高效液相色谱法知识讲解

高效液相色谱知识讲解 第1页 共49页 内容概要 第2页 共49页 高效液相色谱法 HPLC 是上个世纪七十年代迅速发展起来的一项高效 快速的分析分离技术 是现代分离测试的重要手段 色谱法的分离原理是 溶于流动相 mobilephase 中的各组分经过固定相时 由于与固定相 stationphase 发生作用 吸附 分配 排阻 亲和 的大小 强弱不同 在固定相中滞留时间不同 从而先后从固定相中流出 又称为色层法 层析法 一 HPLC简介 第3页 共49页 HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的 其以液体作为流动相 并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术 其分离机制与常规柱色谱相同 但填料更加精细 需高压泵推动 柱效高 分析速度快 与气相色谱不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程 其组成 比例和pH值可灵活调节 分离模式多样 在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性 从而使不同样品得到分离 第4页 共49页 高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来 由于使用了高压输液泵 全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器 实现了对样品的高速 高效和高灵敏度的分离测定 高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验 并引入微处理机技术 极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪 其自动化程度很高 既能控制仪器的操作参数 如溶剂梯度洗脱 流动相流量 柱温 自动进样 洗脱液收集 检测器功能等 又能对获得的色谱图进行收缩 放大 叠加 以及对保留数据和峰高 峰面积进行处理等 为色谱分析工作者提供了高效率 功能齐全的分析工具 第5页 共49页 高效液相色谱法的应用范围十分广泛 对样品的适用性广 不受分析对象挥发性和热稳定性的限制 几乎所有的化合物包括高沸点 极性 离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定 因而弥补了气相色谱法的不足 在目前已知的有机化合物中 可用气相色谱分析的约占20 而80 则需用高效液相色谱来分析 HPLC因其具有分离效能高 分析速度快 检测灵敏度好 能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学 药物及临床分析 世界各国己将该法收载于药典 第6页 共49页 液相色谱检测器 火焰离子化检测器 手性 化学发光 核磁共振 质谱检测器等新型检测技术 第7页 共46页 第7页 共49页 HPLC的特点 GC与LC的比较 第8页 共49页 由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制 因此具有更广阔的应用潜力 经过30多年的迅速发展 高效液相色谱法在基础理论 仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟 现已成为化学化工 环境 药学 食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一 第9页 共49页 第二节基本原理 液相色谱根据分离机理的不同可分为 液固吸附色谱 液液分配色谱离子交换色谱离子对色谱法 分子排阻色谱 或凝胶渗透色谱 第10页 共49页 一 液 固吸附色谱 流动相为液体 固定相为固体吸附剂 根据物质吸附作用的不同来分离物质 第11页 共49页 流动相和固定相都是液体的色谱法即为液 液色谱 是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离 一种液相为流动相 另一种是涂于载体上的固定相 流动相极性小于固定相极性的液 液色谱法称为正相分配色谱法 流动相极性大于固定相极性的液 液色谱法称为反相分配色谱法 