GC-MS接口.doc

目前常用的GCMS接口 1直接导入型接口（Direct coupling） 内径在0.25至0.32mm的毛细管色谱往的载气流量在12mlmin。这些柱通过一根金属毛细管直接引入质谱仪的离于源）这种接口方式是迄今为止最常用的一种技术。毛细管柱沿图中箭头方向插入，直至有12mm的色谱柱伸出该金属毛细管。载气和待测物一起从气相色谱柱流出立即进入离子源的作用场。由于载气氦气是惰性气体不发生电离，而待测物却会形成带电粒于。待测物带电粒子在电场作用下加速向质量分析器运动，而载气却由于不受电场影响，被真空泵抽走，接口的实际作用是支撑插入端毛细管，使其准确定位。另一个作用是保持温度，使色谱柱流出物始终不产生冷凝。 使用于这种接口的载气限于氦气或氢气。当气相色谱仪出口的载气流量高于2m1rnin时，质谱仪的检测灵敏度会下降。一般使用这种接口，气相色谱仪的流量在0.71.0m1min。色谱柱的最大流速受质谱仪真空泵流量的限制。最高工作温度和最高柱温相近。接口组件结构简单，容易维护。传输率达100，这种联接方法一般都使质谱仪接口紧靠气相色谱仪的侧面。这种接口应用较为广泛。2开口分流型接口（open-Split Coupling）色谱柱洗脱物的一部分被送入质谱仪，这样的接口称为分流型接口。在多种分流型接口中开口分流型接口最为常用。 图6.2 开口分流型接口工作原理 1 限流毛细管；2 外套管；3 中隔机构；4 内套管 气相色谱柱的一段插入接口，其出口正对着另一毛细管，该毛细管称为限流毛细管。限流毛细管承受将近0.1MPa的压降，与质谱仪真空泵相匹配，把色谱柱洗脱物的一部分定量地引入质谱仪的离子源。内套管固定插色谱柱的毛细管和限流毛细管，使这两根毛细管的出口和入口对准。内套管置于一个外套管中，外套管充满氦气，当色谱柱的流量大于质谱仪的工作流量时，过多的色谱柱流出物和载气随氦气流出接口；当色谱往的流量小于质谱仪的工作流量时，外套管中的氦气提供补充。这种接口结构也很简单、但色谱仪流量较大时，分流比较大、产率较低，不适用于填充柱的条件。 3.喷射式分子分离器接口 常用的喷射式分子分离器接口工作原理是根据气体在喷射过程中不同质量的分子都以超音速的同样速度运动，不同质量的分子具有不同的动量。动量大的分子，易保持沿喷射方向运动，而动量小的易于偏离喷射方向，被真空泵抽走。分子量较小的载气在喷射过程中偏离接受口，分子量较大的待测物得到浓缩后进入接受口。喷射式分子分离器具有体积小热解和记忆效应较小，待测物在分离器中停留时间短等优点。下面是Ryhage型分子分离器接口的工作原理图。 图6.3Ryhage型喷射式分子分离器工作原理 气相色谱柱洗脱物进入图中左边的三角形腔体后，经直径约为0.1mm的喷嘴孔以超声膨胀喷射方式向外喷射，通过约为0.150.3mm的行程，又进入更细的毛细管，进行第二次喷射分离。Ryhage型喷射式分子分离器浓缩系数与待测物分子量成正比，可适用于各种流量的色谱柱。主要缺点是对易挥发的化合物的传输率不够高。六、气相色谱质谱联用中的衍生化方法在GCMS方法分析实际样品时，对羟基、胺基、梭基等官能团进行衍生化往往起着十分重要的作用。主要有以下一些益处：改善了待测物的气相色谱性质。待测物中一些极性较大的基团的存在，如羟基、羧基等气相色谱特性不好，在一些通用的色谱柱上不出峰或峰拖尾，衍生化以后，情况改善。改善了待测物的热稳定性。某些待测物，热稳定性不够，在气化时或色谱过程中分解或变化，衍生化以后，待测物定量转化成在GCMS测定条件下稳定的化合物。改变了待测物的分子质量。衍生化后的待测物绝大多数是分子量增大，有利于使待测物和基质分离，降低背景化学噪音的影响。改善了待测物的质谱行为。大多数情况下，衍生化后的待测物产生较有规律、容易解释的质量碎片。引入卤素原子或吸电子基团，使待测物可用化学电离方法检测。很多情况下可以提高检测灵敏度，检测到待测物的分子量。通过一些特殊的衍生化方法，可以拆分一些很难分离的手性化合物。七、气相色谱-质谱联用质谱谱库和计算机检索 随着计算机技术的飞速发展，人们可以将在标准电离条件（电子轰击电离源，70eV电子束轰击）下得到的大量已知纯化合物的标准质谱图存贮在计算机的磁盘里，作成已知化合物的标准质谱谱库，然后将在标准电离条件下得到的。