纳米金和硅量子点在几个生物体系中的应用研究.doc

硕士学位论文纳米金和硅量子点在几个生物体系中的应用研究学 科 专 业分析化学学 位 类 型R科学学位 专业学位研 究 生 姓 名易银辉导师姓名、职称张友玉 教授论 文 编 号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一三年五月分 类 号 密级 学校代码 10542 学号 201002121293 纳米金和硅量子点在几个生物体系中的应用研究Studies on Several Biological Systems Based on Au Nanoparticles and Si Quantum Dots研究生姓名易银辉指导教师姓名、职称张友玉 教授学科专业分析化学研究方向生化分析与生物传感湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一三年五月中文摘要纳米粒子具有独特的物理化学性能，优异的光、电性能及良好的生物相容性备受关注。纳米粒子作为生物探针广泛的应用于生物化学，细胞成像，及医学等领域。在众多纳米生物传感检测方法中，紫外和荧光生物传感技术由于其高灵敏，选择性好，操作简单等优点广泛使用。本论文基于纳米粒子的优异性质，结合荧光和紫外方法的优点，设计一系列操作简单，灵敏度高，低成本的纳米生物传感器用于生物分子及农药的检测，主要内容如下：1. 设计了一种高特异性，超灵敏度的传感器于同一溶液中比色和荧光检测血小板衍生因子（PDGF-BB）和腺苷。通过将PDGF-BB和腺苷的适配体部分互补并通过金巯键固定在纳米金上获得双功能适配体传感器，并成功的应用于同一溶液中的两种目标物检测。PDGF-BB通过监测纳米金溶液聚集而引起的颜色的改变以及纳米金的吸收红移进行检测；腺苷则通过测定520 nm处FAM发射峰的增强来检测。这种适配体传感器具有高灵敏度和双功能识别等优点且检测限低。更重要的是，这种适配体固定的纳米金传感器已成功应用于血清样品中检测PDGF-BB和腺苷。由于该方法是基于核苷酸杂交设计而成，也可以用同样的方法构建其他适配体传感器。2. 设计了一种新型无标记硅量子点荧光探针用于葡萄糖无标记检测。实验发现，过氧化氢对硅量子点的荧光具有很强的光猝灭作用。根据葡萄糖氧化酶催化D-葡萄糖氧化产生的H2O2的原理，实现对葡萄糖的检测，实验结果表明硅量子点荧光猝灭程度与葡萄糖的浓度呈正比。在5 mM-650 mM范围内，荧光猝灭程度与葡萄糖的浓度呈良好的线性关系，检测限为0.68 mM。该方法还可用于血样中的葡萄糖检测。与其他方法相比，本方法具有方便，简单，成本低，灵敏度高等优点，更重要的是本方法不需要化学修饰和酶的固定。该方法在糖尿病临床诊断具有广阔的应用前景。3. 设计制备了一种新型无标记硅量子点（SiQDs）探针用于高灵敏检测有机磷农药，该检测的原理如下：首先底物乙酰胆碱(ACh) 在乙酰胆碱酯酶(AChE)的作用下水解产生胆碱，然后胆碱在胆碱氧化酶(ChOx)的作用下产生双氧水。通过酶反应产生的双氧水能高效猝灭SiQDs的荧光。当加入农药后，农药能抑制AChE的活性，从而使酶反应产生双氧水的量降低，此时，SiQDs的荧光猝灭程度也降低。利用该传感器检测甲萘威（carbaryl）最低检测限可达5 ng/L，该浓度远远低于欧洲联盟和美国农业部门报道的最低残留标准（MRL）。更重要的是，该方法成功应用于实际样品的检测。检测结果跟高效液相色谱得到的结果相一致。这种简单的传感策略还可用于复杂的农药残留体系，有望成为便携式的检测工具。关键词：金纳米粒子；硅量子点；PDGF-BB；腺苷；葡萄糖；甲萘威 ABSTRACTNanoparticles with special physical and chemical properties have attracted more and more attentions owing to their unique photoelectric properties and excellent biocompatibility. Up to date, numerous investigations of biological probes based on nanoparticles have been widely used in biochemistry, cell imaging and medical fields. With the high sensitivity, selectivity, simple operation et. al, UV-vis and fluorescence spectroscopy have became one of the hottest research point among various nano- biosensing detection methods. Based