高效纤维素降解菌的选育毕业论文.doc

本科毕业论文题目：高效纤维素降解菌的选育摘 要产酶纤维素微生物在纤维素资源的再生转化，提高牲畜饲料利用率，堆肥的使用以及环境污染等方面具有很高的应用价值。而分离高效纤维素降解菌是这一内容的前提与基础。 本研究利用选择培养基CMC培养基，FPA摇床培养基，从广西香蕉秸秆的土壤，武汉武丰宰牛厂牛的瘤胃，武汉晨鸣造纸厂的污水排放口的污泥以及汉阳江边的土壤中分离得到6株降解纤维素的真菌。它们都具有较强的纤维素降解能力，尤其以编号为纸绿（从造纸厂污泥中筛选得到的绿色霉菌）和江白（江边土壤中筛选得到的无毛白菌）活性最高。随后对这6种菌株进行了形态学和生理生化鉴定，从中得到一株高酶活的菌株,其在CMC培养条件下酶活达到40U,在FPA培养条件下达到4.5U。 关键词： 纤维素降解菌； 筛选； 纤维素酶活； 鉴定Abstract Microbial fermentation of cellulose micro-organisms, especially fungi in the conversion of cellulose into renewable resources and improve utilization of livestock feed, compost use and environmental pollution has a high application value. And efficient cellulose degradation bacteria can provide useful help in this regard. In this study, selective medium CMC medium, FPA shaker medium of banana stalk from the soil, Wuhan Department Store abundance of the rumen of cattle slaughtering plant, Wuhan Chenming paper mill sludge from the sewage outfall in the river and the Hanyang Street drag straw isolated six soil fungi degrade cellulose. They have a strong ability of cellulose degradation, particularly in the number of paper green (screened from the paper mill sludge green mold) and White River (river soil hairless white screened bacteria) the highest activity. And the 6 strains with a high activity were morphological, physiological and biochemical identification.Key words: Cellulose degrading bacteria; Filter; Cellulase activity; Identification.目 录1 文献综述51.1 纤维素概述51.2 纤维素酶51.2.1 纤维素酶的组成51.2.2 纤维素酶的种类以及作用机理71.3纤维素分解菌类81.3.1 纤维素分解菌类简介81.2.2 纤维素分解菌的选育91.4 本文研究的目的与意义92 实验部分102.1 材料102.1.1 样品来源102.2 主要试剂与仪器102.2.1 主要试剂102.2.2 实验仪器112.3 培养基112.4 菌种的分离与筛选122.4.1 分离与初筛菌株的方法：122.4.2 菌株的复筛132.5 纤维素酶活性测定132.5.1 绘制葡萄糖标准曲线132.5.2 粗酶液的制备142.5.3 酶活力测定方法142.5.3.1 CMC酶活测定142.5.3.2 FPA酶活测定152.5.4 酶活力计算方法152.6 形态特征观察152.6.1 菌落形态观察152.6.2 培养特征观察152.7 生理生化特性鉴定162.7.1 明胶液化试验162.7.2 淀粉水解162.7.3 纤维素水解试验172.7.4 硝酸盐还原172.7.5 碳源利用172.7.6 类黑色素的产生182.7.7 硫化氢的产生182.8 菌种保藏183 结果与讨论193.1 初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述193.2复筛获得的菌株菌种分类鉴定结果193.3 葡萄糖标准曲线的绘制243.4 各菌的酶活力测定结果253.5 菌株的生理生化特征263.6 讨论264 结论28参考文献291 文献综述 纤维素是自然界中存量最大的一类可再生资源。全世界每年产农作物秸秆约1000-2000亿吨。我国是一个农业大国，又是一个畜牧业大国。据粗略统计，我国每年产生农作物秸秆约7亿吨，含大量未降解纤维素组分的禽畜粪肥17.3亿吨。然而，由于纤维素中存在许多高能氢键，因此其水解、利用较困难，目前只利用了其中很小的一部分，大部分的纤维素类物质都被弃置，既浪费资源又会对环境造成极大的污染。