蛋白氮与非蛋白氮区分检测规程

蛋白氮与非蛋白氮区分检测规程 A、 非蛋白氮的概述 非蛋白氮大致可以分为以下几类，尿素及其衍生物类，如缩二脲、羟甲基尿素等；氨态氮类，如液氨、氨水等；铵类，如硫酸铵、氯化铵等；肽类及其衍生物，包括氨基酸、酰胺、胺等；动物粪便及其它废弃物类。以下是几种常见的非蛋白氮的介绍： 双缩脲 又称缩二脲，是一种尿素缩合产品，其含氮量在35上，蛋白质当量为219。缩二脲难溶于水，一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法（原理：鱼粉中的双缩脲经抽提后，在酒石酸钠的碱性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物，在550nm波长下比色从而测出其含量）。 尿素 是氮和二氧化碳在高温高压下化合而成。纯尿素的含氮量为47，折合蛋白当量为29375。易潮解，易溶于水，一般的定量检验方法有二种：一种为二甲基氨基苯甲醛显色法；另一种为二嗪衍生物显色法。但以上两种方法只能测定游离性尿素而不能测定其衍生物。 尿素甲醛聚合物 是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量为38.89，折合蛋白当量为24306。该聚合物难溶于水。 硫酸铵 俗称肥田粉，其含氮量为20左右，折合蛋白当量为125。硫酸铵的工业品一般为白色或微带黄色的结晶，易溶于水，其分子式为（NH 4 ） 2 SO 4 。 异亚丁基二脲 又名二脲异丁烷，简称IBDU，为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成。IBDU为一种子的白色粉末或颗粒，总含氮量为3218，折合蛋白当量为201.13，吸湿度远低于尿素。 以上是比较常见的非蛋白氮物质。随着科技的发展，还会有越来越多的非蛋白氮物质被合成出来，从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛，而掺假者很容易将此物质掺入饲料原料中以提高原料的粗蛋白质。 B、非蛋白氮的检验 1、非蛋白氮的定性检验 在对原料样品的检测中，一般有定性检测和定量检测。在定性检测中，使用的比较多的为显微镜检，包括直接镜检、分层镜检（用四氯化碳或三氯甲烷分层）、反应剂镜检（用化学物质和样品中的某些物质反应而在显微下区分）、染色镜检等。在使用的过程中，往往使用一项或多项镜检方法对样品中的物质进行判定。 对于非蛋白氮的检验，显微镜检是一种比较有效的方法。在对样品的检测中，一般使用的是生物显微镜，其放大的倍数在36400倍之间，为了获得更好的显微效果，可以根据实际情况作出具体的调整。以下是镜检使用过程中的一些技巧： 直接镜检 直接镜检一般所用的倍数比较小，通过对样品不同的物理特征，如颜色、透明度、表面组织、形状等物理性状进行判定。特别的要与典型的样品进行比较，以便能够更好区分样品与杂质的不同。在直接镜检中，用不同的滤光片有时可以起到比较明显的效果。虽然直接镜检比较方便和直观，但有时对于样品中的物质很难区分时，可以用其它的检验方法。 分层镜检 将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后，样品与其它物质的区分会更加容易。对样品中的有机物和无机物分层之后，需在常温下干燥后再进行镜检。非蛋白氮一类的物质与原料的很多外观性质很不一样，通过两者的特异性之间的观察，可以对样品中是否掺有非蛋白氮一类的物质作出一个大概的判断。 反应剂镜检 用反应剂和样品进行反应，非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样，通过此种方法可以对样品中的非蛋白氮进行鉴别。经过四氯化碳分层之后，再与反应剂反应是比较好的一种方法。而镜检时在样品中加一滴或数滴浓硫酸，观察样品与浓硫酸反应的情况是一种比较直观的鉴别方法。因为无论动物蛋白还是植物蛋白，其与浓硫酸的反应速度和产生的现象比较明显。 染色镜检 用染色剂对样品进行染色，使样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色，而非蛋白氮一类的物质则和样品的染色后的表现不同，通过此种方法使两者区分开来从而加以鉴别。