on the excellent properties of nanoparticles and easy operation of UV-vis and fluorescence mesurment methods, this thesis has developed a series of novel nano materials for highly sensitive and simple detection of analytes. The main contents are summarized as follows:(1) We developed a highly specific sensing platform for the simultaneous detection of multiple analytes in a homogenous solution by using colorimetric and fluorescence methods. This design used aptamer units thiolated Aptamer I (Apt I), Apt I for platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB); uorescein amidite (FAM)-labeled Aptamer II (Apt II ), Apt II for adenosine. A bifunctional aptasensor was prepared by the self-assembly of thiolated Apt I on gold nanoparticles (AuNPs) and partial hybridization between Apt I and Apt II. The fabricated bifunctional aptasensor was used to detect two targets (PDGF-BB and adenosine) simultaneously and selectively in a homogenous solution. In the presence of target molecules PDGF-BB, the color and absorbance of the aptamer-modified AuNPs changed because of AuNPs aggregation. The increase of fluorescence intensity of FAM at 520 nm was used to analyze adenosine in the test system. The proposed aptasensor had low detection limit, high sensitivity, and bifunctional recognition and was successfully used for real serum samples. It also highlights a promising application for other aptamers and a broad range of other analytes. (2) A novel label-free detection system based on Si quantum dots (SiQDs) was designed for the direct measurement of hydrogen peroxide (H2O2) and glucose. Herein we demonstrated that the photoluminescence (PL) of SiQDs was sensitive to H2O2, which could be used for the direct detection of H2O2. The glucose was successfully detected based on the mechanism that H2O2 produced from the glucose oxidase (GOx) - catalyed oxidation of glucose could intensively quench the SiQDs PL, and the proposed method has a linear response range of 5 mM-650 mM with the detection limit of 0.68 mM towards glucose. Glucose in blood samples was effectively detected