因此合理开发和科学利用这一丰厚的天然资源已成为研究开发的一个重点领域1。微生物在自然界纤维素的降解中有着举足轻重的作用。我国纤维素酶的研究已有几十年的历史，并且已筛选出一批纤维素酶产生菌种。目前，用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，如木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)2 。然而，用于纤维素酶生产的菌株普遍存在酶活力较低的问题3。因此，筛选优良菌种是提高纤维素酶活力，从而提高纤维素降解效率的关键。1.1 纤维素概述 纤维素是植物体中最重要的组成成分之一，是细胞壁的主要组成成分，约占植物干重的40以上。据粗略估计，全世界纤维素的资源约为70亿吨，而每年经绿色植物光合作用合成的纤维素产量高达40亿吨。因此，毫无疑问，纤维素是公认的地球上数量最丰富的可再生有机物质资源。从结构上看，纤维素是由许多个葡萄糖分子通过-1,4-糖苷键连接而成的直链聚合物多糖。纤维素与淀粉在分子结构上的差别仅在于葡萄糖基连接时的构型不同，淀粉是通过-1,4-糖苷键连接的，而这一不同点使两者水解的难易程度相差悬殊。纤维素的聚合度范围非常宽，分子中单糖结构片断可以从几百到一万五千左右，是一种高分子化合物。自然界存在的纤维素，分子链之间还存在着氢键的缔合作用，这使纤维素分子之间形成纤维素束。天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定型区组成4。1.2 纤维素酶1.2.1 纤维素酶的组成 纤维素的生物降解现象早在1886年就被发现，1912年Pringsheim首次将“纤维素酶(cellulase)”的概念引入文献中，但直到1950年之后才有纤维素酶相关的系统性文章报道。由于纤维素物质具有复杂的结构，任何单一的酶都难以高效地水解它。因此降解纤维素的微生物往往要产生多种纤维素酶类，还要伴随着各种半纤维素酶的产生，组成一个复杂的酶系统以降解植物细胞壁物质。同时，又由于降解纤维素的微生物种类不同，所产生的纤维素酶组分也不尽相同，构成了各具特色的纤维素降解酶体系。所以，纤维素酶不是一个单种酶，而是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称(主要有C酶和G酶)，是起协同作用的多组分酶系”。 由于微生物的不同，其产生的纤维素酶组分也是不相同的，构成了各具特色的纤维素降解酶系，其内切酶、外切酶的含量，种类比例和活性的大小都有很大的。在同一菌株的纤维素酶系中，每一类纤维素酶往往存在多个结构、功能和活性不同的组分，每一组分又可能由不同的亚组分组成。按照纤维素降解微生物的能力和纤维素酶系之间的关系，可将纤维素酶系分为三类：一是对天然纤维素的降解能力比较弱，但可大量合成分泌到胞外的纤维素降解酶系，这种酶的组分是游离的，如常见的木霉、青霉的纤维素酶系；二是对天然纤维素降解能力强，但分泌到胞外的纤维素酶活力较低的酶系，如担子菌类等；三是对天然纤维素分解能力强，但基本无纤维素酶分泌到胞外的酶系，如厌氧细菌的纤维素酶系。 此外，能够降解无定形纤维素和结晶纤维素的酶系称为(complete cellulase system)或全值酶系(full-cellulase system)，而仅能水解无定形纤维素的纤维素酶系称为不完全酶系(uncompleted cellulase system)或低值酶系(10w-value cellulase system)。 纤维素酶是多组分酶体系，是具有纤维素降解能力酶的总称。1950年Reese提出C-G酶的概念，随着研究的深入，每种酶的组分和作用机理已被逐渐阐明。根据它们作用于纤维素和降解的中间产物可以分为三类：外切葡聚糖酶包括两类酶，一类是-1,4-D-葡聚糖-葡萄糖水解酶，也称为纤维素糊精酶(Ec3.2.1.74)；第二类酶为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases, CBH)，即-1,4-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶(exo-1,4-D-glucanases,EC3.2.1.91)，简称外切酶。CBti是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，可以水解微晶纤维素和棉花等结晶度高的纤维素，作用于无定形纤维素的非还原末端或还原端，水解-1,4-D-糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。内切纤维素酶(endoglueanases,EG)或内切葡聚糖酶，即内切-1,4-D-葡聚糖q-葡聚糖水解酶(endo-8-glucanasea,EC3.2.1.4)，简称内切酶，也称cx酶，CMC酶。内切纤维素酶随即地水解磷酸膨胀纤维素，羧甲基纤维素等无定形纤维素的非定形区，无规则水解-1,4-D-糖苷键，形成葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和不同大小的纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更多的可供水解的末端。