突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取,纯化及抗肿瘤活性研究.doc

突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取，纯化及抗肿瘤活性研究摘要 从突变的冬虫夏草中可大量提取出一种水溶性多糖（命名为MCMP），通过热水提取，利用sevage法、乙醇沉淀，阴离子交换和凝胶过滤层析CL-6B法脱除蛋白质。该多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成，它们的摩尔比为59.36:1:8.31:39.50，其平均分子量为8100。在这项研究中，我们选择喉癌Hep-G2细胞，Hela细胞和肾小球系膜细胞来研究该多糖的抗肿瘤活性。MTT测定结果表明，经48小时的培养后，该突变体菌株的多糖对细胞增殖有抑制作用。引言冬虫夏草，最昂贵的中国传统药物之一，被认为是中国罕见的虫草。冬虫夏草具有广泛的药理活性，包括抗炎，镇痛抗氧化，抗血栓生成，常用于补肾、缓解肺部炎症，治疗高血糖，高血脂，肾功能不全和肝脏疾病等。现代医学研究表明，冬虫夏草对人体的几个系统有益，如循环系统、免疫、造血、心血管、呼吸和腺体系统。 然而，时下，冬虫夏草的过度开发导致了野生冬虫夏草的灭绝及土地的荒漠化。培育虫草，而不是传统的恢复冬虫夏草是人们迫切需要的。在中国及东南亚，一般将培育子实体作为原料药和保健食品进行售卖。近年来，科学家们对它的生命周期进行了广泛研究，以期分离出发酵菌株。 从天然冬虫夏草中已分离出几株。木耳栽培技术已被用于培育冬虫夏草，它们显示出类似的药理活性，冬虫夏草可以生产多种生物活性成分如虫草素，D-甘露醇和某些多糖。多糖因其多种多样的生物活性而备受关注，它被广泛地应用在化妆品，药品，食品营养等行业。 研究发现，某些多糖对包膜病毒有抵抗功效，包括HSV-1病毒，流感病毒和人巨噬细胞病毒，而且具有抗肿瘤活性。冬虫夏草具有多种类型的多糖，已报道它们具有许多令人关注的生物活性，包括免疫刺激，抗肿瘤活性和自由基清除等。中国吉林大学普通生物学中心实验室研究发现，突变冬虫夏草（H4019）高产多糖达0.780 g / L。因此，本研究的目的是对冬虫夏草H4019的多糖进行分离，纯化，表征及抗肿瘤潜能的探究。2.材料和方法2.1 药品a. 琼脂糖凝胶CL-6B是从Pharmacia Biotech公司购得。b. DEAE-52纤维素阴离子交换柱是来自Amersham Biosciences公司。三氟乙酸（TFA）购自Merck公司。c. 3 - （4,5 - 二甲基-2 - 基）-2,5 - 二苯基溴化（MTT），刀豆蛋白A（刀豆）和脂多糖（LPS）购自Sigma化学公司。d. 作为介质的RPMI-1640培养基购自GIBCO Invitrogen公司。RMPI-1640培养基，用于免疫学实验，配有HEPES缓冲液10mol/ml，青霉素100 IU/mL，链霉素100 g/ml，L-谷氨酰胺2mol/ml，2 - 巯基乙醇50mol/L,10的新生牛血清，pH=7.2。e. 所有其他试剂均为可用的最高品质。2.2 细菌培养将原始菌株（CGMCC5.699）在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面上，26下培育7天，然后在液体培养基中激活4天诱导出高产突变冬虫夏草（H4019）。种子菌液与浸没液以4的比例接种到发酵液中，得到真菌菌丝。真菌菌丝体冷冻干燥并收集。用蒽酮-硫酸法以葡萄糖为标准确定总碳水化合物含量。2.3 MCMP的提取从冬虫夏草中获得的真菌菌丝体，在沸水浴中加热3.5小时，并用4层纱布过滤。将固体物质在相同条件下萃取两次。合并滤液并离心除去不溶于水的物质。离心（8000r/min，10min）后，将上清液浓缩至1000mL，加入95（体积分数）乙醇。乙醇最终体积分数为80。悬浮液在3000r/min下离心10min后，收集沉淀物，并将其冷冻干燥，得到粗多糖级分。碳水化合物总含量测定。将多糖重新溶解在1000ml蒸馏水中，用Sevag法(试剂V正丁醇：V氯仿=1:4，250ml)处理，将其在5000 r/min下离心15 min以除去蛋白质。The supernatant was dialyzed against deionized water over night before concentration in a vacuum evaporator at 55 C. 将上清液透析去离子水中过夜，用真空蒸发器在55下进行浓缩。将乙醇与样品以4:1（体积比）进行沉淀，并除去沉淀和溶剂乙醇后，得到冬虫夏草（MCMP）的菌丝体脱蛋白的多糖级分。总碳水化合物的含量确定了。2.4 MCMP的纯化 将20mgMCMP溶解在1ml的蒸馏水中，用DEAE-52纤维素阴离子交换柱（2.6厘米60公分）进行离子交换。该柱先用去离子水，然后再用梯度溶液（0.1，0.2和0.3mol/L的NaCl）分别以0.5ml/min的流速进行洗脱。收集级分（5毫升，每份），根据蒽酮-硫酸法确定总碳水化合物含量。糖醛酸的含量用m-羟基法确定。得到的级分浓缩，用蒸馏水透析，然后冷冻干燥。凝胶渗透色谱系统琼脂糖CL-6B用于进一步纯化。该柱用的去离子水以1ml/min的流速进行。将级分（10ml，每份）收集起来。