via this strategy. As compare with most of the existing methods, this newly developed method possesses many advantages, such as simplicity, low cost, high exibility, good sensitivity and so on. Furthermore, no complicated chemical modication and enzyme immobilization were needed in this system. It has also a promising utilization for point-of-care clinical diagnose of diabetes and other elds.(3) A novel label-free Si quantum dots (SiQDs) detection system was designed for ultrasensitive detection of organophosphorothioate pesticides based on enzyme-generated H2O2 induced SiQDs-enzyme-H2O2 fluorescence quenching system. Acetylcholinesterase (AChE) can hydrolyze acetylcholine (ACh) to choline, which was then oxidized by choline oxidase (ChOx) to generate H2O2. The enzyme-generated H2O2 can quench the PL of SiQDs. Upon the addition of organophosphorothioate pesticides, the pesticides can inhibit the activity of AChE, leading to the decrease of the H2O2 and then the degree of fluorescence quenching decrease. By use of this PL sensor, the lowest detectable concentrations for carbaryl was measured to be 5 ng/L, which is much lower than the maximum residue limits (MRL) as reported in the European Union pesticides database as well as those from the U.S. Department Agriculture (USDA). Importantly, this assay allows detection of pesticides in real samples such as agricultural products and river water. The results in detecting pesticide residues collected from food samples via this method agree well with those from high-performance liquid chromatography (HPLC). This simple strategy reported here should be suitable for sensing pesticides in complex samples, especially in combination with other portable platforms.Key words: Gold nanoparticles; Si quantum dots; PDGF-BB; Adenosine; Glucose; CarbarylIII目 录中文摘要I英文摘要III第一章 绪论1.1 纳米材料11.1.1 纳米材料概述.11.1.2 纳米材料的基本效应.11.1.3 纳米材料的分类.31.1.4 纳米材料在生物传感器中的应用.41.2 本文构思.6第二章 适配体修饰的纳米金传感器用于多组分的比色和荧光检测2.1 引言82.2 实验部分102.3 结果与讨论122.4 小结19第三章 基于新型无标记硅量子点荧光探针的葡萄糖检测3.1 引言203.2 实验部分223.3 结果与讨论243.4 小结.30第四章 新型无标记硅量子点用于甲酸酯农药的高灵敏检测4.1引言314.2 实验部分324.3 结果和讨论344.4 小结40结论.42参考文献.43攻读硕士期间发表的相关论文.54致谢.55湖南师范大学学位论文原创性声明.56湖南师范大学论文版权使用授权书.56基于纳米金和硅量子点在几个生物体系中光分析研究第一章 绪 论 生物传感分析具有分析速度快、选择性高、成本低且操作简便等特点，适用于较为复杂的环境检测、在线监测及活体分析，是现代分析中最具前景的分析检测技术之一，也是当前分析科学中的一个重要分支。