-1,4-D-葡萄糖苷酶(6-glucosidases,B-6或BG)或B-D-葡萄糖苷-葡萄糖水解酶(EC3.2.1.21)，又称纤维二糖酶(cellobiase,CB)，它主要裂解纤维二糖和从小的纤维素糊精的非还原末端水解葡萄糖残基，生成葡萄糖产物。它的水解速率随底物大小的降低而增加，以底物为纤维二糖时水解速率最快。严格地讲，葡萄糖苷酶不能算作纤维素酶，但它可以减轻纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用。酶解纤维素时，对无定形区仅EG即可使之水解，对于结晶区需要有EG和CB的协同作用。因此，在纤维素溶解糖化过程中与CBH的比值会显著地影响纤维素溶解活力，而且在纤维素糖化过程中CB组分的加入会使这种协同作用大大加强。但是，CB与EG，CB与CBH的协同作用都很弱。1.2.2 纤维素酶的种类以及作用机理 微生物分解纤维素依赖于细胞所产生的纤维素酶。纤维素酶不是单种酶， 而是起协同作用的多种酶系14。可分为以下三类： 第一类是葡聚糖内切酶，或称CMC酶或CX酶。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短， 产生大量带非还原性末端的小分子纤维素； 第二类是葡聚糖外切酶，或称微晶纤维素酶、纤维二水解酶或C1酶。这类酶作用于纤维素分子末端，水解-1,4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子； 第三类是-葡萄糖苷酶(-1,4-glucanase,EC 3.2.1.2l简称BG)，或称纤维素二糖酶。这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。虽然它对纤维素无作用，但它可以消除上述两种酶催化反应的终产物对反应的抑制作用，从而加快反应速度。 纤维素酶的降解机理：1950年，Reese等曾阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C1-Cx假说，该假说认为：当纤维素酶作用时，首先对纤维素的Cl组分起作用，继而使Cx组分变成纤维低聚糖，再由-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。Wood在研究木霉(Trichodermareesei)、青霉(Penicilli, umfuniculosumde)的纤维素酶水解纤维素时，发现培养液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同作用。Kanda等还发现只是对可溶性纤维素进攻方式不同的两种内切葡萄糖酶在结晶纤维素的水解过程中也具有协同作用。协同作用一般认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，-葡萄糖苷酶再对纤维二糖单位进行水解，形成葡萄糖。目前人们普遍认为纤维素酶是分解以-1,4葡萄糖苷键结合的纤维素物质，首先由Cx组分对纤维素的非晶体部分进行切割，然后由Cl组分以纤维二糖为单位从末端对其缓缓分解，最终由-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。1.3 纤维素分解菌类1.3.1 纤维素分解菌类简介自然界能产生分解纤维素的酶的微生物很多，包括细菌、放线菌和真菌5。自1906年Selliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶以来，人们相继在细菌、真菌等微生物中分离到能降解纤维素的酶。其中，以细菌的生长和降解效果较稳定。但对纤维素作用较强的是木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penieillium)和枝顶孢霉属(Aeremonium)的菌株，其中真菌木霉属是迄今所知形成和分泌纤维素酶系成分最全面、获利最高的一个属，国内外许多研究人员对此作了很多报道。经形态学、生理生化反应、生态特性和遗传型的鉴定，WQ.1归类为瘤胃球菌属(Rum inococcus)的黄色瘤胃球菌(Rum inococcus flavefaciens)。WH.2归类为丁酸弧菌属(utyrivibrio)的溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)。2002年，崔宗均等从4种堆肥样品中分别筛选出纤维素分解能力较强的4组混合菌，再以酸碱反应互补的原则重新优化组合并驯化成组纤维素分解能力非常强而稳定的纤维素分解菌复合系MCl。同年，魏桃员等从造纸厂污泥中分离得到了一株能以纤维素为唯一碳源生长良好的纤维素降解菌w23，经鉴定，为假单胞杆菌。2005年，Souichiro Kato等构建了由五种细菌(梭菌属菌株CSKl，梭菌属菌株FG4，黄原酸假单胞菌属菌株M1.3，短芽孢菌属菌株M1和博尔德氏杆菌属菌株M1)组成的可降解纤维素的群落(命名为SF356)，该群落经20次继代培养它们仍能稳定共存，并且降解纤维素的能力增强了。2006年，吴敏峰等采集健康奶牛的新鲜粪便。利用刚果红平板染色法分离筛选具有产纤维素酶活性的芽孢杆菌。并进行细菌菌落、形态和生化鉴定。结果从牛粪中分离出35株兼性厌氧的芽孢杆菌。利用刚果红鉴别培养基筛选出具有分解纤维素能力的菌株。