九血清学试验及项目管理知识分析.ppt

血清学试验 一 抗原 Antigen Ag 能刺激机体产生特异性免疫应答 且能与其免疫应答产物 抗体或致敏淋巴细胞 在体内或者体外结合 并发生一系列生物学效应的物质 T细胞 B细胞 一 抗原的两种基本特性1 免疫原性指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答 产生特异性抗体及免疫效应细胞 的性质 抗体 2 抗原性 又称免疫反应性 指抗原分子与免疫应答产物 抗体或免疫效应细胞 发生特异性结合的性质 1 抗原本身的理化性质2 抗原与机体的相互作用 免疫方式 1 异物性 非己的异物 异种物质 病原微生物 异种蛋白 药物种系关系相差越远 免疫原性越强同种异体 血型抗原 血清蛋白自身物质 精子 晶状体蛋白等 2 表面具有复杂化学结构的大分子 在一定范围内 分子量越大 结构越复杂 其表面抗原决定簇越多 免疫原性越强 二 构成抗原的基本条件 三 抗原的特异性 物质基础 抗原决定簇 特异抗原只能刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 且仅能与该特异性抗体或淋巴细胞结合并相互作用 抗原决定簇 AD 概念 抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团 又称为表位AD的数目 性质和空间构象决定抗原特异性抗原以AD与相应抗原受体及抗体特异性结合 二 抗体 Antibody Ab 机体免疫细胞被抗原激活后 由B细胞分化成熟的浆细胞合成 分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 1 定义 抗体和化学结构与抗体相似的球蛋白的统称 2 存在形式 膜型 B细胞膜上的抗原受体分泌型 分泌进入血清等体液中 介导体液免疫应答 1 免疫球蛋白的分子结构 1 重链 H链 和轻链 L链 2 可变区 V区 和恒定区 C区 3 铰链区4 水解片段 1 免疫球蛋白的分子结构 2 免疫球蛋白的生物学特征 主要功能 以lgG为例VH和VL区 特异性识别 结合AgCH1和CL区 遗传标记CH2 补体的结合点CH3 细胞表面FC受体的结合点 三 补体系统 补体 活化后具有酶活性的蛋白质 可辅助抗体介导的溶菌作用 是抗体发挥溶细胞作用的必要补充补体系统是由存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组可溶性蛋白及存在于血细胞与其它细胞表面的一组膜结合蛋白和补体受体所组成 1 组成2 激活途径3 补体的生物学作用 细胞毒及溶菌 溶病毒作用 补体激活产生MAC 形成穿膜的通道 导致细胞崩解 调理作用 通过与吞噬C表面结构结合而促进其吞噬作用 抵抗全身性细菌和真菌感染的主要机制之一 免疫粘附作用 抗原 抗体复合物 活化补体 与补体受体阳性细胞粘附 将抗原 抗体复合物转移至肝 脾 巨噬C清除 炎症介质作用 C3a C5a 与肥大C 嗜碱粒C表面受体结合 触发靶C脱颗粒 释放组胺等介质 介导局部炎症反应 补体功能及生物学意义 抗体产生的一般规律 抗体产生规律可分为初次应答和再次应答初次应答 潜伏期长 效价低 持续时间短 免疫作用不强再次应答 潜伏期短 抗体产生量大 维持时间长 抗体产生的一般规律 血清学试验 定义 是指相应的抗原和抗体在体外进行的结合反应试验材料 含有抗体的血清 抗原物质原理 抗原和抗体具有高度特异性 血清学试验的一般特点 特异性可逆性比例性阶段性稳定性 特异性 特异性是指任何一种抗原分子 只能与由它刺激所产生的抗体发生反应 因为抗体CDR与抗原决定簇在化学结构和空间构型上呈互补关系 这种高度的特异性在传染病的诊断 防治等医学和生物学领域都已得到了广泛的应用 大多数天然抗原物质的构成复杂 常含有多种抗原决定簇 如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇 则可与彼此相应的抗血清出现交叉反应 crossreaction 可逆性 可逆性是指在一定条件 如低pH 高浓度盐等 下 抗原抗体复合物分子间作用力减弱而导致解离 回复到抗原与抗体的游离状态 抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则 其反应式为 抗原抗体反应平衡取决于两个因素 一是抗原抗体亲合力大小 二是环境因素对复合物的影响 比例性 比例性是指多价抗原与抗体反应 只有当二者浓度比例适当时 才形成大的抗原抗体结合物 产生凝集 沉淀等可见反应 把最迅速出现可见反应时的抗原抗体的浓度比或量比 称为抗原抗体反应的等价点 equivalencepoint 