已被分离成纯化合物的未知化合物质谱图与计算机内存的质谱谱库内的质谱图按一定的程序进行比较，将匹配度（相似度）高的一些化合物检出，并将这些化合物的名称、分子量、分子式、结构式（有些没有）和匹配度（相似度）给出，这将对解析未知化合物，进行定性分析有很大帮助。目前，质谱谱库已成为GC-MS联用仪中不可缺少的一部分，特别是用GC-MS联用仪分析复杂样品，出现数十个甚至上百个色谱峰时，要用人工的方法对每一个色谱峰的质谱图态解析，那是十分困难的，要耗费大量的时间和人力。只有利用质谱谱库和计算机检索，才能顺利、快速地完成GC-MS的谱图解析任务。 用标准电离条件电子轰击电离源，70eV电子束轰击已知纯有机化合物，将这些标准质谱图和有关质谱数据存贮在计算机的磁盘中就得到了质谱谱库，目前最常用的质谱谱库有以下一些： （1） NIST库由美国国家科学技术研究所（National institute of Science and Technology）出版，最新版本收有64K张标准质谱图。（2） NISTEPANIH库、是由美国国家科学技术、研究所（NIST）、美国环保局（EPA）和美国国立卫生研究院（NIH）共同出版，最新版本收有的标准质谱图超过129K张，约有107K个化合物及结构式。（3） Wiley库有3种版本，第六版本收有标准质谱230K张。（4）农药库（Standard Pesticide Libraray）内有340个农药的标准质谱图。（5）药物库（Pfleger Drug Libraray）内有4370个化合物的标准质谱图，其中包括许多药物、杀虫剂、环境污染物及其代谢产物和它们的衍生化产物的标准质谱图。（6）挥发油库（Essential Oil Libraray）内有挥发油的标准质谱图。在这6个质谱谱库中前三个是通用质谱谱库，一般的GCMS联用仪上有配有其中的一个或两个谱库。后三个是专用质谱谱库，根据工作的需要可以选择使用。第二节液相色谱质谱联用 液相色谱质谱（liquid chromatographymass spectrometry，LCMS）联用技术的研究开始于20世纪70年代，与气相色谱质谱（gaschromatographmass spectrometry，GCMS）联用技术不同的是液相色谱质谱联用技术似乎经历了一个更长的实践、研究过程，直到90年代方出现了被广泛接受的商品接口及成套仪器。 按照联用的要求， LCMS的在线使用首先要解决的问题是真空的匹配。质谱的工作真空一般要求为105Pa，要与一般在常压下工作的液质接口相匹配并维持足够的真空，其方法只能是增大真空泵的抽速，维持一个必要的动态高真空。所以现有商品仪器的LCMS设计均增加了真空泵的抽速并采用了分段、多级抽真空的方法，形成真空梯度来满足接口和质谱正常工作的要求。 除真空匹配之外，液质联机技术发展可以说就是接口技术的发展。扩大LCMS应用范围以使热不稳定和强极性化合物在不加衍生化的情况下得以直接分析并将质谱分析用于生物大分子是液质接口技术的发展方向。 LCMS各种“软”离子化接口的开发正是迎合了这个方向。 某些特定的接口（如电喷雾接口）可使蛋白质及其他生物大分子得以多重质子化，产生多电荷离子。多电荷离子的产生使得质谱的分子量测定范围大大拓宽，单电荷质量数范围为2000u的质谱可以比较准确地测定几十万甚至上百万u的分子量，这样就真正地将质谱分析带入了蛋白质和生物高聚物的研究领域。 液质联机技术在发展过程中曾有多种接口提出，这些接口都有自己的开发、完善过程，都有各自的长处和缺点，有的最终形成了被广泛接受的商品接口，有的则仅在某些领域，在有限的范围内被使用，由于在接口技术的发展中，新的接口往往是在老接口的基础上改进发展起来的，在技术上存在着内在的联系。一、 液相色谱质谱联用的接口1直接液体导人接口 最初的直接液体导人（DLI）接口出现于20世纪70年代，但这一技术始终停留在实验室使用阶段，没有真正形成商品化仪器。 DLI接口是在真空泵的承载范围内，以细小的液流直接导入质谱。实际操作中，LC的柱后流出物经分流，在负压的驱动下经喷射作用进入脱溶剂室形成细小的液滴并在加热作用下脱去溶剂。脱溶剂的同时没有离子产生，其离子化过程出现在离子源内，是被分析物分子和溶剂作用的结果，因此它应归于化学电离一类技术。其碎片依然是靠EI源的电子轰击产生。 