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植物生理学研究技术长江大学农学院植物生理教研室 2004年8月实验一 植物组织水势的测定（小液流法）植物体内的生理生化活动与其水分状况密切相关，而植物组织的水势是表示植物水分状况的一个重要生理指标。目前，植物组织水势的测定主要有几种方法：小液流法、折射仪法、压力室法、露点法、热电偶法。前两种方法虽然简便，但精确性差。压力室法较适于测定枝条或叶柄导管的水势。露点法、热电偶法较适宜测定柔软叶片的水势，且精确度高，可在一定范围内重复测定叶片的水势，是较好的水势测定方法。植物的水势可作为制定灌溉的生理指标。一、实验目的 通过实验，掌握用小液流法测定植物组织水势的原理和方法。二、实验原理水势代表水的能量水平，水总是从水势高处流向低处。水进入植物体内并分布到各组织器官中的快慢或难易由水势差来决定，水势越高，植物组织的吸水能力越差，而供给水能力越强。当植物组织与一系列浓度递增的溶液接触后，如果植物组织水势大于（或小于）外液的水势，则组织失水（或吸水），使外液浓度变低（或变高），密度变小（或变大）。如果植物组织的水势等于外液的水势时，植物组织既不失水也不吸水，外液浓度不变。当取浸泡过植物组织的溶液的小滴（亦称小液流，为便于观察应先染色），分别放入原来浓度相同而未浸泡植物组织的溶液中部时，小液流就会因密度不同而发生上升或下沉或不动的情况。小液流在其中不动的溶液的水势（该溶液为等渗浓度），即等于植物组织的水势。三、实验材料、设备及试剂1. 材料：植物叶片；马铃薯块茎等。2. 仪器设备：试管；小瓶；小塞子；打孔器(直径0.5)；尖头镊子；移液管（1ml、5ml、10ml）；注射针钩头滴管；刀片。3. 试剂：1molL1蔗糖液；甲烯蓝粉。四、实验步骤 1. 系列糖浓度配制1.1 取干燥洁净试管6支，贴上标签，编号，用1molL1蔗糖母液配成0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.30 molL1浓度的糖液，各管总量为10ml，并塞上塞子（防止浓度改变），作为甲组。1.2 另取干燥洁净的小瓶6个，标明0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30molL1浓度,分别从甲组取相应浓度糖液1ml盛于小瓶中，随即塞上塞子，作为乙组。2. 取样及测定2.1选取生长一致的叶片，用直径为0.5cm的打孔器钻取圆片，在玻璃皿内混匀，然后用镊子把圆片放进乙组小瓶中，每瓶放1520片，（若采用植物块茎如马铃薯，先用打孔器钻取圆条，然后切成约1mm厚圆片，每瓶放5片），立即塞紧塞子，放置40min左右 ，其间轻轻摇动几次，以加速平衡。2.2 到预定时间后，各小瓶加入几粒甲烯蓝粉染色，摇匀，取6支干燥洁净的注射针钩头滴管，分别从乙组中取出溶液，插入甲组原相应浓度蔗糖溶液的中部，轻轻挤出钩头滴管内的溶液，使成小液滴，并小心地抽出钩头滴管（注意勿搅动溶液），注意观察那些管的小液滴往上移动，那些管的小液滴往下移动，那一管的小液滴静止不动。如果某一管中的小液滴悬浮不动，则说明该管溶液与小液流的密度相等，也即植物组织与该浓度糖液间未发生水分净交换，植物组织的水势等于该糖液的水势，根据公式算出该糖液水势也即得出植物组织水势 。若前一浓度溶液小液流下沉，而后一浓度溶液中上浮，则组织的水势值介于两糖液水势之间，可取平均值计算。2.3 结果记录按下表记录实验结果系列浓度糖液的配置和实验结果记录表需配糖液浓度（molL1）1 molL1糖液（ml） 蒸馏水 (ml)小液流移动方向（上、下或不动）0.05 0.5 9.50.10 1.0 9.00.15 1.5 8.50.20 2.0 8.00.25 2.5 7.5 0.30 3.0 7.0五、植物组织水势值计算将测得的等渗浓度值代入以下公式计算出植物组织的水势：公式中：W=iCRT（MPa）W 植物组织水势,单位：Mpa（兆帕） 溶液的渗透势（即溶液的水势） C 等渗浓度（molL1） R 气体常数（0.0083 LMPamol1K1）T 热力学温度（273 + t） i 解离系数（蔗糖 =1；CaCl2 =2.60）六、注意事项1. 配制糖液浓度要准确，并充分摇匀。2. 取样时选材要一致。3. 打孔时要避开大叶脉。4. 加甲烯蓝要适量，过多会影响溶液浓度，过少则很难识别小液流移动方向。实验二 叶绿素含量的测定（比色法）叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。一、 实验目的 掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。 