并测定其水解圈大小。初步筛选出10株纤维素酶高产菌株，并对其进行了种属鉴定：一株为梭状芽孢杆菌，其余9株为芽孢杆菌属细菌。2006年，伍时华等通过羧甲基纤维素琼脂平板、滤纸条培养基从自然环境中筛选到4株高效纤维素降解菌，其中木霉2株，青霉2株，分别记为T-1，T-2，P-1和P-2。2006年，朱军莉等从袋装降解的笋干中分离到一株分解纤维素的细菌菌株。该菌株呈长杆状，革兰氏染色为阳性，产芽孢，命名为BSX5。经鉴定，确定该菌株为枯草芽孢杆菌。2007年，刘玉承等从日粮精粗比为3:7的小尾寒羊蒙古羊杂交一代绵羊的瘤胃内容物中分离到2株严格厌氧细菌，一株球菌WQ.1.l株弧菌WH.2，二者对滤纸有很好的降解能力。通过酶活力试验测得WQ.1的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和p2葡萄糖苷酶活分别为0.66 U/ml，7.0 U/ml和15.3 U/ml；WH.2的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和D-葡萄糖酶活分别为0.52U/ml，6.9 U/ml和17.2 U/ml。同年，韩绍印等从造纸厂废纸浆中分离到一株纤维素降解细菌CP4，在温度为20-50 和PH为5-10的条件下，CP4能够快速生长并分泌纤维素酶。在35 和PH为9的条件下，培养8 h后CP4开始产酶，培养3 d后相对酶活为5.43 mm/d，经初步鉴定，确定该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)。1.2.2 纤维素分解菌的选育 近年来，在纤维素分解菌研究领域，还有人通过对已发现纤维素分解菌进行诱变，来增加产酶微生物菌种资源，提高纤维素酶的产量，并取得了较大的进步9。木霉菌经化学、物理诱变后，其变异株产纤维素酶性能明显提高。Hideo等10 将0.10%秋水仙素处理35 d的里氏木霉(Trichoderma reese)RUTC230，用灭菌灵单倍体化，从单倍体克隆长成的分生孢子器中分离出高产纤维素酶菌株，随后分别用含有1%废纸粉的培养基作为选择培养基和含有1%的微晶纤维素的培养基作为二级选择培养基进行筛选。筛选出的WP.1菌株对羧甲基纤维素钠(CMC)、微晶纤维素和水杨苷活力分别是原始菌株的1.9，2.0和3.5倍。韩峰等11以拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)TH为出发菌株，采用紫外诱变获得一株抗高浓度葡萄糖阻遏突变株UVIII，纤维素酶产量显著提高。Prabavathy等12将里氏木霉制备成原生质体并融合，在CMC琼脂平板上再生，筛选了15个融合体，相对于原始菌株，在CMC平板上出现的透明圈更加明显，其中，有2株融合子SFTr2和SFTr3相对于原始菌株PTr2酶活提高了2倍多13。纤维分解细菌经离子束注入诱变，其突变菌株产纤维素酶活性也明显提高。曾宪贤(2005)等对纤维分解细菌HY2进行不同剂量离子束注入诱变，筛选出纤维素酶活性高的突变菌株HY2.3。通过聚合酶链式反应PCR技术扩增得到纤维素酶高产菌株芽孢杆菌(Bacillus sp)HY2.3以及原始菌株芽孢杆菌HY2的纤维酶基因chy2.3和chy2。经过克隆和序列分析表明，所得到的突变型和野生型纤维素酶基因编码区均为1500 bp，同时发现，经过离子束诱变得到的高产菌株和野生菌株的纤维素酶基因序列存在差别。这些碱基突变引起氨基酸序列的改变有可能导致两个菌株纤维素酶产量上的不同。1.4 本文研究的目的与意义 本文主要从广西香蕉秸秆的土壤，武汉武丰宰牛厂牛的瘤胃，武汉晨鸣造纸厂的污水排放口的污泥以及汉阳江边的土壤筛选出能够高效降解纤维素的菌株。并从形态学和生理生化等方面对筛得的菌株进行菌种鉴定。 高效纤维素降解菌在环境污染，堆肥，动物饲料等方面起到不可替代的作用。2 实验部分2.1 材料2.1.1 样品来源微生物分离样品来自广西香蕉秸秆的土壤，武汉武丰宰牛厂牛的瘤胃，武汉晨鸣造纸厂的污水排放口的污泥以及汉阳江边的土壤。2.2 主要试剂与仪器2.2.1 主要试剂本实验所用的主要试剂见表2.1. 表2.1 试剂Table2.1 regents药品名称分子式纯度或含量生产厂家磷酸氢二钾K2HPO43H2OAR天津市东丽区泰兰德化学试剂厂磷酸二氢钾KH2P04AR天津市东丽区泰兰德化学试剂厂硝酸钠NaNO3AR天津市科密欧化学试剂有限公司硫酸镁MgSO4AR上海试一化学试剂有限公司氯化钙CaCl2AR天津市天达净化材料精密化工厂氯化钠NaClAR天津市凯通化学试剂有限公司氯化钾KClH2OAR天津市科密欧化学试剂有限公司氯化钴CoCl26H2OAR天津市科密欧化学试剂有限公司硫酸亚铁FeSO47H2OAR天津市恒兴化学试剂制造有限公司硫酸锌ZnSO47H2OAR天津市化学试剂三厂硫酸锰MnSO4H2OAR上海实验试剂有限公司羧甲基纤维素钠C6H11NaO7AR上海山浦化工有限公司柠檬酸钠C6H5Na3O72H2OAR天津市天力化学试剂有限公司刚果红C32H22N6Na2O6S2AR湖南湘大化工试剂有限公司柠檬酸C6H8O7H2OAR上海国药集团化学试剂有限公司3,5-二硝基水杨酸C6H8O7H2OAR国药集团化学试剂有限公司琼脂AR武汉鼎国生物技术有限公司注：(1) AR: Analytical reagent 分析纯试剂(2) 主要分子生物学试剂见具体实验方法部分(1) DNS试剂：称取5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入10 g氢氧化钠，100 g酒石酸钾钠和250 ml水，加热溶解后再加入结晶酚1 g，无水亚硫酸钠0.5 g，待全部溶解后冷却，定容至500 ml，贮于棕色瓶中，放置一周后使用，使用前过滤。