从田间或温室等地切取材料时，应选择健壮无病虫母株，取幼嫩、分生能力强的部位，以利生长。取来的材料虽经选择，外部总还有不少杂菌。为此，接种前应进行表面灭菌。经过表面灭菌的材料，用无菌滤纸将水吸掉，再用解剖刀切取所需部位，然后将材料接种到培养基上。1.2.3脱分化阶段将培养好的无菌材料接种到诱导培养基中进行培养。在此阶段中，可根据不同的需要，接种到不同的培养基上，可以进行愈伤组织、不定芽等的诱导，从而进行不同途径的培养。诱导培养基一般选MS培养基作为基本培养基，再配合一定比例的细胞分裂素和生长素。1.2.4分化阶段此阶段是将脱分化阶段产生的愈伤组织或不定芽，接种到诱导分化培养基上，诱导分化。诱导分化阶段仍以MS作为基本培养基，再加入一定的激素配制。1.2.5壮苗生根将分化阶段产生的大芽接种到合适的壮苗培养基中，便可长成健壮的无根苗了。健壮的无根苗长成后，将其转入生根培养基中。生根培养基多以1/2MS培养基作为基本培养基，再配合一定比例的激素进行配制。1.2.6移栽生根苗的移栽是组织培养育苗的重要一环，只有移栽成活才能达到快速育苗的目的。为此，将已生根的瓶苗移出进行炼苗，应注重调控光线与温度。炼苗结束后，将其移栽到保水、透气性好的基质或苗床土中。2.植物组织培养技术在林木中的应用利用植物组织培养技术，在林木中的应用主要有：优良遗传材料的快速繁殖；脱毒良种苗的培养和无病毒苗的大量繁殖：主要利用茎尖培养以脱除病毒。到目前为止，已有大量的林木树种进行了组织培养的研究。据不完全统计，通过器官发生和体细胞胚发生途径获得再生植株的阔叶树己有22属120种，针叶树有12属63种。桉树和杨树的快速繁殖技术已经用于工厂化生产，并产生了显著的经济效益。但从总体上看，研究主要集中的少数几个属，如阔叶树中，桉属、杨树属、金合欢属和泡桐就有95种，约占80%；针叶树则主要集中在杉属和松属，约占81%。3.我国榉树组织培养的研究进展国内对榉树的研究主要集中在栽培和生物学特性方面。傅松玲、郑兴林研究了皖东石灰岩山地榆科树种的生理特性，曾胜虞、李淑琴等研究了榉树丰产育苗的方法和技术要点，张立军、周丽君等研究大叶榉人工栽培技术，刘德良、曾松青等先后研究了榉树扦插繁殖实验 为了解决榉树资源濒危的现状，利用植物组织培养进行榉树的快速繁殖，提供大量优良无性系苗木是势在必行的。植物组织培养获得器官再生苗有两条途径：一是，外植体通过器官发生途径直接诱导形成不定芽或侧芽，再通过诱导生根而成苗；另一种是，外植体先脱分化诱导愈伤组织，然后由愈伤组织分化形成再生植株。目前，国内只有金晓玲等通过以上两种途径对榉树的组织培养技术进行了一定的研究。金晓玲等在大叶榉愈伤组织的诱导中发现，外植体的来源、培养基的种类、激素的种类和体积质量、光照等因素都直接影响着愈伤组织的数量和质量，而愈伤组织的数量和质量又直接影响不定芽、不定根的分化和增殖速度。在器官发生途径方面，金晓玲等以榉树的茎尖作为实验材料，对不定芽的诱导、增殖以及生根进行了研究。研究发现，植物激素的种类和浓度对榉树茎尖不定芽的分化和诱导生根有重要影响。细胞分裂素BA，生长素NAA适合榉树茎尖不定芽的分化；生长素IBA对诱导榉树小苗生根有一定效果。4.问题与讨论到目前为止，榉树的组织培养的基础性研究已经取得了一定的进展，但仍然存在许多问题。在榉树的组织培养过程中，通过诱导愈伤组织途径进行植株再生，效果并不十分理想。在诱导愈伤过程中，褐化现象较为严重，添加抗氧化剂后，仍会出现轻度褐变，并不能完全抑制褐变的产生。在榉树茎尖培养过程中，以MS作为基本培养基，轻易产生缺氮的症状，并且枯死率较高，不定芽的诱导率也不高。现阶段，对榉树的研究还仅限于实验室阶段，并且还有很多问题没有解决，还未真正投入到工厂化生产中。因为林木的组织培养在实际生产中的应用仍然受到很多的限制。