二、实验原理叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。三、实验材料、仪器设备及试剂1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。3. 试剂：95乙醇、石英砂、碳酸钙粉。四、实验步骤 1. 叶绿素的提取 称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及35ml95乙醇研成匀浆，再加约10ml 95乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。 2. 测定 取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。五、计算 将测得的吸光度A652 值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg g1Fw）。 A652 C ( mg ml1 ) = （1）34.5公式中： C 叶绿素 （a 和b ）的总浓度( mg ml1 ) A652 表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度 34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm, 样品浓度为1gL1时的吸光度）。C（mgml1） 提取液总量（ml） 叶绿素含量（mg g1Fw）= （2）样品鲜重（g） 实验三 植物呼吸速率的测定（小篮子法）呼吸速率是植物生命活动最重要的指标之一，在植物生理研究中常有测定必要。目前测定植物呼吸速率有小筐子法、气流法、测压法、氧电极法、红外线CO2气体分析仪（IRGA）等方法。前两种方法是测定植物呼吸过程CO2的释放，虽然精确性差，但方法简便，其中气流法适用于测定大量样品（如植物的块茎、块根、瓜果类）的呼吸速率。测压法、氧电极法是测定植物呼吸过程对O2的吸收，样品用量少，且精确度高。利用红外线CO2气体分析仪测定植物呼吸速率比较快速、准确，是科研上常采用的方法。本实验目的在于掌握测定植物呼吸速率的原理及方法。一、 实验目的掌握用小筐子法测定植物呼吸速率的原理和方法。二、实验原理植物进行呼吸放出CO2,测定一定的植物材料在单位时间内放出CO2的数量，即能算出植物材料的呼吸速率。呼吸放出的CO2可用氢氧化钡溶液吸收，用标准草酸溶液滴定剩余的氢氧化钡。同时做一个空白实验，同样用标准草酸滴定。根据空白滴定值减去呼吸滴定值草酸用量之差值，便可计算出植物的呼吸速率。其反应式如下： Ba( OH )2 + CO2 BaCO3 + H2OBa( OH )2 + H2C2O4 BaC2O4 + 2H2O三、实验材料、仪器设备及试剂 1.材料：发芽水稻种及其他植物。 2.仪器设备：恒温培养箱；呼吸测定装置（如图）；天平；酸式和碱式滴定管；尖头镊子。3.试剂及配制 约1/44 molL1Ba(OH)2溶液配制：称取氢氧化钡（Ba(OH)28H2O）结晶7.25g,溶于蒸馏水中，溶解后定容至1000ml。1/44 molL1标准H2C2O4溶液配制：准确称取草酸（H2C2O42H2O）结晶2.8651g溶于蒸馏水中，溶解后定溶定至1000ml。每ml相当于1mgCO2。1酚酞指示剂配制：称取酚酞 1g 先用少量75酒精溶解，再用酒精定容至100ml。四、实验步骤 1.呼吸测定装置说明取一个500ml广口瓶（称呼吸瓶），加一个三孔橡皮塞。一孔插一盛碱石灰的干燥管，使呼吸过程中能进入无CO2的空气，一个孔插温度计，另一孔直径约1cm，供滴定用，平时用一小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一铁丝筐，以便装植物材料。整个装置称“呼吸测定装置”，如图所示。2.空白实验测定取干净呼吸瓶，准确加入约1/44molL1Ba(OH)2溶液20ml，立即塞紧橡皮塞（不带小筐及植物材料）。充分摇动呼吸瓶约10min，待瓶内CO2全部被吸收后，拔出小橡皮塞，加入3滴酚酞作指示剂，把滴定管插入孔中，用1/44molL1标准草酸溶液进行空白滴定，直至红色刚刚消失为滴定终点，记录草酸溶液用量（ml）。3.呼吸实验测定倒出废液，用水将瓶洗净后，加入上述相同浓度的Ba(OH)2溶液20ml。同时称取植物材料（发芽水稻种子）5g，小心装入铁丝筐中，挂于橡皮塞下，放入瓶中塞紧橡皮塞。记录开始时间，测定2030 min后（其间轻轻摇动数次，使溶液表面的BaCO3薄膜被破坏，而利于CO2的充分吸收），轻轻快速打开塞盖，把装有植物材料的小筐迅速取下，加入酚酞3滴作指示剂，立即重新塞紧橡皮塞。把滴定管插入孔中，用1/44molL1标准草酸滴定至红色溶液刚刚消失为滴定终点，记录草酸用量（ml）。