L-苹果酸测定试剂盒.doc

北京百奥康生物技术有限公司L-苹果酸测定试剂盒(L-MALATE)操作说明书K-LMALR (58次测定)K-LMALL (116次测定)简介:L-苹果酸广泛存在于葡萄酒、啤酒、面包、果汁和蔬菜制品中，是果酸中的最重要的一部分成分，对于葡萄酒酿造工业，L-苹果酸和L-乳酸是两项非常重要的监测指标。Megazyme公司提供多种L-苹果酸测定方法，其中我们提供的MegaQuantTM 计量仪具有价格便宜、使用简单、结果准确等特点，适合众多的实验室使用。原理:测定L-苹果酸需要进行两步酶解反应，第一步：在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的催化作用下，L-苹果酸被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸(1) L-苹果酸 + NAD+ (L-MDH) oxaloacetate + NADH + H+第二步：加入过剩的L-谷氨酸，在谷草转氨酶的作用下，生成L-天门冬氨酸和2酮戊二酸(2) Oxaloacetate + L-glutamate (GOT) L-aspartate + 2-oxoglutarate生成的NADH的量取决于L-苹果酸的量，NADH的吸光度值可在340下测量。基于此原理的方法被IFU,AIJN, MEBAK和OIV广泛推荐使用，并得到了AOAC的认可，在欧洲众多的国家中都被作为国标方法使用。特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定L-苹果酸含量的。最小可调吸光光度为0.005个吸光单位，样品体积为2.00 mL（或对于浓度为2.49 mg/L样品体积为0.10 mL），若在340nm下检测,此时的L-苹果酸浓度为0.12 mg/L。如果最小可调吸光光度为0.010吸光光度，样品体积为2.00 mL，在340nm下检测,此时的L-苹果酸检测线为0.25 mg/L。该实验的测量范围为0.5-30ugL-苹果酸，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化，对于样品体积为0.10 mL，此时的L-苹果酸浓度大约在2.49-4.98 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。干扰:如果L-苹果酸在试验规定的时间内（大约3分钟）完成转化过程，通常认为没有干扰发生，然而，通过向已完成反应的试管中添加L-苹果酸（0.1mL中添加15ug），进一步的验证实验，吸光度值还将进一步增加。利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。定量回收试验：通过向样品中添加标准质控，计算样品在处理和提取时的损失。如：在最初的提取步骤时添加一定量的L-苹果酸。试剂中合成的PVP可以有效的防治样品中多酚（丹宁酸）对试验的抑制安全性:L-苹果酸测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。试剂盒:MegazymeL-苹果酸含量测定试剂盒可以进行58次/116次的测定试验，并提供有全部的试验方法：58次测定试剂盒(cat. no. K-LMALR)瓶1: 双甘氨肽缓冲液 (6 mL, 1.0 M, pH10.0) +L-谷氨酸1 M)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性 2年，4C保存。瓶2: NAD+(380 mg)+ PVP (60 mg)稳定性 5年，-20C保存。瓶3: 谷草转氨酶(600 U/mL)，悬浮液1.25 mL.稳定性 2年，4C保存。瓶4: L-苹果酸脱氢酶(1.25 mL, 15,000 U/mL)稳定性 2年，4C保存。瓶5: L-苹果酸质控标准液(5 mL, 0.15 mg/mL) 稳定性 2年，4C保存。116次测定试剂盒(cat. no. K-LMALL)瓶1: 双甘氨肽缓冲液 (12 mL, 1.0 M, pH10.0) +L-谷氨酸1 M)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性 2年，4C保存。瓶2: NAD+(380 mg)+ PVP (60 mg)稳定性 5年，-20C保存。瓶3: 谷草转氨酶(600 U/mL)，悬浮液2.5 mL.稳定性 2年，4C保存。瓶4: L-苹果酸脱氢酶(2.5 mL, 15,000 U/mL)稳定性 2年，4C保存。瓶5: L-苹果酸质控标准液(5 mL, 0.15 mg/mL) 稳定性 2年，4C保存。试剂制备:1. 备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用。2. 用6mL 蒸馏水溶解瓶2，按照试验用量分装到试管中，保存于-20C，不要同时溶解2瓶瓶2内的内容物（116次测定包装），一旦溶解，保存于-20C下稳定性 2年。3 & 4. 准备瓶3和瓶4种的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。5. 准备瓶5溶液。注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用L-苹果酸标准质控溶液进行测定，通过测量NADH的消光系数而计算L-苹果酸的浓度。实验需要的设备:1. 玻璃试管(圆底; 16 x 100 mm).2. 比色管(1 cm light path, 3.0 mL).3. 微量移液器(20和100uL).4. 连续分配器5. 分析天平.6. 分光光度计340 nm.7. 漩涡混合器8. 