以下是比较常用的染色方法： 对植物细胞的染色方法：番红固绿染色法。取适量脱胎（视样品脂肪多少而定，可以用四氯化碳，也可以用丙酮，对于脂肪少的也可以不用脱脂）样品于烧杯中，用1的番红水溶液浸泡l3h水洗（去多余的染料）。将样品涂在玻片上，稍晾干。滴加 0l的固绿（溶剂用 95乙醇）。过 15s后滴加 95的乙醇，冲去多余固绿染料。待乙醇稍挥发后，加甘油液（甘油:水1:1）浸润，加盖玻片。用生物显微镜检查。染色结果：细胞核，木质化细胞壁呈鲜红色，纤维素细胞壁、细胞质呈绿色。因为非蛋白氮没有细胞核、细胞质等结构，所以只要能够较好的掌握染色技巧，其对比效果比较明显。当然，不能从染色效果判断其一定为非蛋白氮。 对动物细胞的染色方法：苏木精曙红对染法。取适量的脱脂样品于烧杯中，加入埃利希苏木精染色液浸泡35min，水洗数次（用5min左右）。将样品涂在玻片上，滴加氨水。34s后立即满加水，洗l min，稍晾一下，加 0.2曙红水溶液浸润 3min，滴加 95的乙醇，洗去多余曙红染料。再稍晾一下，加甘油浸润，加盖玻片，用生物显微镜观察。其染色的结果为：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。通过此种方法染色，一般能够很容易的区分样品和非蛋白氮一类的物质。 为了能够更清晰的在显微镜下区分样品与杂质，也可采用以下方法（对于检验鱼粉一类的物质比较有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层，除去无机物，必要时再用丙酮进行脱脂，再取一定量的样品置入蒸馏水中，搅拌，除去溶于水的物质，再用60目或80目的样品筛过滤，将样品放入5060的烘箱中进行烘干（时间不能过长，以保持样品原来的状态），然后在显微镜下进行检验或再对其进行处理后镜检。 在显微镜检中，只能对非蛋白氮作初步判断。若要进一步的分析判断，还需进行定量分析检验。 2、非蛋白氮定量分析 原理： 非蛋白氮主要包括以下五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离，测定结果包括了铵态氮如硫酸铵。 材料与试剂 （ 1）材料： 酒精喷灯， 60ml 玻璃消化试管，凯氏定氮蒸馏装置，真空泵， 200 恒温干燥箱，酸式滴定管 25ml ，锥形瓶 150 或 250ml ，容量瓶 100ml （ 2） 试剂与溶液： 6mol 1 的盐酸溶液： 35-37% 分析纯盐酸加等体积蒸馏水 2% 硼酸： 2g 溶于 100ml 蒸馏水 40% 氢氧化钠：分析纯氢氧化钠 40g 溶于 100ml 水 0.05mol/l 盐酸标准溶液（邻苯二甲酸氢钾法标定）： 4.2ml 盐酸，注入 100ml 蒸馏水中。 分析步骤 1 精确称取有代表性肠粘膜蛋白粉样品 0.1000g ，置于容积为 60ml 的试管底部（注意样品勿沾在管壁上），加入 30ml 6mol l 的盐酸溶液，抽真空，将试管在距试管口 l 2cm 处用喷灯加热并封口。将封好的试管置于干燥箱内，于 110 下水解 24h 。冷却后打开试管，将水解液过滤至 100ml 容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸，然后定容至刻度。 2 用 20ml 移液管移取 20ml 样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加入 20ml 1:1 的氢氧化钠溶液蒸馏 10 min ，用加有两滴混合指示剂的 20ml 2% 硼酸吸收馏出液。 3 用硼酸吸收氨后，立即用 0.05mol/l 盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色即为终点。 结果计算处理： 非蛋白氮的粗蛋白质计算公式 : CP(%) （ V1-V0 ） C0.076.25/ M V1 样品所消耗的盐酸的体积（ ml ） , V0 同时作空白滴定消耗的盐酸的体积， M 所称样品的质量（ g ）。 C 盐酸标准溶液的摩尔浓度（ mol/l ） 注意： 从理论上讲，在强酸或强碱和一定的温