抗原与抗体比例最合适的范围称等价带 equivalencezone Marrack提出的网格学说解释了抗原抗体反应比例性的机制 网格学说 当多价抗原与多价抗体在等价带结合时 相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体 形成肉眼可见的沉淀物 当抗原或抗体过剩时 由于过剩方的结合价得不到饱和 只能形成较小复合物 不能出现可见反应 血清学试验的影响因素 影响抗原抗体反应的因素较多 主要有两方面 一方面是受到抗原 抗体的自身因素的影响 另一方面是受到电解质 酸碱度 温度及时间等实验环境因素的影响 一 反应物自身因素 抗原 理化性状 表位种类和数目抗体 来源 特异性 亲和性 效价 抗原的理化性状 抗原决定簇的数目和种类均可影响血清学反应结果例如 可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀 而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集 1 抗原 抗体是血清学反应中的关键因素 对反应的影响表现在以下三个方面 1 来源 来自不同动物的免疫血清 其反应性有差异 家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带 通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物 马等大动物和人的免疫血清等价带较窄 少量的抗原或抗体过剩 均可形成可溶性免疫复合物 2 抗体 2 特异性与亲和力 特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关键因素 它们共同影响试验结果的准确程度 用于诊断的试剂必须尽量选用特异性高 亲和力强的抗体 才能保证和提高试验结果的可靠性 3 浓度 抗体的浓度往往是与抗原相对而言 合适的浓度才出现明显的反应现象 因此许多试验应进行抗体预滴定 找出最适反应浓度 电解质 生理盐水或缓冲液酸碱度 pH6 pH9温度 15 40 37 最适 二 环境因素 l 电解质 抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性 此时易受电解质影响 如有适当浓度电解质存在 就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀 出现可见反应 若无电解质存在 则不出现可见反应 通常在血清学试验中 以8 5g LNaCl溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液 其中Na 和Cl 可分别中和胶体颗粒上的电荷 使胶体颗粒的电势下降 形成可见的沉淀物或凝集物 但如果电解质浓度过高 则会出现非特异性蛋白质沉淀 即盐析 2 酸碱度合适的pH是抗原抗体反应的必要条件之一 血清学试验一般以pH6 9为宜 超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质 导致假阳性或假阴性结果 当pH为3左右时 接近细菌抗原的等电点 可出现非特异性酸凝集 造成假象 3 温度抗原抗体反应一般在15一40 范围内均可进行 最适温度为37 在此范围内温度越高 分子运动速度加快 增加抗原抗体接触机会 反应速度越快 但亦容易引起复合物解离 温度越低 反应速度缓慢 但抗原抗体结合牢固 易于观察 某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度 如冷凝集素在4 时与红细胞结合 20 以上反而解离 4 作用时间 抗原抗体反应应有足够的时间 不同反应时间不同 此外 抗原抗体反应在液相中反应时 适当振荡与搅拌 也可促进抗原抗体分子的接触 加速反应 主要的抗原抗体反应 1 凝集反应 Agglutination 2 沉淀反应 Precipitation 3 补体结合试验 Complementfixationtest CFT 4 中和试验 Neutralizationtest 1 凝集反应 Agglutination 颗粒性抗原 完整的细菌细胞或红细胞等 与其相应的抗体在合适条件下反应并出现凝集团的现象 用于凝集反应中的抗原称凝集原 agglutinogen 用于凝集反应中的抗体称凝集素 agglutinin 2 沉淀反应 Precipitation 可溶性抗原 蛋白质 多糖或类脂溶液 血清 细菌抽提液 组织浸出液等 与其相应的抗体在合适条件下反应并出现沉淀物的现象 用于沉淀反应中的抗原称沉淀原 precipitonogen 用于沉淀反应中的抗体称沉淀素 precipitin 3 补体