定时钟9. Whatman No.1 (9 cm)滤纸操作步骤:波长: 340 nm比色杯: 1 cm light path (玻璃或塑料)温度: 25C最终体积: 2.34 mL样品溶液: 每个比色杯中含有0.5-30ug L-苹果酸（存在于0.10-2.0 mL样品溶液中）空白调 0：相对于空气或者水溶液空白管样品管蒸馏水( 25C)样品溶液1(双甘氨肽缓冲液l)溶液2(NAD+缓冲液)悬浮液3（GOT）2.10 mL0.10 mL0.10 mL0.02 mL2.00 mL0.10 mL0.10 mL0.10 mL0.02 mL混合*，在反应大约3分钟后读取溶液的吸光度值(A1)，然后立即添加下列试剂继续反应悬浮液4(L-MDH)0.02 mL0.02 mL混合*，在停止反应后（大约3分钟）读取溶液(A2)的吸光度值。* 用塑料棒搅拌或用试管塞封闭严实后轻轻颠倒计算:分别对空白管和样品管两次测得的吸光度值进行相减(A2-A1)，这样就获得了AL-苹果酸，按照常规AL-苹果酸 的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算:C = V x MW x D AL-苹果酸 g/Lx d x v注释:V = 最终体积 mLMW = L-苹果酸分子量g/mol = NADH在340 nm下的消光系数 = 6300 l x mol-1 x cm-1d = 比色管管径 cmv = 样品体积 mL简化公式:C = 2.34 x 134.09 x DAL-苹果酸 g/L6300 x 1 x 0.10= 0.4980 x DAL-苹果酸 g/L如果样品在制备过程中被稀释了，计算结果还必须乘以稀释系数F。当被分析的物质为固体或半固体时，L-苹果酸含量(g/100 g)依照下列公式计算：L-苹果酸含量 = CL-苹果酸 g/L 样品溶液 x 100 g/100 g样品重量 g/L 样品溶液制备样品:1. 稀释样品.比色杯中（如：分析0.1 mL的样品）的L-苹果酸含量必须在0.5-30ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.005 -0.30 g/L之间。估计L-苹果酸浓度(g/L)蒸馏水稀释稀释系数F30不用稀释1 + 91 + 991 + 9991101001000如果A L-苹果酸 的数值太低(如 0.1 mL的未被稀释的酸性样品（如果汁），必须用2 M NaOH调节pH到大约9.0，然后在室温中孵育30分钟。(c) 含二氧化碳样品: 样品中含有大量的二氧化碳，如：啤酒，必须用2 M NaOH调节pH到大约9.0，并缓慢的用玻璃棒搅拌。(d) 有颜色的样品: 测试中附加样品空白，如：不含有L-MDH的样品。(e) 重颜色的样品: 如果未经稀释的样品颜色非常深，需要向每100mL的样品中加入2g聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），充分混合5分钟，然后用Whatman No. 1滤纸过滤。(f) 固体样品: 加入蒸馏水均质或粉碎固体样品，然后过滤。(g) 样品含有脂肪: 需要用超过脂肪沸点的水进行提取，如：将100mL容量瓶加热到20C，然后补液至刻度线，放置冷藏箱中15-30分钟，过滤，弃去最初的几mL滤液，选择澄清的或稍有些乳白色的悬浮液进行测试。也可以选择使用Carrez 溶液进行澄清。(h) 样品中含有蛋白: 加入等量的冰冷的1 M 的高氯酸，充分混合，在1,500g下离心10分钟，然后用1M的KOH中和提取液。或者也可使用Carrez溶液去除样品中的蛋白。样品处理事例:(a) 测定葡萄酒中的L-苹果酸F含量测定白/红葡萄酒中的L-苹果酸含量，样品通常不需要处理，可直接进行测定。如有必要可以进行稀释。(b) 测定葡萄酒中的L-苹果酸及其酯化衍生物F + E含量20mL 葡萄酒中加入6 mL NaOH（2 M），加热回流30分钟，待溶液温度冷却后，用1 M H2SO4调解pH至10.0，然后用蒸馏水补液至50mL，按照常规方法进行测定，得到的浓度为L-苹果酸及其酯化衍生物F + E的总浓度，因此可以按照下列公式计算出酯化衍生物的浓度：E = F + E F g/L(c) 测定果汁和类似饮料中的L-苹果酸的含量澄清的中性溶液通常不需要处理，可以直接进行测定，如有必要可以进行稀释。浑浊的液体在稀释前首先需要过滤，有颜色的溶液通常在稀释到适当浓度后也可以进行分析。(d) 测定固体粮食中的L-苹果酸的含量分虽10g样品。准确称取2g有代表性的样品，加入40mL蒸馏水，在60C下加热30分钟，然后将提取液转移到50mL的容量瓶中，用蒸馏水补液至刻度线，如果有必要可以进行过滤并稀释。参考文献:1. Mollering, H. (1985). L-Malate. In Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.), 3rd ed., Vol.VII, pp. 39-47, VCH Publishers (UK) Ltd., Cambridge, UK.2. AOAC Official Methods of Analysis (2002). Method 993.05 “L-Malic acid/total malic acid ratio in apple juice”. 17th ed., Chapter 37, p. 15.3. Gorin, N. (1976). Differences in L-malate determined enzymatically or titrimetrically in golden delicious apples. Zeitschrift fur Lebensmittel-Unterschung und-Forschung 162, 259-261.94. Klopper,W. J.,Angelino, S.A. G. F.,Tuning, B. & Vermeire, H.A. (1986). Organic acids and glycerol in beer. J. Inst. Br