二 液 液分配色谱 第12页 共49页 三 离子交换色谱 四 离子对色谱法 五 分子排阻色谱法 第13页 共49页 1100 1200HPLC仪器的结构组成 在线脱气机 G1322A G1379A B 二元 四元泵 G1310A G1311A G1312A B 自动进样器 G1313A G1329A B G1367A B C D 柱温箱 G1316A B 二极管阵列检测器 G1315A B C D 数据处理系统 三 HPLC结构组成 第14页 共49页 HPLC系统 第15页 共49页 泵的基本原理 往复活塞泵 单向阀 弹簧隔板 红宝石球 串联柱塞泵消除流量脉冲 并联柱塞泵减小流量脉冲 第16页 共49页 仪器 四元泵 不是 个泵 必配真空脱气机 二元泵各控制一种溶剂 四元泵 第17页 共49页 仪器 手动进样器 六通阀 定量环 六通阀定量环 通废液口 进柱 定量环 第18页 共49页 仪器 自动进样器 自动进样100样品盘 机器手 自动洗针 机械手 样品盘 第19页 共49页 色谱柱 柱温箱 色谱柱外挂架 柱温箱 外挂架 第20页 共49页 仪器 检测器 紫外 UV Vis双灯 全波长检测 检测器 流路 第21页 共49页 仪器 化学工作站 进样器 高压泵 流动相 色谱柱 检测器 数据处理 第22页 共49页 固定相与流动相 反相HPLC极性 固定相 流动相固定相 极性弱流动相 甲醇 乙腈等 极性强极性小物质后出峰 正相HPLC极性 固定相 流动相固定相 极性强流动相 己烷 庚烷 极性弱极性物质后出峰 与固定相极性相近tR长 主流 第23页 共49页 流动相 反相 常用溶剂 乙腈 甲醇 水等 实际使用 甲醇 水 乙腈 水混合体系 等度洗脱 流动相比例恒定梯度洗脱 逐步提高有机溶剂比例 第24页 共49页 流动相就比如人体的血液 其质量直接影响到整个系统的正常运行与否 应该使用HPLC级的溶剂 不能互相混溶的溶剂不可以直接切换 一般在水相和与其不混溶的溶剂切换时 使用异丙醇作为过渡溶剂 注意溶剂的截止波长 截止波长是指该溶剂可以在紫外检测器中使用的最低波长 低于该波长后 溶剂会有很强的紫外吸收 从而影响极限的稳定性 干扰对所分析物质的检测 四 HPLC常见故障与维护 1 HPLC对流动相的一般要求 第25页 共49页 HPLC所使用的水必须是新鲜的和经过0 45 m滤膜过滤过的 建议每天更换新鲜的水 长期不用时 必须把使用水的管路用有机溶剂置换 防止长霉 仪器使用完后要采用适当的溶剂冲洗等方法维护色谱柱和系统 如果使用了缓冲盐一定先将盐要冲洗干净 仪器长期不用时 不建议使用纯乙腈封存 因为乙腈有生成聚合物的趋势 建议使用甲醇 甲醇 水或乙腈 水封存 当有流路堵塞时 可以尝试将之反接后冲洗 污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命 并且影响泵和系统的的性能 这在水溶剂或磷酸盐缓冲液 pH4至7 中尤其如此 第26页 共49页 检查溶剂过滤器查看过滤器是否变色 尤其是盛放水相的溶剂瓶 拧开脱气机出口或比例阀入口管线 此时溶剂会因为重力流出 当脱气机或溶剂过滤头堵塞时 溶剂会流出不畅或不流出 临时取下过滤器 检查柱前压力是否正常 清洁溶剂过滤器将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下 用水冲洗残留之溶剂 然后将过滤器放在装有浓硝酸 35 左右 的烧杯里浸一小时 用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器至水为中性可以把过滤器放在塑料烧杯内超声清洗 但是不可使用玻璃器皿将过滤器重新装好 建议 定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶 可以高温灭菌 每三个月至少清洗一次 第27页 共49页 过滤器 将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面或较高处 当在四元泵上使用盐溶液或有机溶剂时 建议将盐溶液接在下面的梯度阀口上 将有机溶剂接在上面的梯度阀口上 有机溶剂通道最好在水或盐溶液通道的正上面 建议用水定期冲洗所有MCGV通道除去可能在阀口析出的盐结晶 操作泵之前 用至少两个体积 标准脱气机30mL 对微脱气机10mL 