(2) l %刚果红试剂：称取刚果红试剂l g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100 ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。(3) 0.2 M Na2HPO4溶液：取17.907 g Na2HPO412H2O加水溶解，定容至250 ml。(4) 0.1 M柠檬酸：取5.2535 g柠檬酸加水溶解，定容至250 ml, pH 7.0。(5) pH 4.4 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液：量取205.875 ml 0.2M Na2HP04和44.125 m1，0.1 M柠檬酸于250 ml烧杯中，调pH值，贮于试剂瓶中备用。(6)1 %CMC溶液：取l g CMC粉末缓慢的加到l00 ml pH 4.4的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，边加边搅拌，并用热水浴使其充分溶解，转于试剂瓶并放冰箱保存。2.2.2 实验仪器高压蒸汽灭菌锅、细菌培养箱、离心机、分光光度计、震荡培养箱、水浴锅、普通光学显微镜、数字显微图像处理系统、激光共聚焦显微镜、PCR仪、电泳仪、冰箱、超净工作台、电热炉、紫外诱变箱、微波炉、PH计、电子天平等。2.3 培养基 (1) 羧甲基纤维素钠培养基I：CMC 20 g，NaCl 5.0 g，MgSO47H2O 0.2 g，KH2PO4 1.0 g，酵母浸出物5.0 g，蛋白胨10 g，水1000 ml，琼脂20 g，pH自然，121 灭菌20 min。 (2) 羧甲基纤维素钠培养基II：CMC 20 g，Na2HPO4 2.5 g，KH2PO4 0.5 g，白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，水1000 ml，琼脂20 g，pH自然，121 灭菌20 min。 (3) 发酵培养基：CMC 20 g，Na2HPO4 2.5 g，KH2PO4 1.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，水1000 mL，pH自然，121 灭菌20 min。(4) 滤纸条培养基：试管中加入上述无机盐溶液5 ml，加1条瓦特曼滤纸（6cm1cm）垂直立于试管中，并使一部分露出液面，加棉塞121 30 min灭菌。(5) 刚果红纤维素琼脂培养基：KH2PO4 0.5 g， MgSO47H2O 0.25 g，琼脂15 g，明胶2.0 g，CMC1.88 g，刚果红0.20 g，蒸馏水1000 ml，PH值自然。(6) PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 ml，自然PH。制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸2030 min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热融化后飞、再补足水分至1000 ml, 121 下灭菌20 min。(7) 察氏培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁(MgSO47H2O), 0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 ml。 (8) 改良马丁培养基：蛋白胨5.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，酵母浸出粉2.0 g， 硫酸镁0.5 g，葡萄糖20.0 g，水1000 ml。 (9) 基础培养基：(NH4)2SO4 2 g，MgSO47H2O 0.2 g，NaH2PO4.H2O 0.5 g, CaCl22H2O 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，蒸馏水1000 ml，pH 6.5。 (10) 明胶液化培养基：蛋白胨 5.0 g，葡萄糖20.0 g，明胶 200 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4，121 灭菌20 min。(11) 淀粉水解琼脂培养基：可溶性淀粉 20.0 g，MgSO47H2O 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1.0 g，琼脂 20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4，121 灭菌20 min。