主要的原因有两个，一是林木的生长速度较慢，次生代谢产物积累多，在组织培养过程中经常会出现褐化和玻璃化现象。二是植物组织培养再生植株的有效率偏低，使得繁殖技术难以满足实际生产的需求。榉树的生物学特性决定了它的生长速度较慢，直接获得外植体比较困难，污染率也不轻易控制。若以种子作为外植体，可能会有一定的优势，这将成为我们下一步要进行的探索研究。榉树的组织培养可以为榉树遗传改良和选育优良新品种提供技术基础，还可以为保护榉树资源提供新的研究思路和技术。但是在研究过程中还有许多问题亟待解决，针对这些问题，我们接下来要进行以下研究：首先，我们要针对愈伤组织的分化成不定芽的效率不高的问题，继续筛选发掘更合适的培养基和诱导方法。其次，对于在MS培养基上进行不定芽诱导过程中出现的缺氮现象，要进行基本培养基的改良，或是找到一种合适的处理方法，缓解这种现象的产生，提高成活率。参考文献中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志北京：科学出版社，1999李淑琴.榉树的育苗方法.2000，6263.潘晓东，榉树大树移栽技术.蓝天园林，2000，188211.桂耀林，猕猴桃离体茎段愈伤组织的诱导和植株再生.植物学，1979，213841.唐巍、欧阳藩，松柏类植物组织培养形态发生研究评述.大自然探索，1997，603738，56.正文摘录: 我国榉树组织培养研究进展李晓璀.陈强。，陈芳。，马焕成(1西南林学院，云南昆明650224；2云南省林业科学院，昆明650204)PubljcScienc【摘要】：榉树具有较高的经济、生态、景观利用价值.市场需求量极大，野生资源已日趋桔竭。利用组织培养技术对榉树进行快速繁殖是势在必行的。文章对国内榉树组织培养研究进展概况进行了综述.指出了榉树组织培养过程中存在的一些问题，提出了部分建议。【关键词】：榉树；组织培养；研究进展中国分类号：87文献标识鸸：A文章编号：10026908但007)012001902引言榉树(Ze璇ovascj71nel(ienana)，又叫大叶榉.属于榆科(Ullnacea)榉属(zelkovaSpach)。在我国，榉树主要分布于辽东半岛至西南以东的广大地区。榉树材质优良，是珍贵的硬阔叶树种。榉树树冠广阔，树形优美，叶色季相变化丰富，病虫害少，又是重要的园林风景树种。榉树具有较高的经济、生态、景观利用价值，木材为珍贵用材，市场需求量极大，野生资源已日趋枯竭。在国家重点保护野生植物名录(第一批)中.榉树被列为国家二级重点保护的野生植物。组织培养是优良树木得以大量繁殖的有效方式。到目前为止。已对大量的林木树种进行了组织培养的研究.少数树种已进入到工厂化生产阶段。在我国。桉树和杨树的快速繁殖技术已经用于工厂化生产，并产生了显著的经济效益。国内对榉树的研究主要是集中在栽培和生物学特性方面。据报道.目前国外只有日本福冈县林业中心成功的进行了榉树的组织培养研究。在国内，金晓玲等对榉树的生物学特性和微繁技术进行了初步的研究.取得了一定的进展。1.植物组织培养技术概况植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的环境里培养成完整的植株。植物组织培养的依据是植物细胞”全能性”及植物的”再生作用”。1.1植物组织培养的用途植物组织培养的用途可分为四大类：第一类是。利用植物组织培养技术可以对植物体进行体外无性快速繁殖(即微繁)；第二类是，大规模细胞培养可以用来生产次生代谢物质；第三类是，用于育种，如花药、花粉培养产生单倍体，胚乳培养产生三倍体，胚培养挽救杂种胚，原生质体培养进行体细胞杂交等；第四类是，用于理论研究。如将植物组织培养应用于植物生理学、病理学、胚胎学、细胞与分子生物学等的研究。