大肠杆菌磷酸转移酶系统蛋白-蛋白复合体的三维结构.doc

大肠杆菌磷酸转移酶系统蛋白-蛋白复合体的三维结构Alan Peterkofsky1*, Guangshun Wang2,Daniel S. Garrett2, Byeong Ryong Lee1,Yeong-Jae Seok3, and G. Marius Clore2*摘要大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸：葡萄糖磷酸转移酶系统（PTS）包括一系列负责在转移过程中从磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）向葡萄糖转移磷酸基团的蛋白质。磷酸载体蛋白之间以及与调节目标之间相互作用的机制适合用核磁共振光谱的方法研究。阐明了酶I的氮末端结构域和HPr之间以及HPr和酶IIAGlc之间的复合体的三维解的结构。HPr和酶I、IIAGlc和糖原磷酸化酶的结合界面的分析揭示出在这些相互作用中包含了一个在HPr上的共同表面。同样，在IIAGlc上的共同表面同HPr、IIBGlc和甘油激酶相互作用的表面。因此，一定存在一个为了蛋白蛋白相互作用并具有PTS特性的共同的基序。简介一些组成性的和可诱导的大肠杆菌葡萄糖转移系统由于在细胞膜存在特别的葡萄糖识别蛋白（通透酶）并且能影响同葡萄糖磷酸化相耦连的葡萄糖转移的过程而被定义(Postma et al., 1996)。磷酸基团的来源是细胞内的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。从能量的角度来看，PEP直接磷酸化通透酶的胞质组分是可能的。然而，这个过程是非常复杂的；有许多的胞质蛋白介导了从PEP到通透酶的磷酸转移（酶II）。酶I（EI）直接被PEP自身磷酸化，P酶I影响了通过磷酸载体蛋白HPr转移到酶II的磷酸转移。这个系统（PEP：葡萄糖磷酸转移酶系统，PTS）的复杂性很明显是由于PTS的多功能能力，除了催化糖基转移（见图.1）之外，它还调控其他的系统。因此，酶I可能通过磷酸化乙酰激酶来调控三羧酸循环(Fox et al., 1986)。有人认为HPr调控着糖原磷酸化酶的活性(Seok et al., 1997)。酶IHPr配合似乎在向化性的调控方面发挥着作用（Lux et al., 1995）。葡萄糖专一的酶II（IIAGlc）具有多种调节的相互作用。利用磷酸化的程度，它影响了腺苷酸环化酶、甘油激酶和非PTS通透酶的活性（Postma et al., 1996）。对于包含在通过PTS进行磷酸转移的过程以及PTS蛋白参与调控过程的机制的理解在很大程度上是通过蛋白组分的相互作用的种类的三维结构的可视化来实现的。人们已经利用X衍射晶体学和NMR对PTS的单个的蛋白（酶I、HPr、IIA）进行了广泛的特征分析。然而，除了甘油激酶IIAGlc复合体(Feese et al., 1994)，没有一个PTS蛋白和其他组分或者和调控配伍的复合体被成功的结晶。核磁共振（NMR）光谱学已经成功地被人们用于解决蛋白蛋白复合体的结晶中遇到的问题。酶I和HPr之间以及HPr和IIAGlc之间的氨基末端结构域的三维解已经成功地得到。这些PTS蛋白复合体的特性将在这里描述。酶IHPr复合体PTS的第一步包括由酶I的PEP产生的自身磷酸化。PEP的结合位点被定位在一个具有二个结构域的C端结构域中，而磷酸化的活性位点（His189）在N端结构域中（LiCalsi et al., 1991），磷酸化的酶I转移它的磷酸基团到HPr的活性位点His15。当含氨基末端的一半的酶I（EIN）可以被PEP自身磷酸化的时候，这个蛋白结构域保持反向转移一个磷酸基团到HPr的能力，表明同HPr残基的结合位点在EIN（Seok et al., 1996）。想要降低完整EIN晶体的结构一直都没有成功，但是EIN的结构已经被X晶体衍射(Liao et al., 1996)和NMR (Garrett et al., 1997a)解析了。EI或者EIN和HPr的混合物已经被用于共结晶试验，但没有成功。EINHPr复合体（40k Da）是到目前为止被NMR解析的最大的结构之一（Garrett et al., 1999）。