DLI技术中的喷射方式可以是金属毛细管（2050m），也可以是起“筛网”作用的带孔薄膜（25m）。作用都是为了得到细小、均匀的液滴。在以后的各种接口技术的讨论中，我们可以看到这细小液滴的形成，无论采用何种技术手段，对于离子化过程都是最为基本、必要的一步。 DLI是液质方法的最简单的接口，造价低廉，但它无法在大流量下工作，是其应用受到局限的主要原因。此外，喷口易堵塞也是实际操作中的主要问题。2移动带技术 移动带（MB）技术早在20世纪70年代中期就已经有了最初的设计，所谓移动带是在LC柱后增加了一个移动速度可调整的流出物的传送带，柱后流出物滴落在传送带上，经红外线加热除去大部分溶剂后进入真空室，传送带的调整依据流动相的组成进行，流量大，含水多时带的移动速度要相应的慢一些。在真空中溶剂被进一步脱去，同时出现分析物分子的挥发。离子化是以EI或CI进行，有的仪器也曾使用FAB（快原子轰击电离源）。由于使用了EI源，用MB技术可以得到与GCMS相同的质谱图，这样就可使用多年研究积累的EI质谱数据库进行检索，这是它的一个长处。 MB技术分离溶剂和被分析物是基于二者沸点上的差别，从这个意义上讲它可以被用于大部分有机化合物的质谱分析，但沸点很高即便是在源内真空下仍无法显著挥发的化合物则无法分析。 MB技术的主要问题在于它的低离于化效率及相应的低灵敏度，在许多场合下，不能满足日益提高的质谱分析要求。此外，移动带上残存的难挥发物质如果无法去除干净，容易造成记忆效应而干扰分析。3热喷雾接口 出现于20世纪80年代中期的热喷雾（TS）接口是一个能够与液相色谱在线联机使用的LCTSMS“软”离子化接口，得到了比较广泛的应用，获得了大量的成功分析的实例。热喷雾接口设计中喷雾探针取代了直接进样杆的位置，流动相经过喷雾探针时被加热到低于流动相完全蒸发点510的温度，体积膨胀后以超声速喷出探针形成由微小的液滴、粒子和蒸气组成的雾状混合物。按照离子蒸发理论及气相分子离子反应理论的解释，被分析物分子在此条件下可以生成一定份额的离子进入质谱系统以供检出。热喷雾接口的主要特点是可以适应较大的液相色谱流动相流速（约1.0 mlmin），较强的加热蒸发作用可以适应含水较多的流动相，这是其他LC-MS接口，甚至包括某些新近研发的接口也不具备的特点。气相离子-分子反应主要是指热喷雾技术中加入的挥发性电解质醋酸铵在被加热时产生大量的气态NH4+以及H3O+和CH人阶。这些离子均可与被分析物加成并使其离子化。与其他的离子化手段一样，热喷雾中某些极性化合物的离子也可没有加成反应发生时在一定的溶剂系统（如：水）中预先形成离子并在脱去溶剂后进入气相。因此热喷雾中对这些化合物的离子化往往不需要灯丝的电离作用，在分析实践中被称为“灯丝关闭”操作。“灯丝开启”时，电子束同时轰击溶剂和分析物分子，分析物分子电离后直接被检出，而溶剂分子电离后成为反应试剂与分析物分子加成而产生离子。由于多种离子化过程的共存，碎片、准分子离子峰和分子加成物均可能出现，使得TS谱图较之其他离子化手段所得的图谱要复杂些。 热喷雾接口的使用局限于分子量为2001000u的化合物，同时对热稳定性较差的化合物仍有比较明显的分解作用。图 热喷雾 -接口示意电阻式加热毛细管；液流；放电电极；热喷雾离子源壳体 （加热的）；推斥极；至粗抽真空泵；质谱计离子光学系统4. 粒子束接口 粒子束接口（PB）是20世纪80年代出现的另一种应用比较广泛的LCMS接口，又称为动量分离器（momentum separator）。PB接口研制成功后，很快地由仪器厂商开发成为商品仪器并在很大程度上取代了MB技术。在PB操作中，流动相及被分析物被喷雾成气溶胶，脱去溶剂后在动量分离器内产生动量分离，而后经一根加热的转移管进入质谱。在此过程中分析物形成直径为m或小于m级的中性粒子或粒子集合体。由喷嘴喷出的溶剂和分析物可以获得超声膨胀并迅速降低为亚声速。由于溶剂和分析物的分子质量有较大的区别，二者之间会出现动量差；动量较大的分析物进入动量分离器，动量较小的溶剂和喷射气体）（氦气）则被抽气泵抽走。动量分离器一般由两个反向安置的锥形分离器构成，可以重复进行上述过程，以保证分离效率。PB的离子化仍由质谱的EI或CI方式进行，可以获得经典的质谱图，并可以使用谱库检索，分析工作获得很大便利，但由于离子化手段仍为电子轰击、不是“软”离子化方式，因此它不太适合热不稳定化合物的分析。