12植物组织培养的基本过程1.2.1外植体材料的选取对大多数种子植物来说，茎尖是最好的部位，但往往受到材料来源的限制，为此茎段也得到了彻底的应用，而叶片的培养利用更为普遍，材料来源也较丰富。子叶和下胚轴的培养对于难培养的植物很有效。选材时应注意选取带菌少、生长时间短、生长旺盛的材料.还应注意取材的时期。大多数植物应在生长开始的季节进行采样，生长末期或休眠期的外植体对诱导反应迟饨。1.2.2材料的灭菌处理从田间或温室等地切取材料时，应选择健壮无病虫母株，取幼嫩、分生能力强的部位，以利生长。取来的材料虽经选择，外部总还有不少杂菌。为此，接种前应进行表面灭菌。经过表面灭菌的材料，用无菌滤纸将水吸掉，再用解剖刀切取所需部位，然后将材料接种到培养基上。1_2.3脱分化阶段将培养好的无菌材料接种到诱导培养基中进行培养。在此阶段中，可根据不同的需要，接种到不同的培养基上，可以进行愈伤组织.不定芽等的诱导，从而进行不同途径的培养。诱导培养基一般选MS培养基作为基本培养基.再配合一定比例的细胞分裂素和生长素。1.2.4分化阶段此阶段是将脱分化阶段产生的愈伤组织或不定芽.接种到诱导分化培养基上，诱导分化。诱导分化阶段仍以MS作为基本培养基。再加人一定的激素配制。1.2.5壮苗生根将分化阶段产生的大芽接种到合适的壮苗培养基中，便可长成健壮的无根苗了。健壮的无根苗长成后.将其转入生根培养基中。生根培养基多以12MS培养基作为基本培养基，再配合一定比例的激素进行配制。1.2.6移栽生根苗的移栽是组织培养育苗的重要一环.只有移栽成活才能达到快速育苗的月的。为此。将已生根的瓶苗移出进行炼苗。应注意调控光线与温度。炼苗结束后，将其移栽到保水、透气性好的基质或苗床土中。2.植物组织培养技术在林木中的应用利用植物组织培养技术。在林木中的应用主要有：优良遗传材料的快速繁殖(良种快繁)；脱毒良种苗的培养和无病毒苗的大量繁殖：主要利用茎尖培养以脱除病毒。到目前为止.已有大量的林木树种进行了组织培养的研究。据不完全统计，通过器官发生和体细胞胚发生途径获得再生植株的阔叶树己有22属120种，针叶树有12属63种。按树和杨树的快速繁殖技术已经用于工厂化生产，并产生了显著的经济效益。但从总体上看，研究主要集中的少数几个属，如阔叶树中，桉属、杨树属、金合欢属和泡桐就有95种.约占80：针叶树则主要集中在杉属和松属.约占81。3.我国榉树组织培养的研究进展国内对榉树的研究主要集中在栽培和生物学特性方面。傅松玲、郑兴林研究了皖东石灰岩山地榆科树种的生理特性f11l，曾胜虞、李淑琴等研究了榉树丰产育苗的方法和技术要点f12】，张立军、周丽君等研究大叶榉人工栽培技术，刘德良、曾松青等先后研究了榉树扦插繁殖实验I，周文明等研究了榉树大树移栽技术.黄利斌等研究了榉树半同胞家系苗期性状变异的研究.赵旺兔等对榉树木材的发育解剖学进行了一系列的研究。但较系统和更深层次的研究报道却很少。在榉树组织培养方面的研究，只有金晓玲等做了一些初步的研究。目前，从国内的研究现状我们可以看出，对榉树的研究大部分是围绕着榉树的栽培进行的，其他方面的研究较少且不深入，特别是组织培养的研究，仍处于初级阶段。 附表MS、NitschH和NitschT培养基成分*铁盐：5.57克硫酸亚铁（FeSO47H2O）和7.45克乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶于1升蒸馏水中，用时每配1升培养基取5毫升。二、灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1、培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的