这个结构测定采用了为了指定的目的以及为了特异地观察EIN和HPr之间的分子间核Overhauser增强（NOE）接触而利用的多种同位素标记（15N, 13C 和/或 2H）的蛋白质的组合去简化光谱的多维异核NMR光谱技术。此外，残基两极耦连技术也被用来提供对于决定复合体中两个蛋白的方向极为有用的长程定向信息。在图.2 中显示了两幅阐释整个复合体的丝带图。EIN包含两个亚结构域：结构域（33-143残基）显示为红色，是一个由H1、H2/H2、H3和H4四个螺旋组成的四螺旋束；/结构域（1-20和148-230残基），显示为蓝色，由四股平行的片层(1-4)组成的一个b三明治和一个三股反向平行的片层(1, 5, 6)组成；此外，还有一个长的C端螺旋（H8）作为同EI的C端结构域的连接。HPr包含三个螺旋和一个四股反向平行的片层。复合体中EIN和HPr的结构同在自由状态的非常相似。EIN同HPr的相互作用仅仅包括了EIN的亚结构域，这同前面的化学位移扰动作图是一致的（Garrett et al., 1997b）。图. 3显示的是这两个蛋白的接触的更为详细的汇总。在界面的地方一共有44个残基，其中21个来自EIN，另外23个来自HPr。这两个蛋白大部分的接触点都是疏水的。含有三个或更多分子间接触点的疏水残基是：EIN的Ala71、Ile72、Met78、Leu79、Leu115、Try122、Leu123、Arg126以及HPr的Thr16、Arg17、Ala20、Leu47、Phe48和Thr52。此外，还有11个分子间静电相互作用，包括两个侧链到骨架的氢键和六个盐桥。EIN的Tyr122的羟基和Arg126的胍基有氢键连接到了HPr的Leu14的骨架的羰基上。盐桥则分别包括EIN和HPr残基的如下配对：Glu67 和 Arg17, Glu68 和 Arg17, Glu74 和 Lys24, Asp82 和 Lys27, Glu84 和 Lys45 ，以及 Glu84 和 Lys49。此外，Asp82的羧基不仅仅参与分子间盐桥，同时，它也接受来自Glu84和Leu85的骨架氨基上的两个氢键，这有助于稳定EIN的2和2 之间的螺旋。最后，再Asp129和Thr16，Glu84 和 Ser46 以及 Arg126 和 Gln51 之间还有三个侧链侧链氢键相互作用。EIN和HPr之间状态转变的重要方面在图. 4中给出了。EIN和HPr分别在His189的N2原子和His15的N1原子被磷酸化。在复合体没有被磷酸化的形式里，His189不同HPr接触，它的N2原子接受来自Thr168的羟基的质子的氢键，就好像它在自由EIN做的那样，这样它就被导向了远离His15的N1原子。转换状态的建模是通过增加一个磷酸基团（利用合适的三角双锥几何学）到EIN的His189和HPr的His15之间的配对中点，去掉分子内在His189的侧链和Thr168的甲基之间的NOE，以及在剩余实验的NMR限制的基础上对模拟退火计算进行重复完成的。这产生了图. 4 中所示的结构，在那里，唯一显著的改变包含His189的侧链2角翻转150，允许了His189的原子非常靠近His15的N1原子。转移状态的五配位磷定位在由EIN的2螺旋尾部的N末端和HPr的1螺旋尾部的N末端形成的裂隙的底部。从结构上来讲，转移状态更倾向于在HPr磷酸化时稳定，而不是在EIN磷酸化时。此外，EIN磷酸化使得EIN去稳定化，部分是由于缺失了在His189和Thr168之间的氢键，这个氢键更倾向于磷酸从EIN转移到HPr。这两个因素导致了激发PTS中的磷酸转移朝着合适的方向发生。HPrIIAGlc复合体磷酸化的HPr是一个所有PTS酶II的磷酸通用供体。这个磷酸转移活性伴随着从PTS系列的通用磷酸转移部分到葡萄糖特异的那条途径。特别有意思的是葡萄糖特异的载体（IIAGlc）。这个蛋白不仅仅作为葡萄糖转移过程中的中间体，同时也作为非PTS通透酶和腺苷酸环化酶的调节者（图. 1）。E. coli 的HPr和IIAGlc的三维结构都已经被X晶体衍射和NMR解析了（Herzberg and Klevit, 1994）。