PB接口主要用于分析非极性或中等极性的，分子量小于1000u的化合物。该技术在分析农药、除草剂、临床药物及染料方面曾有过许多报道和成功的分析实例。图粒子束接口示意 5快原子轰击 用加速的中性原子（快原子）撞击以甘油（底物）调和后涂在金属表面的有机化合物（“靶面”）而导致这些有机化合物电离的方法称之为快原子轰击（FAB），FAB是在最初用于无机化合物表面分析的离子轰击源（FIB）的基础上发展起来的，是20世纪80年代中发展的一种新型电离源，是一种“软”离子化技术。以电子轰击气压约为100Pa的中性气体（氖或氦），产生的惰性气体离子经聚焦和加速后撞击靶面导致分析物的离子化是所谓离子轰击作用。在此基础上将氖离子还原为中性原子，再以加速的中性原子撞击“靶面”即为快原子轰击。分析物经中性原子的撞击获取足够的动能可以离子或中性分子的形式由靶面逸出，进入气相。产生的离子一般是准分子离子。无论是FAB或是FIB都是“冷”离子源，对热不稳定、难以气化的化合物分析有独到的长处。尤其是它对肽类和蛋白质分析的有效性，在电喷雾接口出现前是其他接口无法相比的。FAB在肽类和蛋白质分析方面有大量的报道和成功的蛋白质分析实例，显示出在此领域内很强的实用性。由于它的特殊的制样方法，FAB的一个很大的问题是混合物样品中共存物质的干扰，它们常常会抑制分析物的离子化，造成灵敏度下降甚至根本没有信号产生。 作为联机使用技术，它的主要缺点是只能在低流量下工作（5lmin，严重限制了液相柱的分离效果。流动相中含有的15的甘油会使离子源很快变脏，所以有人将FAB和LC-CFFAB-MS称为“脏”离子化技术。6激光解吸离子化和基质辅助激光解吸离子化 基质辅助激光解吸（MALDI）离子化技术首创于1988年，是在1975年首次应用的激光解吸（LD）离子化技术上发展起来的，目前已经得到了广泛的接受和应用。随着肽类合成和基因工程科学的快速发展，迫切需要一种高灵敏度和准确的方法来测定肽类和蛋白质的分子量。MALDI具有很大的潜力来适应这一需要。目前开发出的MALDI接口仪器可以测定高达上百万u的分子量，其精度可达0.2，所需样品量一般为50pmol100fmo1。这样一个灵敏度可以和反相HPLC（UV检测器）相比，甚至还要高于HPLC。MALDI以激光照射靶面的方式提供离子化能量，样品底物中加入某些小分子有机酸，如肉桂酸、芥子酸等作为质子供体（donor）。一般MALDI的操作是将液体样品加入进样杆中，经加热、抽气使之形成结晶。将进样杆推入接口，在激光的照射和数万伏高电压的作用下，肉桂酸可以将质子传递给样品分子使之离子化，经高电场的“抽取”（extract）和“排斥”（repel）作用直接进入真空。 20世纪90年代初，MALDI开始与飞行时间质谱连接使用，形成商品化的基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）。MALDI技术所产生的离子在飞行管中由于所需飞行时间的差异而得到分离。MALDLTOF具有很高的灵敏度，肽类和蛋白质的多电荷离子化可由MALDI产生并由TOF采集到多电荷峰，折算而得的分子量测定范围可以高达百万u。目前MALDI-TOF已经成为生物大分子分子量测定的有力工具，在生物和生化研究中发挥着重要的作用。已经有大量的文献报道了应用MALDI-TOF在蛋白质分子量测定、一级结构测定、生物多糖和糖化蛋白质研究等诸多方面的工作，形成了一个蓬勃发展的领域。 与FAB很相同的是，在MALDI应用中，共存物质的干扰也是很明显的。如果样品含有大量的共存物质（混合物）时，制成的结晶不透明或透明度较差，此时质谱信号会很弱或根本没有信号出现。为解决这个问题，同时也为了得到一个真正的与液相色谱在线连接使用的接口，即可以直接测定液体样品的接口，数年前开始了将电喷雾接口与TOF连接的尝试，目前已有商品仪器上市，但其性能仍有待于应用实践的评价。7电喷雾电离 1984年Fenn等人发表了他们在电喷雾技术方面的研究工作，这一开创性的工作引起了质谱界极大的重视。在其后的十几年中开发出的电喷雾电离（ESI）及大气压化学电离（APCI）商品接口是一项非常实用、高效的“软”离子化技术，被人们称为LCMS技术乃至质谱技术的革命性突破。随后的十年中，配套于各种类型质谱的接口乃至液质专用机纷纷被开发上市。