急性犬瘟热感染组织脏器的研究分析毕业论文.doc

急性犬瘟热感染组织脏器的研究摘 要临床中的犬瘟热病毒感染多为急性和亚急性型,犬年龄在6月龄左右,其症状和病毒复制的脏器都与慢性病例有很大区别。临床上急性病例的主要病变集中在肺脏和淋巴组织,组织病理学观察到犬淋巴结炎和多核巨细胞性肺炎。根据免疫组织化学染色结果发现在犬瘟热急性病例的淋巴结皮质犬瘟热抗原呈强阳性,且密度很高。而在犬的肺脏虽然表现出严重的肺炎症状,但是犬瘟热病毒抗原阳性反应弱,仅在支气管上皮和少量的巨噬细胞胞浆中观察到。犬瘟热病毒首先在犬的淋巴组织中进行复制增殖, 破坏被膜下淋巴窦和淋巴小节中的T淋巴细胞和B淋巴细胞,影响淋巴组织输出到外周血液循环中的淋巴细胞数量。结论:犬瘟热病毒病虽然临床上以肺脏病变最为严重,但是急性型和亚急性型的犬瘟热病毒主要在淋巴组织的T淋巴细胞B淋巴细胞和巨噬细胞中增殖,所以应该以淋巴组织作为犬瘟热病毒的主要分离脏器。关键词:犬瘟热病毒,免疫组织化学,淋巴结Infected tissue of acute organ of canine distemperAbstractThe canine distemper virus infection clinical for acute and subacutetype,dogs age 6 months or so, in its symptoms and the viscera iral replication with chronic cases have very big distinction. The main lesion clinical acute cases in the lungs and centralized lymphoid tissue, observed histopathologically to dog lymph node inflammation and multinucleated giant cells of pneumonia. According to immunohistochemical results found in your dogs distemper acute cases lymph nodes cortex your dogs distemper antigen is strong positive, and higher density. And in the lungs although dog show serious pneumonia symptoms, but canine distemper virus antigen positive reaction is weak, only in the bronchial epithelium and a small amount of macrophages observed in the cytoplasm. Canine distemper virus first in dogs in the lymphatic organization reproduced proliferation, damaging the subcapsular sinus and lymphatic section of T lymphocytes and B lymphocytes, influence lymphoid tissue output to peripheral blood circulating lymphocyte quantity. Conclusion: canine distemper virus disease to clinical lung lesions though most serious, but acute type and subacute type of canine distemper virus mainly in lymphoid tissue T lymphocytes B lymphocytes and macrophage proliferation, so should be based in lymphoid tissue as a canine distemper viruss main separation organs. Keywords: canine distemper virus,Immunohistochemical,Lymph node 目录前言11 材料与方法21.1 材料21.2 方法21.2.1 组织病理学检测21.2.2 免疫组织化学方法22 结果32.1 组织病理学观察32.2 免疫组织化学结果33 讨论54 结论6参考文献6致谢7前言犬瘟热病毒是一种高度传染性和致病性的麻疹属病毒,主要引起犬的系统性疾病和神经疾病。肺炎和脑脊髓炎是引起病犬死亡的主要原因。犬瘟热病毒感染临床症状多样,而肌痉挛是唯一具有诊断意义的神经症状3。