自20世纪60年代，Upkike和Clark首次提出设想并研制出生物传感器以来，生物传感研究技术得到了迅速的发展，并应用到环境，农业，食品，甚至医学，药学等多领域体系中。近年来随着纳米技术的不断发展，纳米生物传感器也得到了迅速的发展。本章就纳米生物传感器的原理及特性，结合是适配体的特异性和酶的专一性及高效催化能力等方面进行简要综述，并在此基础上提出了本论文的基本构思。1.1 纳米材料1.1.1 纳米材料概述纳米 (nanometer)，即10-9 m级尺度。纳米材料指的是粒子的粒径在小于l00 nm的材料，即纳米尺度在1100 nm并且由极细的晶粒组成的固体纳米材料。其中纳米材料的平均粒径在20到100 nm之间的，称之为超细粉；平均粒径低于20 nm的，称之为超微粉。该尺寸下的物质不同于原子，分子，它处于微观和宏观物质的交界处，它具有微观和宏观物体所不具备的独特的物理、化学性质，如微尺寸效应，宏观量子隧道效应和量子效应等。因而在光学元件，表面增强材料，电子材料，传感材料和催化性能等方面表现出了一系列独特的性能。早在19世纪60年代，诺贝尔物理奖获得者理查德费恩曼便提出了纳米材料领域相关的科学技术问题1。20世纪末，国内外掀起了一股研究纳米材料的热潮，纳米科技得到了迅猛的发展，为了21世纪最前沿的技术之一，纳米材料也广泛的应用于微电子、新材料、航空、国防技术、核技术、化工、催化、生物工程和商务医药等各个领域。1.1.2 纳米材料的基本效应 纳米材料具有强烈的尺寸效应，其性能主要由尺寸决定。尺寸效应的基础是量子效应和表面效应，以及宏观量子隧道效应。1.1.2.1 尺寸效应所谓尺寸效应，就是当纳米材料的晶粒尺寸或第二相粒子的尺寸减小时，纳米材料的性能会随之发生变化，当粒子的尺寸小到某一临界尺寸时，纳米材料的性能的发生明显的突变。而当纳米材料的尺寸在nm级时，将出现小尺寸效应（即Kubo效应）。早在1962年，日本科学家Kubo便从理论上对量子效应进行了深入的研究2。他指出：当电子能级处于金属费米能级附近时，便会出现由准连续变成离散能级，这种现象称之为量子效应。而且Kubo还提出了能级间距的计算公式：式中d 代表能级间距；EF代表费米能级；N代表总电子数。宏观物体含有无穷多个原子（即含有的电子数），由上式可知，故宏观物体或大粒子的能级间距趋向于零。而纳米微粒中含有的原子数是有限的，即N值比较小，这样就会使得能级的间距大于光能、静电能，这将导致纳米微粒的光、电特性和宏观物质表现出显著不同的特性，这就是量子尺寸效应。 1.1.2.2表面效应表面效应是纳米粒子的另一基本效应。由于纳米材料都具有一定的晶相结构，那么着其中将含有许多的晶界，因此纳米晶体材料中有相当多的原子处于晶界上。而纳米微粒的表面大、尺寸小，并且有相当大比例的原子位于微粒的表面，当纳米微粒的粒径减小时，表面的原子数目增加，表面原子的活性也增大，从而使得纳米微粒表面原子的构型和输送方式发生变化，最后将导致微粒表面的自旋构象和电子能谱发生变化，因此称之为纳米粒子的表面效应3。1.1.2.3 宏观量子隧道效应隧道效应4，即微观纳米粒子贯穿势垒的这种能力。近几年来，人们发现了量子材料具有一些宏观量，如微纳米颗粒具有磁化强度，量子相干的器件中具有磁通量和电荷等，而且还表现出隧道效应，因此，把这些现象称之为宏观量子隧道效应。在早期，科学家们曾用该效应来解释微纳米镍颗粒在低温下能继续保持良好的超顺磁性。宏观量子隧道效应的应用研究对纳米材料的基础研究以及实际应用都产生了深远的影响。综上所述，纳米材料的尺寸效应，表面效应及宏观量子隧道效应是固体纳米粒子所表现的基本特性。1.1.3 纳米材料的分类纳米材料根据其物理化学性质，可分为：纳米微粒、纳米薄膜（多层膜和颗粒膜）以及纳米固体等。1.1.3.1 纳米微粒纳米微粒是纳米材料体系中的典型代表，一般分为球形、类球形（与制备方法有关），它是指粒子大小在11000 nm范围内的纳米粒子。由于比表面大、尺寸小及量子尺寸效应等特性，纳米微粒具有不同于常规固体材料的一些新特性，也不同于传统材料所表现的尺寸效应。例如，当微粒尺寸减小至几个甚至几十个纳米时，原本是优良的导体将变成绝缘体，原本是典型的含有共价键的非极性绝缘体，它的电阻会急剧下降甚至变为导电体，原本为p型的半导体材料可能会变为n型。在通常情况下，常规固体材料的物理性能是相对比较稳定的，而当其尺寸大大降低到纳米级别时，其性能将受到微粒尺寸的影响，这种现象称之为幻数效应5。