目前的电喷雾接口已经可安装在四极质谱、磁质谱和飞行时间质谱上。 ESI具有极为广泛的应用领域，如小分子药物及其各种体液内代谢产物的测定，农药及化工产品的中间体和杂质鉴定，大分子的蛋白质和肽类的分子量测定，氨基酸测序及结构研究以及分子生物学等许多重要的研究和生产领域，并以其如下的特点得到了广泛的认可： 高的离子化效率：对蛋白质而言接近100； 多种离子化模式供选择； 对蛋白质而言，稳定的多电荷离子产生使蛋白质分子量测定范围可高达几十万甚至上百万u； “软”离子化方式使热不稳定化合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰； 气动辅助电喷雾（peneumatic-assisted electrospray）技术的在接口中采用使得接口可与大流量（1mLmin）的HPLC联机使用； 仪器专用化学站的开发使得仪器在调试、操作、HPLC-MS联机控制、故障自诊断等各方面都变得简单可靠。 电喷雾技术在发展过程中出现了多种接口， （1）电喷雾电离（ESI）在喷口与金属毛细管之间施加数千伏特的高电压，此高电压是起关键作用的离子化条件，ESI接口因此而得名。初期的接口在没有使用辅助气体的情况下，仅靠此高电压也可以对喷雾产生的液体微粒做进一步的分散并有效地完成离子化过程。 （2）大气压电离（API）一般意义上是指离子化是在常压下完成的；指接口技术时包括所有在大气压下进行离子化的接口：电喷雾，气体辅助电喷雾或离子喷雾，其中气体辅助电喷雾在早期仅有喷雾气体的设计，又称为雾化辅助电喷雾（nebulization一assisted electrospray），后期的设计兼有喷雾气体和干燥气体，就是目前所说的ESI接口。 （3）大气压化学电离（APCI）用于LCMS的APCI技术与传统的化学电离接口不同，它并不采用诸如甲烷一类的反应气体，而是借助电晕放电（corona discharge）启动一系列气相反应以完成离子化过程，就其原理，它也可被称为放电电离或等离子电离。 （4）nano-ESI早期的ESI接口与此类似，它适合于蛋白质、肽类的多电荷离子测定，进样速度可以为10100n1min并因此而得名为nano-ESI。Nano-ESI接口可用于毛细电泳和微径柱HPLC与质谱的连用，原因是它具有很低的工作流速。 （5）Z-喷雾（Z-Spray）这是一种带有加热干燥气体的接口，干燥气体以逆流方向或垂直方向设置。喷雾为双正交之型喷雾方式。其他方面与ESI接口相同。 （6）涡流离子喷雾（turboinospray）这是一种较老的、高效率的设计，即进样喷口与毛细管人口处在不同轴的位置上（一般为3045）。由于在喷口周围有保护气体，可以有效地减低对毛细管人口的污染。 （7）正交电喷雾（orthogonal spray）较新的电喷雾接口多采用正交喷雾方向，即喷口与质谱人口毛细管相互垂直。这类接口设计中，干燥气体多是以帘状挡在毛细管人口前，以避免大量的中性分子进入毛细管并防止非挥发物质污染毛细管人口。二、电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）接口及离子化机制1 ESI接口图 HP 1100LC-MSD ESI接口示意图。 1-液相人口；2-雾化喷口；3-毛细管；4-CID（碰撞诱导解离）区；5-锥形分离器；6-八极杆；7-四极杆；8-HED检测器电喷雾接口示意（1）多电荷离子的产生与大分子分子量计算 生物大分子（如蛋白质、聚合物）的分子量测定一直是质谱测定中的一个难题，原因是质谱的质量范围有限（2000u）。同时，易碎、不挥发的大分子也很难转变为气相中的离子并由GCMS加以测定。近20年的研究已经开发出了若干接口技术，可用于测定生物大分子的分子量， ESI即为其中的一种。电喷雾过程中诸如蛋白质一类的大分子可获得高达数百个的质子加成（正电荷）而形成稳定多重电荷离于（multiplecharged ion），这样就使得单电荷质量范围为10002000u的质谱仪可以测定高达几十万u的分子量。关于电喷雾质谱对蛋白质的质量测定范围，各生产厂家和文献历来诸说纷纭，此处应加以强调的是测定范围决定于蛋白质表面的可能进行加成质子的位点（碱性氨基酸残基），位点越多，质量测定范围越大。