(12) 纤维素水解培养基：MgSO4 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1.0 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.2，滤纸条(长6 cm，宽1 cm)，分装于试管中，将滤纸条加入试管中，一半浸在液内，一半露在液面外，121 灭菌20 min。 (13) 硝酸盐还原培养基：琥珀酸钠 10 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.5 g，KCl 0.2 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2，分装于试管中，121 灭菌20 min。(14) 碳源利用培养基：(NH4)2SO4 2.64 g，K2HPO45.65 g，KH2PO42.38 g，MgSO47H2O 1.00 g，CuSO45H2O 0.0064 g, FeSO47H2O 0.0011 g，ZnSO47H2O 0.0015 g，MnCl24H2O 0.0079 g，蒸馏水1000 mL，pH 自然值。将其分装在10个试管中，并在试管中分别加入1%D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖、D-木糖、D-甘露醇、L-肌醇、L-阿拉伯糖和鼠李糖， 121 灭菌20 min。其中，蔗糖易在高温下被分解为葡萄糖和果糖，故采用过滤除菌的方法灭菌。 (15) 柴斯纳琼脂培养基：蛋白胨10 g，柠檬酸铁0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水 1000 mL，121 灭菌20 min。 (16) 保藏用真菌PDA培养基(g/l)：200 g马铃薯加水1000 mL煮费后，再小火煮30 rnin，8层纱布过滤，加蔗糖20 g，补水1000 ml，pH 6.5。2.4 菌种的分离与筛选2.4.1 分离与初筛菌株的方法：(1) 配CMC培养基，灭菌，倒平板。 (2) 制备土壤稀释液：称取土样10 g，放入盛90 ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。(3) 划线：用接种针蘸取适量稀释液在平板上划线，每个平板划3到5条线。(4) 培养将培养基平板倒置于28 温室中培养3日。 (5) 挑菌：将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到羧甲基培养基的平面上，置28 -29 温室中培养，待菌苔长出后，观察水解圈情况，将菌落用l mg/l果红染色5 min，将颜色变红的菌落继续划线分离。检查菌苔是否单纯也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养物。 (6)观察将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况及菌落形态等。2.4.2 菌株的复筛 （1）配CMC培养基，灭菌，倒平板。 （2）划线：用接种针挑取适量初筛的菌种在平板上划线，每个平板划3到5条线。 (3) 再次挑菌：将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到羧甲基培养基的平面上，置28 -29 温室中培养，待菌苔长出后，观察水解圈情况，将菌落用l mg/l果红染色5 min，将颜色变红的菌落继续划线分离。检查菌苔是否单纯也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养物。 (4) 观察将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况。2.5 纤维素酶活性测定2.5.1 绘制葡萄糖标准曲线 原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在540 nm处的吸光度，得出还原糖的量。配制方法：将葡萄糖放在80 烘干箱内烘干至恒重，然后精确称取0.040 g葡萄糖固体溶解于少量蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至20 ml，充分混匀，得浓度为2 mg/ml的葡萄糖标准溶液。标准曲线的绘制：用1000 ml移液枪分别量取0 l、200 l、400 l、600 l、800 l、1000 l、1200 l于7个干净的20 ml刻度试管中，用蒸馏水定容，得到浓度分别为：0 g/ml、20 g/ml、40 g/ml、60 g/ml、80 g/ml、l00 g/ml、120 g/ml的葡萄糖溶液。各取4 ml加入到已作好标记的带有刻度的试管中，再分别加入DNS试剂2 ml，加热煮沸5 min，取出置冷水中冷却，定容至6 ml，在722型分光光度计上测量吸光值(波长为540 nm，以浓度为0 g/ml的葡萄糖反应液体作空白对照)。2.5.2 粗酶液的制备 在250 ml三角瓶中装50 ml培养基，将各菌株接种，30 ，旋转摇床振荡培养24 h作种子液。用1000 l移液枪量取500 l转接于250 ml三角瓶中的50 ml培养基中，于30 振荡培养48 h，在4 ，8000 r/min离心20 min除去菌体。取上清液作为4 保存待用。