在动物体内淋巴细胞是犬瘟热病毒早期感染机体时得主要繁殖载体。在犬瘟热急性病例中,犬瘟热病毒与淋巴细胞膜受体SLAM-signalning lymphosyte activation molecule(也称为ct150)结合,感染犬淋巴结淋巴小结中T淋巴细胞和B淋巴细胞2。在T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞中繁殖,造成淋巴小结中淋巴细胞的破坏,机体细胞免疫和体液免疫细胞大量减少,产生免疫抑制,肺炎是犬瘟热主要的临床症状,但是犬瘟热病毒首先在肺脏中的巨噬细胞中繁殖,然后才在肺泡的二型细胞中进行增殖6。实验中剖检取材犬瘟热病犬为6月龄以内的幼犬, 临床表现为急性病程,死后剖检结果证明肺炎导致的心肺功能衰竭是其最主要的死因。所以本文以6月龄犬瘟热确诊病死犬为实验动物,取其主要脏器心脏肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、膀肤、大脑进行组织病理学研究,取病变严重的淋巴结、肺脏、和大脑进行免疫组织化学研究。关键围绕最适合的犬瘟热病毒分离脏器开展实验和讨论。1 材料与方法1.1 材料1）病料：急性犬瘟热病死犬的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、淋巴结、膀胱、大脑和脾脏2）主要试剂：二甲苯，二甲苯，ph6.0、0.01的柠檬酸溶液，100%乙醇，95%乙醇，75%乙醇，3%过氧化氢，pbs液等。3）主要仪器：组织切片机，恒温培养箱，光学显微镜等。1.2 方法1.2.1 组织病理学检测临床剖检,采集脏器包括：心脏、肝脏、肺脏、肾脏、淋巴结、膀胱、大脑和脾脏。制作组织切片,使用10%的福尔马林中和缓冲液固定组织,石蜡包埋,切成5um的切片,用常规的苏木精和伊红(HE)染色,在光学显微镜下观察。1.2.2 免疫组织化学方法1)脱蜡脱水:组织学切片在经二甲苯、二甲苯各60min脱蜡,100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇逐级脱水,每级5min。2)抗原修复:ph6.0,0.01的柠檬酸溶液高压煮沸3min。3)封闭内源性酶:在组织切片上,滴加3%过氧化氢,以组织完全覆盖为宜,在室温下处理20min。以封闭内源性过氧化物酶。pbs洗涤3次,每次5min。4)封闭:滴加5%进口山羊血清于组织切片上,在37下反应30min,封闭非特异性结合位点。5)一抗孵育:滴加最佳稀释度的单抗(1:200)37复温45min,弃去单抗,pbs洗涤3次,每次5min。6) 二抗孵育:滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(1:500),在37中反应45min洗涤6次,每次5min。7)显色:滴加DAB反应液,室温下反应510min。显色后充分洗涤,终止反应。8)复染:苏木精溶液染色30-60s,乙醇盐酸分色2s,水中冲洗5min 。9)脱水封片:经75%、95%、100%各级乙醇,每级3min。入乙醇和二甲苯（1:1）溶液2min,入二甲苯中5min至透明,加中性树胶后盖盖玻片,封片,镜检。2 结果2.1 组织病理学观察大脑:大脑白质和灰质中病理病变不明显,在部分大脑灰质区域观察到小胶质细胞靠近神经元胞体的现象嗜神经现象。神经元胞体中尼氏小体正常, 无明显组织病理学变化。（见图1）肺肺：泡腔中有大量的炎性细胞浸润,纤维素性渗出,血管充血,出血,肺泡腔中出现多核巨细胞,胞浆深染,胞浆中有5-7个细胞核排列在胞体的周边,诊断为典型的犬瘟热多核巨细胞性肺炎。（见图2）淋巴结:光学显微镜下观察,低倍镜下可见,可见到淋巴结结构疏松,淋巴细胞减少,被膜下淋巴窦增宽,质区染色浅,淋巴小结结构不明显。高倍镜下,观察到皮质区被膜下淋巴窦和皮质淋巴窦中,有大量吞噬异物的巨噬细胞,网状内皮细胞增生,淋巴结髓质区大量淋巴小结被破坏,诊断为淋巴节炎。（见图3）膀胱：膀胱粘膜完整,在400倍光学显微镜下可以观察到,在犬膀胱粘膜变移上皮中出现犬瘟热病毒包涵体。（见图4）2.2 免疫组织化学结果大脑：光学显微镜下观察免疫组化切片,大脑白质和灰质的神经元细胞、小胶质细胞、锥状细胞和星形胶质细胞内均没有观察到有犬瘟热病毒抗原特异性染色。肺脏：光学显微镜下观察免疫组化切片,在肺脏的支气管上皮细胞和巨噬细胞中观察免疫标记呈阳性,但是阳性细胞量较少。淋巴结：光学显微镜下观察免疫组化切片,在淋巴结皮质的淋巴小结中有强免疫标记阳性反应。而在髓质区则表现为免疫标记呈阴性反应。(见图5和图6)膀胱：在膀胱粘膜上皮中没有观察到包涵体免疫标记阳性反应。图1脑组织轻度嗜神经现象H.E. 200图2多核巨细胞性肺炎 H.E.200图3 淋巴结炎H.E.400 图4 膀胱粘膜内包涵体H.E.200图5 淋巴结炎 免疫组织化学染色 H.E.200 图6 淋巴结炎 免疫组织化学染色H.E.4003 讨论本次试验所选6只病犬年龄均小于3个月,属于急性犬瘟热感染病例。