由NMR进行的E. coli 的HPrIIAGlc的复合体的结构解析已经有人在做并圆满地完成了（Wang et al.,2000a）。至于前面讨论过的EINHPr的结构，HPrIIAGlc复合体的结构是采用同位素标记蛋白质的组合，利用多维异核NMR光谱技术解析的。在HPr、IIAGlc复合体的问题上，结构计算利用了一个新颖的程序，这个程序利用刚体最小的原理去锚定这个结构，紧接着，利用强制/限制模拟退火去精确确定界面的侧链位置（Clore, 2000）。这是可能实现的，因为当结果的复杂信息出现时，并没有显著的骨架构象的变化发生。图. 5 中显示了HPrIIAGlc复合体的丝带图。正如前面确定的，HPr是作为一个正面开放的/三明治蛋白，它的三个螺旋正好在四股反向平行的片层的正上方。IIAGlc结构主要是由每一侧都有六股反向平行链的三明治样结构的片层组成。内部蛋白结合面包括HPr上凸起的区域（螺旋1和2）以及IIAGlc上凹进去的区域的互补的结合（链5、6、7、和10）。在接触面的41个残基包括来自HPr的18个和来自IIAGlc的23个。（图 略）图1 磷酸转移酶系统（PTS）与跟它相互作用的组分。（图略）图2 EIN-HPr复合体的结构。丝带图表示出复合体的两个视角。HPr，绿色；EIN的结构域，红色；/结构域和C末端，金黄色。(出自 Garrett et al., 1999)（图略）图3 EIN-HPr相互作用。EIN和HPr之间的静电（顶部）和范德华力（底部）的相互作用。红色线条表示HPr的螺旋1和EIN的螺旋4之间的相互作用，绿线表示HPr的螺旋1和2与EIN的螺旋2和2之间的相互作用，蓝线表示HPr的螺旋2和EIN的螺旋3和4之间的相互作用。虚线表示静电相互作用，显示了侧链骨架的氢键（出自Garrett et al., 1999）图4 EIN-HPr复合体的转换状态。没有被磷酸化的复合体的EIN的螺旋5和6以及HPr的螺旋1在转换状态是层次分明的。EIN的His189和HPr的His15的构象改变以及后来EIN的螺旋5和6的被替换显示在图中（出自Garrett et al., 1999）。（图略）图5 HPr-IIAGlc复合体的丝带图。显示了两幅图；HPr，绿色；IIAGlc，蓝色。显示了活性位点组氨酸（HPr的His15和IIAGlc的His90）的定位，以及在界面附近的二级结构元件（Wang et al., 2000a）。（图略）图6 配伍蛋白之间的相互作用。（A）HPr和它的配伍蛋白EIN和IIAGlc（表示为IIA）之间的相互作用；（B）IIAGlc和它的配伍HPr和甘油激酶（表示为GK）之间的相互作用。疏水相互作用，蓝色；静电相互作用，红色（出自Wang et al., 2000a）。（图略）图7 阐明包含在（A和B）EIN-HPr，（C和D）HPr-IIAGlc以及（E和F）IIAGlc-GK复合体中的结合表面的空间表示。EIN和IIAGlc上的HPr结合表面分别显示在（A）和（C）；GK在IIAGlc上的结合表面分别显示在（B）和（D）；IIAGlc在GK上的结合表面显示在（F）。结合表面采用颜色编号，疏水残基为绿色，极性残基为亮蓝色，活性组氨酸为紫色，带正电残基位深蓝色带负电残基为红色。配伍蛋白骨架的相关部分显示为金色丝带，带正电的侧链显示为深蓝色，而带负电的为红色。只有带电的残基和活性位点的组氨酸被标记了，这些从HPr和GK的残基显示为意大利文。注意到尽管EIN的活性位点的组氨酸（His189）以及IIAGlc活性位点的组氨酸（His90）与HPr的His15紧密接触，他们到达的方位并不一样。His189（EIN）从上面接近His15（B），而His90（IIAGlc）从下面接近His15（D）（出自Wang et al., 2000a） （图略）图8 HPr 侧链可塑性。（A）HPr-IIAGlc和EIN-HPr复合体的界面的选择区域的重叠的立体图，表明了HPr的Phe48的不同的构象；（B）显示HPr的Arg17的不同构象的两个复合体的区域的重叠。HPr-IIAGlc复合体中的HPr，红色；EIN-HPr复合体中的HPr，蓝色；EIN，紫色；IIAGlc，绿色（出自Wang et al., 2000a）（图略）图9 HPr上配伍蛋白的结合表面。