2.5.3 酶活力测定方法 关于纤维素酶活力的测定方法很多，至今也没有统一定论，而且用不同方法测定，结果也存在一定差异。Teather等认为，对数酶浓度同刚果红染色水解圈存在线性关系，产酶越多，透明圈越大；产酶越快，透明圈出现越早。然而，虽然透明圈大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力。试验表明，液体样品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系，可以对酶活进行初步定量，但不能作为菌株产酶活力大小的唯一定量指标。因为刚果红纤维素平板筛选法受菌苔大小、菌苔在平板上的堆积情况、菌落之间相互位置和产物或分泌物的相互抑制、不同菌株生长和产酶速度、不同细菌细胞壁的特性等因素的影响，并不能精确反应纤维素酶活力的大小15。因此本试验最初以水解圈的大小来判定纤维素降解能力，进而筛选出纤维素降解能力较强的菌株。 2.5.3.1 CMC酶活测定 酶活力测定中大都采用DNS法来测定还原糖的生成量，因为该法简易、灵敏度较高，但是由于纤维材料水解的是包括葡萄糖、纤维二糖及几种纤维寡糖的混合物，因此以葡萄糖为标准反映出的还原糖生成量与实际还原糖的生成量有一定的差异，这种差异很小，一般的定糖方法无法解决，只有用高效液相色谱(HPLC)等分析方法才能实现16。由于实验条件和时间的限制，本试验以葡萄糖为标准测定还原糖含量，不考虑不同还原糖的差异。因此本试验采用DNS法来测定纤维素酶活力的大小，具体操作方法如下： 以2 ml 1.0 %CMC溶液为底物(用pH为4.4，浓度为0.2 mo1/l Na2HP04, 0.1 mol/l柠檬酸缓冲液配制)，加200 l上清液，再加2800 l蒸馏水，于50 保温30 min，然后加人2 ml DNS试剂，沸水浴5 min，然后一起放入凉水至室温，在540 nm测光密度值(OD540nm)，以相应空白样(2 ml1.0%CMC溶液为底物，3 ml灭菌的发酵培养液，于47 保温30 min，然后加入2 mL DNS试剂，沸水浴5 min，然后一起放入凉水至室温。2.5.3.2 FPA酶活测定取0.5 ml适当稀释的酶液，加入PH 4.4，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2 ml，加卷曲的瓦特曼滤纸（1 cm6 cm）一条，于50 酶解1 h，加入2.5 ml DNS显色液于沸水浴5 min，冷却后在540nm下测吸光度，酶液空白为将酶液于100 处理15 min，按上法测定，酶活力单位(U)为mg葡萄糖/h。2.5.4 酶活力计算方法 葡萄糖浓度计算公式： 根据葡萄糖标准曲线，将吸光度值代入一元线形回归方程，即可得到葡萄糖的浓度：x=(y+b)/k(ug/m1) ;x代表横坐标葡萄糖的生成量，葡萄糖浓度换算公式，见公式(2.1)：x2=4x1/3 ; (2.1)y代表纵坐标，b代表截距，k代表斜率；xl代表利用葡萄糖标准曲线获得的相应葡萄糖浓度；x2代表酶液作用一定量底物后生成的葡萄糖的浓度。 根据酶活力定义得，酶活力计算公式(2.2)：U=x/t*u (2.2)-U代表酶活，-t代表酶作用时间，-u代表稀释度酶活力单位定义为：在测定条件下，分解l% CMC溶液每分钟产生l g葡萄糖定义为1个纤维素酶活力单位。 筛选出产纤维素酶活力较高的菌株作进一步的鉴定和产酶条件的研究。2.6 形态特征观察2.6.1 菌落形态观察 纯化了的菌株分别划线和点种于平板上，30 培养，观察菌落形态。 显微镜水浸片观察法：取干净载玻片，加无菌水一滴，用接种环挑取少量菌体放入无菌水中，盖好盖玻片，镜检。 2.6.2 培养特征观察 将菌株分别接种在CMC培养基平板上，于30 培养，分别于7 d、15 d和30 d肉眼观察其培养特征及颜色变化，取成熟期的颜色作为定种的依据，观察和记录如下项目： 气生菌丝体颜色(指孢子丝未形成前的颜色)； 孢子丝和孢子的颜色(即成熟孢子堆的颜色)； 基质菌丝体的颜色(即菌落背面的颜色)。 另外，还要观察记录菌株在以上各种培养基上生长的情况，菌落的外观形态如粉状、绒状和棉絮状等作为参考特征17。 2.7 生理生化特性鉴定2.7.1 明胶液化试验1）灭菌的已溶化明胶液化培养基无菌操作分装于已灭菌的6支试管中，竖直放置于30 恒温箱中过夜。 2）将待鉴定的菌株穿刺接种于试管中，剩余两管作为空白对照。（每种菌均接两管作为平行对照）。 3）将接种了待鉴定菌株的试管和空白对照试管置于30 培养箱中培养。 4）分别在第3 d、5 d、10 d观察各试管的液化程度。在观察前先将试管放入冰箱中冷却0.5 h左右，如明胶凝成固体状态，说明不液化，如试管有液体出现，说明明胶己被液化。液化程度有快、慢、强、弱之分。 2.7.2 淀粉水解许多细菌产生淀粉酶，能水解培养基中的淀粉为无色糊精等小分子物质，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不变蓝色。具体方法如下：1）将刚灭菌的已溶化的淀粉培养基冷却至50 左右，无菌操作制成6个平板。 2）将待鉴定的菌株在不同的板上划线接种。（每种菌接两个平板，剩余两个作为空白对照） 3）将接种了待鉴定菌株的平板和空白对照平板倒置在30 培养箱中培养。4）观察各种细菌的生长情况，培养3-4 d，多数菌株已生长成熟。