在肺炎致死的病犬的免疫组织化学结果可以观察到在肺脏的部分支气管上皮免疫标记呈阳性,但是在肺泡中很少观察到犬瘟热病毒免疫标记阳性的细胞。当犬瘟热病毒感染机体后,可以增加血管的通透性,破坏机体免疫组织器官中淋巴细胞的生成,抑制体液免疫和细胞免疫作用的发挥10,产生免疫抑制作用,肺脏是动物机体与外界联通的脏器,容易受到各种微生物的感染,发生多种细菌和犬瘟热病毒混合感染的情况；同时,观察到病犬血液循环中的细胞因子的浓度减少,细胞因子的分泌合成受到抑制,导致动物生理功能紊乱9,使动物肺炎加剧,最终导致死亡。即动物往往死于严重的肺炎,犬瘟热病毒是导致其死亡的间接因素。这和本观察到的结果相吻合,免疫组织化学观察结果显示,犬瘟热病死犬的肺脏并不是犬瘟热病毒繁殖数量最多的脏器,也就不是最适合作为分离病料的组织脏器5。以前在其他的文献中也有记载,很难从肺组织中分离犬瘟热病毒,分析原因认为有可能是由于CDV是RNA病毒,遇有RNA酶便会被消化降解,而RNA酶在各种脏器细胞中普遍存在,且在细胞裂解后大量释放,酶解组织中的CDV使得CDV的分离困难。此外,病料组织在处理过程中也会释放一些细胞毒性因子,在将这些处理材料用于接种细胞时,其内的细胞毒性因子产生了不利于细胞的作用4。另有实验表明,在犬瘟热感染的急性病例中,早期犬瘟热病毒主要在巨噬细胞中繁殖,随后在肺泡二型细胞和肺细胞中复制。组织病理学观察结果表明,在犬膀肤粘膜上皮中可以观察到病毒包涵体。但是在免疫组织化学染色结果并没有染出犬瘟热病毒包涵体。认为犬瘟热病毒包涵体并不都对犬瘟热病毒的抗体免疫阳性反应,有可能是因为犬瘟热病毒包涵体中包括的是大量的病毒元件,这有可能会阻碍了特殊的单克隆抗体和病毒的抗原的结合。国外文献记录了使用犬瘟热病犬的尿液作为临床诊断犬瘟热病毒的样本,确定了犬瘟热病毒通过尿液排毒,进行传播的一个重要途径。淋巴结组织病理学观察结果表明,淋巴结皮质区T细胞和B细胞的消耗,同时伴随有淋巴结髓质区网状细胞增生,淋巴小结消失,由增生的巨噬细胞和网状细胞增生填充, 淋巴结髓质中仅残存少量淋巴小结,诊断为淋巴结炎。采用免疫组织化学分析, 结果发现在淋巴结的皮质部淋巴小结和皮窦中有大量免疫标记呈阳性的细胞。其密度和阳性反应强度均高于其他组织器官7,与本实验观察到的结果相一致。国外文献中报道,有时在感染的淋巴细胞和增生的网状细胞中可以观察到嗜伊红的病毒胞浆包涵体8。B细胞在淋巴小结和边缘被膜下淋巴窦中数量最多。而T细胞则主要集中在皮质深部的厚层弥散淋巴组织副皮质区。犬瘟热抗原物质主要聚集在T细胞聚集的区域1。这与本实验观察的结果相一致,犬瘟热病毒在感染早期和急性病例中会主要感染T细胞和B细胞10,同时使巨细胞和淋巴细胞坏死破裂,造成免疫抑制。4 结论所以在犬瘟热急性病例中,淋巴组织是犬瘟热病毒最好的分离脏器。神经组织例如大脑作为常用的犬瘟热病毒分离材料,但在免疫组织化学染色和组织病理学检查结果显示其病变并不明显。实验中剖检的6只临床急性犬瘟热病犬全部出现了神经症状包括：抽搐、后肢瘫痪和共济失调等,但是组织病理学观察结果显示大脑只出现了轻微的血管套和噬神经现象,脑组织免疫组织化学实验结果没有观察到免疫标记阳性的神经细胞。国外实验研究表明在急性和亚急性病例的感染,在犬的神经系统中只有少量的炎性细胞浸润,炎性损伤很少8。所以急性病例中, 大脑并不是最好的犬瘟热病毒分离材料。参考文献1 李秀英. 石家庄地区犬瘟热流行情况调查与分析A. 中国畜牧兽医学会小动物医学分会第四次学术研讨会、中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十六次学术研讨会论文集（2） C, 2009 2 康宁. 也谈犬瘟热的诊疗A. 中国畜牧兽医学会小动物医学分会第四次学术研讨会、中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十六次学术研讨会论文集（2） C, 2009 3 聂福平, 李作生, 邱薇, 张富强, 王灵强, 张连江, 宋贵强, 龙贵伟, 廖金, 任玉莹, 余方芳, 张泉鹏, 范泉水. 犬瘟热病毒Yunnan株H基因的克隆与表达A. 第十三次全国养犬学术研讨会论文集 C, 2009 4 陈三多, 唐延波, 宋立新. 犬组织细胞瘤超显微结构之研究A. 第十三次全国养犬学术研讨会论文集 C, 2009 5 邱薇, 郑颖, 范泉水, 张富强, 李作生, 王双印, 王意银, 郑均峰, 周卫国, 黄勇. 我国犬瘟热分子流行病学调查A. 第十三次全国养犬学术研讨会论文集 C, 2009 6 林颖, 盛明崴, 耿庆华, 田宝中. 犬瘟热的研究进展及其免疫预制A. 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