冲洗真空脱气机 特别是当泵关闭了一段时间后 例如 过夜 以及在通道中使用挥发性混合溶剂时 防止溶剂瓶内的玻璃滤头 过滤器 堵塞及长菌 当滤头表面有黑色或黄色污染层说明发生了堵塞 应立即清洗或更换 定期检查排液阀的过滤白头 检查方法 拧开排液阀 以水作流动相 对于标准脱气机 G1322A 流速5ml min水 若压力大于10bar 则建议更换 对于微量脱气机 G1379A 流速2ml min水 若压力大于5bar 则建议更换 第28页 共49页 泵的使用要点 当使用低流速时 检查所有1 16英寸接头有无渗漏 用压力测试或漏液测试 每当更换泵密封垫时排液阀虑芯也应更换 更换活塞密封垫时检查活塞杆上是否有划痕 有划痕的活塞将导致轻度渗漏 并降低密封垫的使用寿命 应尽早更换有划痕的活塞 使用缓冲溶液时 关泵前先用水冲洗系统 当需要长时间使用0 1摩尔或更高浓度的缓冲液时 最好选用密封垫清洗附件 以减少对密封垫及活塞杆的磨损 如果使用了高浓度的缓冲盐 可以考虑用热水 50 60 来冲洗盐通道来确保没有缓冲盐残留在系统中 更换活塞密封垫后应按照密封垫安装步骤对其进行磨合 但磨合不适用于正相密封垫 第29页 共49页 当泵头安装有柱塞清洗附件时 由于该附件中也有密封垫 这样就会增加活塞杆运动时的阻力 所以开泵前一定要用10 异丙醇 并将其流速调至约2 3滴 分钟使溶液流过冲洗装置 对于二元泵SL 如果不使用盐溶液可以不开 10 异丙醇有助于降低水的表面张力 并有抑菌作用 不要用其它溶剂代替 当泵头安装有冲洗附件而不开启10 异丙醇 会使密封垫及活塞杆的寿命减短 二元泵SL除外 泵头如果发出 吱吱 声不影响使用和泵的精度 如果有必要 可以改变压缩因子 compressibility 来达到更好的效果 第30页 共49页 下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行 使用新鲜配制的流动相 特别是水溶剂或盐缓冲液建议每天更换 避免溶剂瓶暴露在直射阳光下 尤其对于水 THF等 用氩气置换流动相上层的空气如果应用许可 在溶剂中加人0 0001 0 001M的叠氮化钠 不适用于LC MS 如果允许 可以考虑永远在水相中加入5 或以上浓度的有机溶剂 甲醇 乙腈 有时因为有气泡吸附在管壁上而造成气泡难以排出时 可以提起管线 使吸入一个大气泡 让大气泡把吸附在管壁上的小气泡一起带走 如果在purge时发现从purge阀一直有气泡流出 这时应考虑并非泵里面仍有气泡 而是液体从一个内径较细的管路 Purge阀出口内径比较细 流入一个内径较粗的管线 废液管的内径要粗很多 所引起 第31页 共49页 泵的主要日常维护项目 更换PurgeValve的PTFE过滤芯 Frit 清洗 更换主动阀阀芯清洗出口单向球阀更换柱塞杆或者柱塞杆密封圈 第32页 共49页 自动进样器 样品在进样前必须经过适当的预先处理 需要经过亚微米滤膜的过滤或者离心 防止样品中的微小颗粒堵塞管路 最好使用流动相作为溶剂配制样品 所用溶剂应该对样品有较好的溶解性 针座是喇叭口朝上暴露在空气中的 有时空气中的较大灰尘颗粒可能恰好落在针座的流路内而引起针座的堵塞 这时候可以尝试卸下针座 将它接在泵的出口上反冲 一般能解决问题 如果经常使用缓冲溶液 除了泵头之外 ALS计量泵的柱塞及密封圈 六通阀的转子密封圈和定子密封圈应该定期清洗 防止有盐的颗粒磨损ALS一定要使用Agilent的样品瓶及瓶盖 使用不兼容的或者加工精度差的样品瓶及瓶盖会引起ALS故障率的增加及性能的降低 第33页 共49页 漏液 针座磨损 堵塞 转子磨损进样量不准 转子磨损 计量泵故障 抽样速度太快 样品粘度太 进样阀的4 废液口堵塞 机械臂移动故障 抓不准样品瓶 传感器故障 周围环境差 样品瓶不标准初始化失败 MotorTemp 马达故障 传感器故障 周围环境差 第34页 共49页 自动进样器常见故障 自动进样器日常维护 定期检查各传动杆是否足够润滑 必要时先用酒精棉球擦拭干净后再给这些杆涂抹少量液润滑油 脏的传动杆使阻力增大从而造成自动进样器在取样过程中由于马达过热导致出错 检查取样爪子的绿色胶套时否损坏 如果损坏请更换之 否则会使样品放置位置不正确而导致针或针座等的损坏 仅对于标准自动进样器 用酒精棉签擦拭针座防止灰尘污染堵塞针与针座 必要时可以拆下超声清洗 第35页 共49页 UV灯不能点亮 