（a）糖原磷酸化酶（GP）的结合表面；（b）IIAGlc的结合表面；（c）EIN的结合表面。骨架化学位移扰动被画到了HPr的一幅丝带图上（图的左边）和HPr的可达表面上（图的右边）。位移的尺度用从蓝色（没有位移）经过黄色（中度位移）一直到红色（最大位移）的渐变来表示。二级结构元件在（a）中用丝带图标记出来了。HPr的组氨酸在丝带图上用红色表示（出自Wang et al., 2000a）。 HPr和IIAGlc之间的接触示于图. 6。每一个结合表面的中央部位是绝对疏水的，在HPr方面，由Thr16、Ala20、Val23 和 Leu47的甲基和Phe48的芳香环组成，在IIAGlc方面由41、71和88位的三个苯丙氨酸组成的环，间杂着三个在40、46和96位上的缬氨酸组成。中央疏水区在两者中都是被极性的和带电的残基包围。后者在HPr中全部带正电而在IIAGlc中则全部带负电。只要从复合体的配位开始，而且在两个活性的组氨酸之间合适的双锥几何半程引进磷酸基团，接下来再实验NOE和双极耦联限制的基础上利用刚体最小化和强制/限制模拟退火的方法，成功模拟HPr和IIAGlc之间的转变状态是可能的。在组合模型中，HPr的His15以及IIAGlc的His90的咪唑环平面相互大致呈90。在复合体中，His15的咪唑环的方位和HPr的Arg17的侧链是由一些疏水和静电接触来保持稳定的。在HPr方面（图. 6A）,我们对一个先前对于HPrEIN是正确的接触点作了一个比较。同样的，在IIAGlc方面（图. 6B），这个比较则是与甘油激酶（GK）的界面的。HPr上同EIN和IIAGlc的结合界面非常的相似，在总共18个与IIAGlc以及23个与EIN相接触的残基中，共享17个相同的残基（图. 6A）。这种普遍的凸起的结合表面是由极性的和带正电的残基组成的一个环所包围的中央疏水区。在EIN和IIAGlc上用于HPr绑定面的骨架脚手架则完全不同。在EIN上的HPr绑定面由a螺旋组成而在IIAGlc上则主要是b片层。然而，两个绑定面的表面的代表表明它们在外形和残基分布上都相似（见图. 7）。EIN和IIAGlc的绑定面是凹的而且呈环形，它的疏水的核心被一个由极性的和带负电并与在HPr上带正电的绑定表面互补的环所包围。为了同时成功地获得EIN和IIAGlc的复合体，要求HPr侧链残基的可塑性，如图图. 8。Phe48参与了一些重要的疏水接触。在EINHPr复合体中，Phe48的扭转角处于允许它与EIN的Leu79、Leu85、Ile108和Gln111相互作用的构象中（图. 8A）。然而，在HPrIIAGlc复合体中，Phe48的侧链则处于不同的构象，允许它同IIAGlc的b6 和 7的骨架相互作用的构象。因此，Phe48根据它相互作用的对象不同采用了特异的构象。HPr的Arg17的可塑性示于图. 8B。在EINHPr复合体中，侧链处于可以同EIN的Glu67和68位的羧基形成离子对的构象中。在HPrIIAGlc复合体中发现了Arg17侧链的一种不同的构象，使得它可以同IIAGlc的Asp38和94位的羧基形成离子对。至于包括HPr的多复合体，IIAGlc同多个配伍形成的复合体表明存在交错（图. 6B）。与HPr交互作用的IIAGlc上的表面有23个残基，其中16个同样也与甘油激酶（GK）存在交互。组成HPr和GK上面IIAGlc绑定表面的脚手架同样也不同。当HPr上的绑定表面包含两个螺旋的时候，在GK上有一个短的螺旋和三个环的部分。展现给HPr和GK的IIAGlc的绑定表面都是凹的。而且，包含在两个绑定表面的IIAGlc上的疏水残基的定位几乎都是一样的；对于极性和带正电的残基来说也是这样的。已经阐明的蛋白蛋白相互作用表明对于同EI和IIAGlc相互作用，在HPr的绑定表面上存在广泛的交错（图. 6B）。这与HPr和IIAGlc的活性位点区域为了达到恰当的磷酸转移以及调控机制的目的而必须同它们交互作用的配伍相接触是一致的。HPr上与配伍蛋白交互作用的共同的界面在前面的讨论中，HPr上锚定到EI或者IIAGlc的区域是相似的这个观点越来越明显了。而且，IIAGlc上锚定到HPr的表面同它与GK交互的表