多重电荷离子峰在质谱图上表现为接近高斯分布的一组峰，用这些峰的电荷数及质荷比（m/z）做联立方程求解。可以相当准确地计算出生物大分子的分子量。（2）ESI的离子化机制 离子化过程包括初始带电液滴（charged droplet）的形成和随后的作为带电液滴连续裂变结果的离子的形成。 经由喷口进入喷雾室的被分析物溶液在一定流速和几何形状的喷雾气体作用下形成细小的液滴。理想条件下，这些液滴的直径分布在13m之间。溶剂的脱去及电荷密度的持续增加迫使液滴通过分裂成为更小的液滴来降低电荷密度并达到在一定直径下的新的电荷密度的稳定态。裂变过程中电荷的不均匀分布造成液滴的带电，如果分析物分子在溶液中就已经形成了离子，则最初形成的液滴会在一开始就带有电荷。 由带电液滴的裂变开始的离子化过程通常可用以下机制来加以描述：达Rayleigh极限时由液滴裂变产生离子，离子的直接场蒸发，带电残渣模型。 图达Rayleigh极限时库仑爆裂如图所示，随着上述裂变过程反复进行，大于1m的液滴会在高电场的作用下出现电荷的不对称分布，并形成一个“突出”（protrusion）部分并由此发射出离子或裂变成为更小的带电液滴。一般而言，这些更小的液滴拥有10以上的“母”液滴的电荷，而它的体积要小于“母”液滴体积的十分之一，这种方式的裂变及离子的产生在尚未达到真正的表面张力的Rayleigh极限即可能出现。而小于1m的液滴则在达到真正表面张力的Rayleigh极限时方发生裂变。此时液滴自身表面的电场强可达108Vcm3，足以进行离子发射。 2APCI接口 大气压化学电离接口示意 APCI接口的构成与ESI接口的区别在于： 增加了一根电晕放电针，并将其对共地点的电压设置为+12002000V，其功能为发射自由电子并启动后续的离子化过程。 对喷雾气体加热，同时也加大了干燥气体的可加热范围。由于对喷雾气体的加热以及APCI的离子化过程对流动相的组成依赖较小，故APCI操作中可采用组成较为简单的，含水较多的流动相。APCI的离子化机制 APCI的离子化作用可以有三种理论阐述，它们分别为：经典意义的APCI （classicaI APCI），离子蒸发（ion evaporation）和摩擦电APCI。 经典APCI: 由电晕放电针产生的电子轰击空气中主要组分N2、O2、H2O以及溶剂分子得到初级离子N2+、O2+、H2O+和CH3OH2+等。再由这些初级离子与被分析物分子进行电子或质子交换产生出被分析物的分子离子。经典APCI离子化机制适合于低到中等极性的化合物。离子蒸发: 离子蒸发机制适合于大部分的ESI过程，同时也会出现在APCI过程中。这个机制适合大部分APCI分析中的强极性分子和那些可在溶液中预先形成的离子及离子化合物。3正、负离子模式的选择 一般的商品仪器中， ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。选择的一般性原则为： （1）正离子模式适合于碱性样品，如含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸的肽类，可用乙酸（pH34）或甲酸（pH23）对样品加以酸化。如果样品的pK值是已知的，则pH要至少低于pK值2个单位。 （2）负离子模式适合于酸性样品，如含有谷氨酸和天冬氨酸的肽类可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。pH要至少高于pK值两个单位。三、毛细管电泳质谱联用技术 毛细管电泳与质谱的联用（CE-ESI-MS）技术在20世纪80年代未就已经开始有人尝试，但直到近年才有商品接口出现。CE可以和电喷雾接口连接，也可以和其他类型的接口相连接；可以和四极质谱相联接，也可与其他类型质谱相连接。由于这种连机可以把CE对样品（尤其是生物大分子）的高度分离能力与质谱很强的鉴定能力结合在一起，可以说是一种理想的完美结合，具有相当大的开发价值。CE与通常的质谱接口相连时要解决的主要问题是：高电压的匹配问题， CE在进行分离时的操作电压一般为几十千伏，如果采用电喷雾接口，其接口原本也有数千到一万伏的电压设置。要采用有效、安全的电联接方式，方能保证正常的联机工作。 CE分离中，电渗流（EOF）要参与分离。