1.1.3.2 纳米薄膜纳米薄膜是指由纳米晶粒所构成的准二维系统，它具有约占一半的界面组元，因而显现出与晶态及非晶态物质都不同的全新性质6。比如，Si纳米晶膜具有良好的热稳定性、较强的光吸收能力、高掺杂效应，并且室温电导率的变化范围大等优点。据统计，纳米薄膜在光电磁器件、压阻传感器以及其它与纳米薄膜相关的微电子器件行业中将发挥及其重要的作用。 1.1.3.3 纳米固体纳米固体是指大量的纳米微粒在保持界（表）面清洁的条件下所构成的三维体系7。纳米固体界面原子占有很大的比例，因此，不同于传统的材料科学，它的界（表）面往往不再被视为一种缺陷，反而成为一种重要的组成元件，从而具有高比热、高扩散性、高热膨胀性、高强度、高电导性、高溶解度及界（表）面合金化、高韧性、低熔点等异常特性。这些优良的特性使得其在表面催化、传感器、磁记录及工程技术上有着非常广泛的应用前景。 1.1.4 纳米材料在生物传感器中的应用纳米材料不仅在其制备、性能测试、表征等方面取得了许多研究成果，而且由于其独特的性能使其在不同领域（如：电子学8、光电子学9、光学10、信息储存11、生物成像12、燃料电池13、电化学14、生物医药15、纳米传感器16、表面拉曼散射17, 18和基因诊断19等）不断扩大。纳米材料具有比表面积大、微型化等特点，与纳米传感器所对应的多功能、微型化相一致。此外，制备传感器的材料还要求灵敏度高、功能广泛、响应速度快、选择性好、稳定可靠、耐负荷性高和检测范围宽等条件，而纳米材料正好能达到以上要求。据文献报道，纳米材料制备的化学传感器能简单，快速的应用在环境监测、生产生活等各个方面20-22。到目前为止，纳米材料在生物传感器，比如金纳米粒子、各类量子点以及许多纳米复合材料中得到了广泛的应用研究。1.1.4.1 纳米金在生物传感中的应用纳米金（AuNPs）作为一种新型的金属纳米材料，以其独特的物理化学性质，良好的生物相容性，优良的导电性能，使其在制备传感器中传递电子方面发挥着不可替代的作用。纳米金不仅具有纳米材料的一些基本特性（即尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应等），此外，金纳米粒子具有纳米结构组合而发生的新的效应，例如，量子耦合效应及协同效应等。因此这种具有独特光学，电学及催化性能的纳米材料成为构建生物传感器的首选材料之一。纳米金因为其粒子小，表现出特有的紫外吸收，且吸收波长随着纳米金颗粒的增大而出现红移，纳米金颗粒从小到大，肉眼能观察到的颜色分别是：橙黄色-酒红色-紫红色-深红色-红棕色等。这种由于颗粒大小不同而表现出不同颜色的特征使得纳米金在许多领域尤其是生物学上具有很高的使用价值。同时，纳米金可与含有巯基的物质通过Au-S结合使得巯基化合物紧密连接的纳米金的表面。纳米金还具有很好的生物相容性，一般巯基化合物固定在纳米金上仍可保留其原有的物理化学性质。另一方面，纳米金的表面效应使得发光物质靠近纳米金的表面时，会出现光猝灭效应。而当这些荧光物质跟纳米金大于一定距离（10 nm）时，这种猝灭效应又会消失。纳米金因其良好的光学性能、生物相容性已广泛的用于各类生物传感器的应用研究之中23-26。其应用主要是利用纳米金固定信号物质、颜色探针及利用纳米金的高效荧光猝灭能力等几个方面。Radhakumary等根据纳米金颜色的变化可视法检测葡萄糖，根据纳米金表面电荷的变化而引起溶液颜色由红色变为蓝色，通过肉眼及纳米金的紫外吸收的红移用来检测葡萄糖27。Lin等将巯基修饰的适配体通过Au-S结合在纳米金的表面，此时修饰有荧光染料的适配体的荧光被纳米金猝灭，而当加入检测物（Hg2+/Pb2+）后，适配体与目标物结合而脱离纳米金的表面，此时，适配体上的染料荧光恢复，通过染料荧光强度的变化用于检测Hg2+/Pb2+28。金纳米粒子在生物医学、分子生物学等众多领域中显示了其极大的优势及应用中的潜力，同时也成为当今世界各国所关注的研究前沿及重要发展方向。1.1.4.2 量子点在生物传感器中的应用量子点（quantum dots, QDs）29，又称半导体纳米晶体，是一种粒径大小在1100 nm之间，由第三到第五族或第二到第六族元素组成的能稳定存在，且能溶于水的半导体纳米粒子。当受到一定波长激发光激发时，能够产生荧光的半导体材料。当量子点的物理尺寸小于其激子玻尔半径时，由于量子点的限域效应，使其具有独特的光学、电学性质。量子点的光学性质主要取决于其粒径的大小，而与它的物理组成无关。通过控制其合成条件，可以得到不同粒径大小的量子点，量子点粒径大小的不同，可以得到200 nm650 nm范围内的荧光谱。自20世纪70年代以来，量子点由于其特殊的光电性能和优良的生物相容性，在生物催化、活体成像和生物检测等领域有着非常广泛的应用价值。量子点在传感器中的应用主要集中在生物分子的检测、农药残留的检测分析、酶活性检测等30, 31。近年来，随着量子点生物传感器的迅速发展，一系列新型量子点材料不断涌现。