2.5多糖分子的测定质量和单糖组成MCMP的分子量（Mw）与单糖组成是用高性能液相色谱仪（HPLC，日本岛津公司）进行测定的，配有TSK-GEL G3000 PWXL柱（7.8毫米300毫米）和一个RID-10A折光检测评价仪。HPLC法： 将0.5的MCMP（20L）溶解在蒸馏水中，以0.7的Na2SO4为流动相,以0.5ml/min的流速在40下进行。用已知的相对分子质量（T-700，T-580，T-500，T-110，T-80，T-40，T-11和T-9.3）的T系列葡聚糖作为标准进行校准。取2mg多糖样品进行水解，用含1 mol / L盐酸的无水甲醇，在80下处理16小时，然后用2mol / L的三氟乙酸（TFA），在120下保持1小时。所得到的水解产物是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）的衍生物，用连接有Shimadzu HPLC系统（LC-10ADVP泵和SPD-10AVD UV-Vis检测器）的Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm150毫米）进行分析。 将PMP的衍生物（20L）注入HPLC系统，用82.0的PBS（0.1摩尔/升，pH值=7.0）和18.0的乙腈（体积比）以1.0ml/min的流速进行洗脱，并通过UV监测245nm下的光谱。2.6细胞系列喉癌Hep-G2细胞，Hela细胞和系膜细胞从上海生物化学与细胞生物学研究所，中国科学研究院获得。在RPMI-1640培养基上培养细胞，该培养基有10热灭活的胎牛血清（FBS），青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100mg / L），在37 C、潮湿环境下培养，空气中CO2 的含量为5%。2.7体外抗肿瘤试验MCMP对HepG-2细胞，Hela细胞和肾小球系膜细胞的生长和增殖的抑制效应，是通过3 -（4,5 - 二甲基-2 -吡啶）-2,5 - 二苯基溴化法（MTT）测定出来的。将密度为2104个细胞/孔的细胞接种于96孔的培养板上。在37下培养24小时后，将实验样品（浓度大约为8000，4000，2000，1000，500，250，125和62.5g/ml）和控制介质分别加入到各类细胞样品中，每隔24小时加一次，培养72小时。加入20L（5g/ml）的MTT溶液到每个孔中，并将细胞在37下进一步培养4小时。将析出的甲臜用150L二甲基亚砜溶解后，在570nm的波长下测定光密度。MCPC的抑制率（IR）是通过下面的公式计算：IR(%)=(1 ODexp/ODcon) 100%其中OD exp和OD con是处理过的和未处理过的细胞的光密度。2.8统计学分析所有数据均为三次重复试验结果的平均值。统计计算采用SPSS10.0版软件（SPSS公司，芝加哥，美国）进行。应用方差分析方法测定试样结果之间的差异。利用邓肯检验法进行数据的比较。P值 0.05时，认为具有显著差异。3结果与讨论3.1多糖的分离与纯化通过乙醇沉淀，从100g真菌菌丝体中提取出2.312g粗多糖，其多糖含量用蒽酮 - 硫酸法测定为28.1。通过DEAE-52纤维素阴离子交换柱和琼脂糖凝胶CL-6B柱提纯，多糖含量达到99.8，冻干后质量为320mg。MCMP的色谱结果见图1。经过DEAE-52纤维素阴离子交换柱分离后，从中获得的MCMP I和MCMP II（1:10.6体积比）及其含水梯度溶液（去离子水和0.1，0.2和0.3mol/LNaCl）。MCMP I和MCMP II分别是中性多糖和酸性多糖。MCMPII通过琼脂糖凝胶 CL-6B柱进一步纯化（图2）。MCMPII只显示一个对称峰。结果表明，样品中没有糖醛酸和其它多糖。利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱粗多糖的溶出曲线总碳水化合物含量用蒽酮硫酸法测定用0.1mol/ L的去离子水以1 mL / min的流速洗脱，用琼脂糖凝胶CL-6B柱测定MCMP的纯度3.2多糖分子质量和单糖组成样品经乙醇沉淀后，获得多糖级分。多糖的分子量是8100。该多糖含有甘露糖，鼠李糖，半乳糖和葡萄糖，根据保留时间和HPLC（图3）的峰面积得其摩尔比为59.36:1:8.31:39.50。 利用HPLC分析多糖组分3.3 MCMP的抗肿瘤活性研究体外测定突变体菌株（H4019）的多糖对HepG-2细胞，Hela细胞和系膜细胞的结果见图4。 从结果中，我们可以看到，该突变体菌株经过24小时培养后对肿瘤细胞没有抑制作用。但经过48小时培养，用不同浓度的多糖处理的肿瘤细胞表现出明显的受抑制作用，且抑制能力受剂量控制。其抗肿瘤活性与多糖浓度直接相关。经过72小时培养，生长抑制率较高。在8mg/ml的浓度，MCMP对HepG-2细胞、Hela细胞和肾小球系膜细胞的抑制率分别为57.11，67.11和58.74（如图4）。MCMP（高产突变冬虫夏草菌丝体多糖）的实验结果与原始菌株的多糖比较，表现出对HepG-2细胞，Hela细胞和系膜细胞相对较高的抑制率。经过72小时培养，MCMP对HepG-2细胞，Hela细胞和系膜细胞的IC50值分别为5.318，3.192和9.644mg/ml。在我们的研究中，突变冬虫夏草产生了比原始菌株明显更多的多糖。相较于原始菌株0.587g/ L，该突变体冬虫夏草的多糖含量增加到0.780g/ L 。提取和纯化工艺很容易操作并获得了均匀纯度高的多糖。产量高和纯度高的多糖降低生产成本。我们研究了MCMP对HepG-2细胞，He