将平板打开盖子，滴入少量LUGOLS碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。 5）如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。 2.7.3 纤维素水解试验1）将刚灭菌的纤维素水解培养基放置于无菌操作台冷却。 2）将待鉴定的菌株接种在液面外一段滤纸条上，另留两管作为空白对照。 3）将接种了待鉴定菌株的试管和空白对照试管放置于试管架中，置于30 的培养箱中培养。 4）第5 d观察结果。如菌种能在滤纸条上生长，并分解纸条成一团松散纤维，或使之折断、碎裂成粉质状，表示该菌株产生纤维素酶，若纸条不被分解，则该菌株不产生纤维素酶。 2.7.4 硝酸盐还原某些细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨和氮等。如果培养基中的硝酸盐被还原为亚硝酸盐，当培养液中加入格里斯氏试剂时，则溶液成粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等。方法如下：1）将刚灭菌的硝酸盐还原培养基放置于无菌操作台冷却。 2）将待鉴定的菌株接种于试管中，另留两管作为空白对照。 3）将接种了待鉴定菌株的试管和空白对照试管放置于大小适宜的烧杯中固定。置于30 ，150 r/min的摇床中培养。 4）培养7 d和14 d，分别测定硝酸盐还原的情况。测定时，培养液倒出少许于干净离心管中，分别加入硝酸盐还原试剂A液和B液各2滴，如呈粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，即为阳性。如无红色出现，可滴加1-2滴二苯胺试剂，此时，如成蓝色反应，则表示培养基仍有硝酸盐，为阴性反应；如不成蓝色反应，表示硝酸盐和新生成的亚硝酸盐都已还原成其它物质，仍按阳性处理。 2.7.5 碳源利用1）将刚灭菌的各种碳源利用培养基放置于无菌操作台冷却。 2）将待鉴定的菌株接种于各个不同碳源试管中，另留两管作为空白对照。 3）将接种了待鉴定菌株的试管和空白对照试管放置于大小适宜的烧杯中固定。置于30 ，150 r/min的摇床中培养。 4）培养了5-14 d，分别观察记录生长情况。如菌种能在加该碳源的试管中生长，则表示该菌株能利用这种碳源，如果菌株不生长，与对照试管相同，则表示菌株不利用该碳源。 2.7.6 类黑色素的产生1）将刚灭菌的已溶化的酪氨酸培养基冷却至50 左右，分装于已灭菌的试管中制成斜面，置于30 恒温箱中过夜。 2）将待鉴定的菌株在斜面上划线接种，剩余两管作为空白对照。 3）将接种了待鉴定菌株的斜面和空白对照斜面放置在30 培养箱中培养。 4）培养3-7 d后观察，培养基被染成褐色或黑色即说明该菌产生黑色素。 2.7.7 硫化氢的产生 某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢。硫化氢遇铁盐会形成黑色沉淀物。因此在培养基中加热硫化氢也是鉴定菌种的一种方法，具体如下：1）将刚灭菌的已溶化的柴斯纳琼脂培养基冷却至50 左右，分装于已灭菌的试管中，竖直置于30 温箱中过夜。 2）将待鉴定的菌株穿刺接种于试管中，剩余两管作为空白对照。 3）将接种了待鉴定菌株的试管和空白对照试管放置在30 培养箱中培养。 4）培养2-4 d后观察，产生黑色素则表明该菌株产生硫化氢。 2.8 菌种保藏 纸绿，江白，江长毛，江短毛，江土利用PDA培养基保藏于-80 冰箱中，瘤黑利用改良的马丁培养基保藏与-80 冰箱中。3 结果与讨论3.1 初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述初筛后得到的各菌株的菌落形态特征如表3.1： 表3.1 初筛后各菌株的菌落形态菌株菌落颜色菌落边缘表面特征水解圈描述纸绿先期黄色 后期绿色不整齐，齿状表面光滑明显江白白色不整齐，齿状表面光滑明显江长毛乳白色 背面黄色不整齐，齿状表面光滑明显江短毛乳白色 背面红色不整齐，齿状表面光滑明显瘤黑黑色不整齐，齿状表面光滑明显江土正面带黄色的白色 背面显红色不整齐，齿状表面光滑明显3.2 复筛获得的菌株菌种分类鉴定结果 (1)纸绿 ：在PDA琼脂培养基上28培养，菌落初为白色絮状，继而转为浅绿色，后变为深绿色。菌落背面无色略灰色。在斜面上为葡萄白色气生菌丝，其边缘和末端为浅绿或深绿色的产孢子区。菌丝体有隔，透明，分枝繁茂，孢子梗分枝不翘则，对生或互生并有多极分枝而呈松柏状，分支末端为小梗。分生孢子呈椭圆形或卵圆形，光面有小疣状突出。根据图3.2菌落特征及3.1显微镜镜检结果推断此霉菌为绿色木霉18。图3.1 菌株在显微镜中的形态：在400倍电子显微镜下观察所得图3.2 纸绿在PDA培养基上生长情况(2)江土：在PDA琼脂培养基上28培养，菌落为带黄色的白色，背面显血红色。如图3.3,3.4,3.5所示。图3.3 江土菌株在显微镜中的形态：在400倍电子显微镜下观察所得图3.4 江土在PDA培养基上（正面）生长情况图3.5 江土在PDA培养基上（反面）生长情况(3)瘤黑：在PDA琼脂培养基上28培养，菌落显黑色，孢子黑色，后期孢子很多，很干燥，生长旺盛。菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，