量子点因其荧光发射能力强，激发光范围较宽，且发射波长可通过QDs的粒径大小及调节材料组成进行控制，更重要的是，将生物大分子标记在不同光谱特征的QDs上可以快速识别和分析，使得QDs在生物传感器、活体成像、生物医学研究中发挥着巨大的作用。目前，QDs最具前途的应用之一是将其作为生物医学中光致发光的荧光标记物。例如，Michalet等32 指出QDs是一种最具潜力的生物标记物，它可作为活体成像、细胞成像以及医疗诊断的重要工具之一。Li等33 报道水溶性的CdTe QDs能固定葡萄糖氧化酶，同时CdTe QDs的荧光能被双氧水猝灭。根据这一机理，Li等基于CdTe QDs作为探针，设计了一种简易，快速的检测葡萄糖的方法。近年来，Kang 34, 35 课题组对硅量子点的合成及应用进行了较为详细的研究。硅量子点作为一种新型的量子点材料，以其易于合成、粒径可控、发光强度大、生物相容性好、无毒、在生物体内易分解等优势而引起了大量科学家的关注34。量子点在生物分子的检测、标记、分离等方面有着广泛的应用前景，并且对生物分子及农药残留的快速、高效、实时和简单检测方面都发挥出明显的优势36。1.2 本文构思纳米生物传感器发展至今，提高检测的灵敏度，降低检测成本，简化操作过程等依然是基于纳米材料制备光学传感器中任将继续研究的一项课题。本文利用不同的纳米材料，设计了几种传感器，对生物分子及几种农药残留物的高选择性、高灵敏性检测。针对适配体的特异性和酶的高效催化性能，设计了一类灵敏度高、选择性好、易于操作、低成本的光学纳米生物传感器，主要包括以下内容：（1）传统的生物传感器主要是针对单一组分的检测，而且制备传感器的过程复杂，耗材多，制备时间较长。而适配体在检测目标物中具有高识别功能。鉴于此, 我们设计了一种高特异性，超灵敏度的传感器于同一溶液中用比色和荧光检测两种分析物。这种方法是将PDGF-BB和腺苷的适配体部分互补并通过金巯键固定在纳米金上。这种双功能适配体传感器成功的应用于同一溶液中检测两种目标物。更重要的是，由于该方法是基于核苷酸杂交设计而成，它同样可以应用于其他基于适配体的分析物检测。（2）利用H2O2能猝灭SiQDs荧光作用实现了对葡萄糖的监测。本文设计了合成一种新型无标记硅量子点荧光探针用于葡萄糖无标记检测。实验发现，过氧化氢对硅量子点的荧光具有很强的光猝灭作用。根据葡萄糖氧化酶催化D-葡萄糖氧化产生的H2O2的原理，实现对葡萄糖的检测。该方法还可用用于血样中的葡萄糖检测。与其他方法相比，本方法具有方便，简单，成本低，灵敏度高等优点，更重要的是本方法不需要化学修饰和酶的固定。（3）利用农药能抑制AChE的活性以及H2O2能高效猝灭SiQDs的荧光，本文设计了一种新型无标记SiQDs探针用于高灵敏检测农药甲萘威（carbaryl）。该方法成功应用于实际样品的检测。检测结果跟高效液相色谱得到的结果相一致。这种简单的传感策略还可用于复杂的农药残留体系，有望成为便携式的检测工具。第二章 适配体修饰的纳米金传感器用于多组分的比色和荧光检测2.1 引言 核酸适配体是指通过指数级富集配体的系统进化技术经体外筛选（SELEX）得到的DNA或RNA寡核苷酸序列,能与相应的配体进行高亲和力和强特异性结合37-39。作为一种新型的核苷酸结构，适配体已经作为一种重要的工具用于分子诊断和临床应用40, 41。与抗体相比，适配体具有以下几个优点，首先，适配体具有高亲和力和强特异性，能特异性识别大量的目标分子，从小分子到大的蛋白质甚至细胞42；其次，适配体结构性能的转变以及易于结合目标物等优点使其在设计新型传感技术上提供了广阔的应用前景43；再次，跟抗体或酶相比较，适配体具有较好的化学稳定性并且能较低成本的用于商业化41, 44。在最近几年中，由于定量检测在分子诊断和临床应用中发挥着重要作用45，所以许多适配体传感器已用于小分子(如可卡因，腺苷等)46, 47，蛋白质（如溶菌酶，PDGFs）48, 49及金属离子（如Ag+ or Hg2+）50, 51的检测。一般而言，适配体传感器的检测机理是基于金属纳米粒子的聚集，或是荧光共振能量转移(FRET)等。因此，我们通常结合适配体的高特异性结合能力以及金属纳米粒子的高猝灭性能设计纳米探针用于小分子，蛋白质等物质的检测。纳米粒子已广泛的应用于生物学研究中，特别是金纳米粒子。由于纳米金具有独特的性能，比如易于制备，优良的生物相容性，高的消光系数和光电子性能等，它已成功应用于基于适配体的纳米传感器，用于特异性，多种分析物的检测52-54。更重要的是，纳米金能很容易的通过金巯键结合巯基修饰的适配体，从而形成适配体固定的纳米金(Apt-AuNPs)用于生物传感41, 53。在前人的研究中，根据纳米金空间距离改变而引起光学性能的变化和共振能量转移(FRET)中供体/受体结构的改变而引起的距离变化，Apt-AuNPs生物传感器主要作为重要的比色材料或是基于Apt-AuNPs 的FRET。