在CE的常用分离模式毛细管区带电泳（CZE）中，组分的差速迁移与毛细管中的电渗流是叠加在一起的。进入质谱时，如果有很大的真空差，会对CE的电渗流产生扰动而影响分离效果。 CE的进样方式（电动式进样和气动式进样）决定了它的进样量仅为nl级，如果以mg/ml级的蛋白质样品浓度计算、进入质谱的样品组分量仅为f mol级。所以对配套质谱的灵敏度和信噪比有较高的要求。 商品化的接口可以通过下图来做一个了解、图 CE-ESI-MS液体连接法接口示意图。A，J缓冲液皑；LC一高压源；D毛细电泳柱；F离子化室；E电喷雾喷口；G质量分析器人口。液体连接器的作用在于对毛细电泳的馏出物进行流量补偿及组成的调整以适应离子化的需要。第三节色谱傅里叶变换红外光谱联用 气相色谱法和液相色谱法是物质分离和定量分析的有效手段，但在未知物的结构鉴定方面始终存在困难，仅靠保留指数定性未知物或未知组分非常不可靠，红外光谱法能提供丰富的分子结构信息，是非常理想的定性鉴定工具，然而红外光谱法原则上只适用于纯化学物质，对混合物常常无能为力。分析工作者希望将这两种技术取其所长，即将色谱技术的高效分离及定量检测能力与红外光谱独特的结构鉴定能力结合在一起，用于复杂试样的分析，这无疑是一种具有很高实用价值的分离鉴定手段。形象他说，红外光谱仪成为色谱的“检测器”，这一“检测器”是非破坏性的，并能提供色谱馏分的结构信息。 干涉型傅里叶变换红外光谱仪的出现为色谱红外光谱联用创造了条件。20世纪60年代末期，Low等人首次演示了色谱傅里叶变换红外光谱（GCFTIR）联用实验。与色散型红外光谱仪相比，干涉型博里叶变换红外光谱仪光通量大，检测灵敏度高，能够检测微量组分，而且由于多路传输，可同时获取全频域光谱信息，其扫描速度快，可同步跟踪扫描气相色谱馏分，微机的引人更是如虎添翼。 液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制，特别适合于沸点高、极性强、热稳定性差、大分子试样的分离，对多数生化活性物质也能满意分离，可弥补气相色谱分析的不足，由于液相色谱多采用极性溶剂为流动相，这些溶剂在中红外区均有较强吸收，因此消除溶剂影响是液相色谱与FTIR联机的关键，接口技术至关重要，目前虽然已有商用LC-FTIR仪，但与GC-FTIR的光管接口相比，仍有很大的局限性，所以至今为止，LC-FTIR的应用仍难以普及，但该领域的研究工作仍在继续。一、GC-FTIR联用系统由以下几个单元组成： 气相色谱单元，对试样进行气相色谱分离； 联机接口，GC馏分在此检测； 傅里叶变换红外光谱仪，同步跟踪扫描、检测GC各馏分； 计算机数据系统，控制联机运行及采集，处理数据。联机检测基本过程为：试样经气相色谱分离后各馏分按保留时间顺序进入接口，与此同时，经干涉仪调制的干涉光汇聚到接口，与各组分作用后干涉信号被汞镉碲（MCT）液氮低温光电检测器检测。计算机数据系统存储采集到的干涉图信息，经快速傅里叶变换得到组分的气态红外谱图，进而可通过谱库检索得到各组分的分子结构信息。图- 联用仪流程示意光源；抛物面镜；分束器；固定镜；移动镜；光管；椭圆面镜；红外检测器； 转换器；微型计算机； 转换器；绘图仪；样品汽化室；色谱柱；色谱检测器 图GC-FTIR各单元工作原理图二、GC-FTIR联用的接口 “接口”是联用系统的关键部分，GC通过接口实现与FTIR间的在线联机检测。目前商品化的GC-FTIR接口有两种类型，光管接口和冷冻捕集接口。三、LC-FTIR联用系统的组成 各单元作用分别为： 液相色谱（LC）将试样逐一分离； 接口流动相或喷雾集样装置，被分离组分在此处停留而被检测；FTIR同步跟踪扫描检测LC馏分；计算机数据系统控制联机运行及采集、处理数据。联机运行的控制、数据采集和处理的软件也与GC-FTIR联用类同。其主要区别在于， GC的载气无红外吸收，不干扰待测组分的红外鉴定，而液相色谱的流动相均有强红外吸收，严重干扰待测组分的红外检测，因此消除流动相的干扰成为接口技术的关键。LC-FTIR的接口方法基本上可分为流动池法和流动相去除法两大类。四、超临界流体色谱傅里叶变换红外光谱联用 超临界流体色谱与红外光谱联用（SFCFTIR）的接口方法与液相色谱的类同，分为流动池法和流动相去除法两类。第四章色谱原子光谱联用色谱与原子光谱的“接口”就是要将色谱分离后的组分送到原子光谱的原子化器中使之原子化。