灯坏了需要更换 一般是这个故障 主板或电源有问题基线不稳 流通池脏了 环境温度不稳定造成的基线波动 柱子脏了或没有平衡 泵压力不稳造成的基线波动 D2能量低或不稳定 出口废液管太短造成流通池压力不稳引起的基线问题 第36页 共49页 DAD常见故障及原因 HPLC日常维护 总结1清洗使用过缓冲盐的色谱柱时最好不要使用100 的水 因为大部分C18柱并不适合纯水的流动相 使用磷酸盐缓冲溶液 尽量避免和乙腈同时使用 因为磷酸盐在乙腈内溶解度很小 如果一定要使用的话 建议预先手动混合而非在线自动混合 注意不同检测器的出口废液管 因为Agilent设计的废液管同时有稳定流通池压力的阻尼作用 所以 废液管不能太短 否则可能引起流通池内压力不稳而造成基线波动 同时 注意保持废液管的畅通 因为不同流通池耐压不同 VWD40bar DAD120barMWD120barFLD20barRID5bar RID FLD永远只能是最后一个检测器 堵塞的废液管可能造成流通池过压而破裂 2 HPLC日常维护 第37页 共49页 HPLC日常维护 总结2定期清洗溶剂过滤头 35 浓硝酸浸泡1小时 不建议使用超声波清洗 流动相应经过0 45um或更小孔径的滤器过滤 如果使用滤膜 注意有机膜与水膜的区别 根据情况更换Purge阀内的在线过滤头 Purge阀打开 纯水5ml min 压力超过10bar时需更换 注意清洗在线脱气机及比例阀 尤其是长期使用水相或缓冲盐的通路 使用纯水冲洗后 再使用甲醇冲洗 可以打开Purge阀 使用5ml min的流速 第38页 共49页 HPLC日常维护 总结3安装有sealwash组件的 无论是否使用缓冲盐 开泵之前都应该使之充满流动的液体 10 IPA水溶液 并调流速为2 3滴 分钟 如果安装有自动SealWash 则可以通过软件自动控制 正相色谱 反相色谱切换时应使用IPA过渡 长期使用正相 正己烷等完全非极性溶剂 应更换正相柱塞密封垫 样品进样之前最好过滤 如果样品量太少 可以适当抬高进样针的位置流动相pH长期大于9 5或小于2 3时 进样阀应更换tefzel转子密封圈 注意不同检测器流通池耐压问题 尽量避免使用pH 9 5的流动相 以防腐蚀流通池石英窗 避免使用可能析晶的流动相 防止流通池堵塞 第39页 共49页 1100 1200HPLC故障诊断几个基本规则重现性 如果问题不重复出现 很难证实其确实存在 也很难诊断问题 唯一性 在排除故障的过程中一次只变化一个因素 以使你能够确认所变因素与问题之间的关联 恢复原状 如果使用更换组件方法来查找问题根源 则完毕后应将原有原来完好组件安装回原处 否则 换下的组件将来很难再利用 也可能造成误判 预见性 利用成功的故障排除经验来改善您目前的预防保养工作 使现有问题再发率降至最低 良好的记录习惯 一个好记录是成功地进行故障排除的关键 比如软件出了错误提示而关闭 那么最好的办法就是把屏幕copy下来以供诊断使用 第40页 共49页 3 HPLC常见故障诊断 HPLC故障诊断1 系统压力过高首先拧开排液阀 以纯水作流动相并设流速为5ml min若压力超过10bar 应先更换排液阀的虑芯 若排液阀的虑芯没有堵塞 卸下色谱柱 然后用一个两通代替色谱柱 以水作流动相设流速为1ml min 通常压力不会超过20bar 否则系统可能有堵塞 若上述的压力超过20bar 我们可按照从后到前的原则 依次拆下各条连接毛细管 最后就可以找到堵塞的地方 容易堵塞的地方 流动池入口管 自动进样器的针及针座 柱温箱加热块 第41页 共49页 HPLC故障诊断2 系统压力过低首先拧开排液阀 设流速1 2ml min后开泵 观察有无液流 若有再仔细观察液流是否有倒吸现象 如不能确定可用量筒测量流速的准确性 上述无液流 或流速不准多数为主动阀阀芯或主动阀故障 或泵有严重漏液 可以将主动阀阀芯取出进行超声波清洗 也可以进一步尝试拆下出口球阀超声清洗 如仍有问题 可考虑更换阀芯 注意 千万不要把整个主动阀放入超声波清洗这样会损坏主动阀 若上述流速准确但拧紧排液阀后压力不稳定 请仔细检查有无漏液 通常漏液地方 各接口包括色谱柱 泵 进样阀等 第42页 共49页 HPLC故障诊断3 保留时间不稳定首先观察保留时间是否有规律的变化 并同时观察压力是否稳定 若压力稳定而保留时间呈有规律变化 多数是色谱柱未平衡好 特别是含有盐的流动相 需较长的时间去平衡 若