例如，Chang的工作组基于纳米金比色或荧光分别检测了血小板衍生因子（PDGFs），凝血酶和Pb2+28, 49, 55-58。Zhao 等40 和 Mirkin等59 分别用AuNPs作为猝灭剂荧光检测凝血酶和三磷酸腺苷（ATP）。尽管适配体和AuNPs作为传感探针广泛的应用于研究领域，但是如何去设计一种多功能识别探针对不同的分析物呈现不同的响应信号，目前仍然面临巨大的挑战。然而，到目前为止，只有少数基于适配体的生物传感器结合AuNPs用于平行检测多种分析物43, 60, 61。例如，Elbaz et al.报道了一种双功能适配体用于检测5-单磷酸盐（AMP）62。该研究阐明了双功能适配体的重要性，但是，目标物的检测只限制在微摩尔级的范围内。Lus课题组基于AuNPs与适配体互补交联的机理对检测腺苷和可卡因做了一系列的工作63-65。这些前期的研究充分证明了比色检测的重要性，因为比色检测能够通过肉眼观察，检测非常简单，快速，但是这种适配体传感器通常用于单一目标位的检测。基于AuNPs的高效猝灭能力，Zhang等最近设计了一种多色荧光金纳米探针用于同一溶液中检测多种分析物41，主要是根据三种用不同染料标记的荧光基团-猝灭基团对，先与互补序列杂交然后固定在AuNPs的表面，该方法实现了同时检测三种分析物，但是在设计过程中，对于染料的选择，需考虑三个发射峰不能叠加等问题。为了简化检测过程，提高灵敏度和特异性，研发新型多功能适配体传感器探针，同时设计出对不同分析物具有不同信号的方案仍然是人们关注的一个热点。本文中，我们结合纳米金基于空间距离而产生不同的光学性能以及高效猝灭能力，设计了一种双功能金纳米探针用于同一溶液中简便，快速检测血小板衍生因子（PDGF-BB）和腺苷，根据已报道的PDGF-BB和腺苷适配体序列59, 66，我们将PDGF-BB的适配体前端包含腺苷的部分互补序列，从而形成了DNA的双螺旋结构，并且腺苷适配体5端用荧光素（FAM）标记，两者杂交后并固定在AuNPs的表面。当PDGF-BB加入到金纳米溶液中，因PDGF-BB的浓度以及适配体的亲和性不同，AuNPs会出现不同程度的聚集。Apt-AuNPs的聚集是由于适配体与PDGF-BB以2:1的模式结合67。当加入另一检测物腺苷，纳米探针会随着腺苷的加入而出现荧光发射峰，使得FAM在520 nm处激发产生强烈的发射峰。我们所设计的这种方法也可以应用于其他基于适配体传感器的多种分析物的检测。Fig. 2-1. Schematic of the fabrication of the bifunctional aptasensor and its application in multiplex detection of PDGF-BB and adenosine. (A) Formation of Apt-AuNPs conjugates through the self-assembly of thiolated Apt 1 on AuNPs and then hybridization with FAM-labeled Apt. (B) Schematic of colorimetric and fluorescence-based detection of PDGF-BB and adenosine by using the bifunctional aptasensor.2.2 实验部分2.2.1 仪器与试剂透射电子显微镜(TEM)图在JEOL-1230上拍摄，UV-vis光谱在UV-2450分光光度计上测定，荧光实验在F-4500荧光光谱仪上测定，采用发射模式，在490 nm处激发下收集520 nm处的发射峰。核酸适配体购买于上海生工，本文所用到的适配体序列如下：Apt 1：5-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TGC CCA GGT TCT CTT10-HS-3; Apt, 5-FAM-AG AGA ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3。适配体1是PDGF-BB的适配体，一端包含部分与腺苷适配体互补的序列，适配体2为腺苷适配体序列。PDGF-BB购买于上海生工，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，凝血酶，牛血清白蛋白(BSA)，溶菌酶，免疫球蛋白，纤维蛋白原和细胞色素c均购买于Sigma公司。其他试剂均为分析纯。反应与洗涤使用的PBS缓冲液（pH 7.4, 5 mM 磷酸盐, 200 mM NaCl, 2 mM MgCl2)，实验使用Milli-Q超纯水(Millipore, 18 MW cm)。2.2.2 AuNPs的制备用柠檬酸盐还原氯金酸的方法制备AuNPs24, 68。所有玻璃器皿均用王水浸泡过夜处理，洗涤干净。