这就是要求色谱原子光谱联用的接口能够在不降低色谱分离性能的前提下将色谱分离后的组分尽可能多地送入原子光谱的原子化器内，同时不能降低原子化器的原子化效率。随着色谱种类不同和原子光谱使用的原子化器不同，接口的形式也有所不同。由于大多数原子光谱的原子化器是要求以溶液方式进样，这使得色谱与原子光谱联用的接口较为简单，容易实现。另外，原子光谱所用的氢化物发生器也可作为接口，联接色谱和原子光谱，测定某些特定元素。一、气相色谱原子光谱联用技术 由于气相色谱的流动相通常采用氮（N2）气，氢（H2）气，氦（He）气和氖（Ar）气，而且被测组分在一定温度下也呈气态，故可以将气相色谱分离后的组分在一定的保温条件下与载气一同直接导人原子光谱的原子化器进行原子化和激发，直接进行分析测定。这样的原子光谱实际上就是气相色谱的一个选择性检测器。如气相色谱火焰原子吸收光谱联用（GCFAAS）气相色谱等离子体原子发射光谱联用（GCICPAES）二、液相色谱原子光谱联用技术 由于火焰原子吸收光谱和等离子体发射光谱的进样过程都是将样品转化成溶液后进入雾化器，雾化后再进入原子化器。为了提高某些元素的灵敏度，也可将样品转化成溶液后进入氢化物发生器，产生的氢化物直接进入原子化器。这样的进样方式为实现液相色谱。原子光谱（FAAS，ICP-AES）的联用提供了方便。如液相色谱与火焰原子吸收光谱之间的联接的最简单的方法是用一根低扩散蛇形管作为接口将两者联接起来。蛇形管在管长49cm，内径0.25cm的保护管内，蛇形管的峰-峰距离为1 mm。第五节色谱-色谱联用 色谱分离和分析目前已成为分析化学中复杂组分分离和分析的最强有力的方法，对于一些组分较简单的样品往往用一根色谱柱，用一种色谱分离模式就可以得到很好的分离和分析。但对于某些组分较复杂的样品用一根色谱柱，用一种色谱分离模式，无论如何优化色谱参数也无法使其中某些组分得到很好的分离。有时由于主成分含量很高，主峰尾部有一个得不到满意分离的微量组分，这时如要防止主峰拖尾，就要减少进样量；但进样量大少时，微量组分又无法检测出来。还有时样品中的某些组分对所选用的色谱分离柱有损害，需要在进入色谱分离柱之前将其除去。这时可采用色渗色谱联用技术。将前一级色谱分不开的组分切割出来，选择另一根色谱柱，或用另一种色谱分离模式继续进行分离和分析，以便得到很好的分离和分析。对于主峰拖尾，拖尾峰上得不到很好分离的痕量组分，可将带有少量主峰组分的痕量组分切割出来，再进行一次色谱分离，就可以将痕量组分与主组分很好地分开，以便对痕量组分进行定性、定量分析。对于样品中某些损害色谱分离柱的组分，可以在样品进入色谱分离柱之前采用某种色谱分离方法将有害组分与欲测组分分离开，使那些损害色谱分离柱的组分不进入色谱分离柱，而使欲测组分进入色谱分离柱。这些问题的解决都需要将不同类型的色谱，或同一类型不同分离模式的色谱联接在一起，这就是色谱色谱联用技术，也称为多维色谱（mult-dimensional chromatography）。 色谱色谱联用技术是在通用型色谱仪的基础上发展起来的，通常是由一根预分离柱和一根主分离柱串联组成，两柱之间通过接口联接，接口的作用通常是将前级色谱柱（预柱）中未分离开的、需要下一级色谱继续分离的一段组分转移到第二级色谱柱（主柱）上进行第二次分离。两根柱（预柱和主柱）所用的流动相可以相同，也可以不相同。如第二级色谱仍有些组分分不开，则可以通过接口将这个未分离开的一段组分转移到第三级色谱柱上去分离，从理论上讲，可以通过接口将任意级色谱联接起来，直到将所有欲分离组分都分离开。但实际工作中两级色谱联用基本上就可以满足分离的要求。 当接口的作用仅限于将前级色谱分离后的某一段目标组分简单地切割下来并转移到第二级色谱柱上继续分离和分析，这称为一般的二维色谱（two-dimensional chromatography），用CC表示，当接口的作用不是简单的传递组分，而是先将前级色谱分离后的目标组分“捕集”下来，进行“聚焦”，然后在适当的时机将“聚焦”后的组分迅速“释放”，并转移到第二级色谱仪上进行分离和分析。这时两级色谱是相对独立的，分离机理可以完全不同。这时的色谱。色谱联用称为全二维色谱（comprehensive two-dimensional chromatography），为区别于一般的二维色谱