将100 mL 0.01%（质量分数）的氯金酸溶液加热至沸，在剧烈搅拌下快速加入3 mL，1%的柠檬酸三纳溶液，这期间溶液颜色变化有灰-蓝-紫，最后为酒红色，即生成了AuNPs。煮沸状态下继续搅拌10 min，移去热源，溶液搅拌15 min自然冷却接近室温。将所制备的AuNPs置于棕色瓶中在4 oC低温条件下保存备用。所制备的AuNPs的浓度根据朗伯比尔定律，参照文献计算方法，在520 nm处有紫外吸收峰，得浓度约为15 nM，直径约为13 nm69。2.2.3 Apt-AuNPs的制备Apt-AuNPs的复合物参照文献制备方法70。首先，将5 mL（100 mM）带巯基的核酸适配体溶于500 mL AuNPs溶液中，室温下静置24h，使核酸适配体中巯基与AuNPs充分自组装。然后，将上述溶液在12000转速离心分离20 min，离心分离后取出上层清夜，该过程重复3次，以完全除去未反应的过量核酸适配体，再将离心后的沉淀重新分散到0.1% BSA中以减少适配体在金纳米表面的非特异吸附，室温下平衡1h后离心除去上清液，将离心后的沉淀再次分散在PBS缓冲溶液中。BSA固定的Apt-AuNPs在高达3M的NaCl盐溶液中仍能稳定存在。然后，在酒红色的Apt-AuNPs溶液中加入5 mL，100 mM适配体，混合液在室温下放置24 h使适配体与适配体充分杂交。多余的未杂交的适配体按上述方法在12000转速下离心三次，每次20 min，取出上清液，将沉淀分散在PBS中于4 oC保持待用。2.2.4 检测过程2.2.4.1比色检测PDGF-BB首先，分别对PDGF-BB和腺苷进行了单一检测，过程如下:将含有不同浓度PDGF-BB的100 mL（0.2M）PBS溶液与Apt-AuNPs混合，在37 oC条件下平衡1 h。然后，取平衡后的溶液于石英比色皿中进行紫外测定。2.2.4.2 荧光检测腺苷单一检测腺苷过程如下：将含有不同浓度腺苷的100 mL（0.2M）PBS溶液与Apt-AuNPs混合，在37 oC条件下平衡1 h。充分反应后，将反应液在12000转速下离心20 min。然后，取上清液于石英比色皿中进行荧光测定，在490 nm激发下，记录520 nm处的发射峰强度。2.2.4.3 同一溶液中用比色和荧光进行双组分检测利用该传感器进行双组分分析步骤如下：10 mL不同浓度的PDGF-BB和腺苷的混合溶液加入到150 mL Apts-AuNPs溶液中，然后加PBS定容到250 mL，37 oC条件下反应1 h，然后进行紫外检测。混合物在12000转速下离心20 min，取出上清液，并用荧光法检测上清液。2.3 结果与讨论2.3.1传感器的设计及表征图2-1为检测PDGF-BB和腺苷的传感器原理图。该探针包含两条核苷酸链。首先在AuNPs的表面通过金巯键固定巯基修饰的Apt，然后再将染料标记的Apt与Apt杂交。在这种结合的状态下，该适配体探针仍呈酒红色，并且Apt上标记的染料被纳米金所猝灭。图2-2为AuNPs，Apt-AuNPs和加入检测物后复合物的TEM，UV-vis和荧光的表征。图2（A）给出了AuNPs (13.0 nm) (曲线 a) 和 Apt-AuNPs (曲线 b)及加入PDGF-BB的Apt-AuNPs复合物(曲线 c)的UV-vis光谱图。 AuNPs 和Apt-AuNPs在520 nm处显示特征吸收峰，这与纳米尺寸的Au表面等离子共振有关。而Apt-AuNPs复合物在252 nm处出现一个新的吸收峰(曲线 b)，归为适配体的特征吸收峰，说明成功捕获了适配体。当加入PDGF-BB后，Apt-AuNPs复合物 (曲线 c)在520 nm处的特征吸收峰降低，并在650 nm处的吸收峰增加。这说明PDGF-BB与Apt-AuNPs发生了特异性结合，每一个PDGF-BB分子结合两条适配体，形成三明治结构，使AuNPs的稳定性遭到破坏，从图2-2(A)中照片颜色的变化可以看出，加入PDGF-BB的Apt-AuNPs溶液颜色从酒红色变为紫色。为了进一步从微观结构上表征加入PDGF-BB前后Apt-AuNPs溶液粒子间的Fig. 2-2. (A) Photographs and UV-Vis absorption spectra of the AuNPs solutions (a), Apt-AuNPs (b), Apt-AuNPs with 150 nM PDGF-BB (c). (B) Fluorescence spectra of AuNPs before (a) and after (b) the addition of 1 mM adenosine. Transcription electron microscopy images of Apt-AuNPs in PBS without PDGF-BB (C) and with PDGF-BB (150 nM) (D). Each mixture was prepared in 0.2 M PBS (5 mM sodium phosphate, 20