五、呼吸速率计算 （ A B ） 1mgCO2ml1草酸 60 呼吸速率（mgCO2g1Fwh1）= - 植物组织鲜重（g） 测定时间（min） 公式中: A 空白滴定用去的草酸量 (ml) B 呼吸滴定用去的草酸量 (ml) 1ml 1/44 molL1的草酸相当于1mgCO2.六、结果记录实验数据及结果记录表植物名称 样品重 （g）测定时间（min）空白滴定草酸用量（ml）呼吸滴定草酸用量（ml）空白与呼吸草酸用量差值（ml）呼吸速率（mgCO2g1Fwh1）实验四 根系活力的测定 (TTC法)一、实验原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、实验材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培或砂培小麦、玉米等植物根系。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 电子顶载天平（感量0.1g）；4. 温箱；5. 研钵；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度试管10ml；11. 试管架；12. 容量瓶10ml；13. 药勺；14. 石英砂适量；15. 烧杯10ml、1000ml。（三）试剂：1. 乙酸乙酯（分析纯）。2. 次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。3.1TTC溶液准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。4. 磷酸缓冲液（115mol/L，pH7）。5. 1mol/L硫酸用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、实验步骤（1）TTC标准曲线的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、50g、100g、150g、200g的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37下暗保温13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算 四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）四氮唑还原量（mg）/根重（g）时间(h)实验五 植物细胞质膜透性的测定一、实验目的植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面，对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。但植物常受到外界不良因子的影响，而不同植物种类其抗逆性则不同。用电导仪率法测定植物质膜透性的变化，可作为植物抗逆性的生理指标之一。本实验主要测定低温对细胞质膜透性的影响，并掌握用电导仪法测定植物细胞质膜透性的原理及方法。二、实验原理植物细胞的细胞质由一层质膜包围着，这种质膜具有选择透性的独特功能。植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。如极端的温度、干旱、盐渍，重金属离子（如Cd2等）和大气污染物（如SO2、HF、O3）等都会使质膜受到不同程度的损伤，其表现往往为细胞膜透性增大，细胞内部分电解质外渗，外液电导率增大。该变化可用电导仪测定出来。细胞膜透性变得愈大，表示受害愈重，抗性愈弱，反之则抗性愈强。三、实验材料、仪器设备1. 材料：植物叶片。2. 仪器设备：电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50ml烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。四、实验步骤1. 清洗用具所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用自来水、蒸馏水洗3次，干燥后备用。2. 实验材料的准备及处理选取叶龄相似的植物叶片，剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗12次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约1cm2的小叶片（或用直径为1的打孔器钻取小园片），注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理：A杯放入冰箱0以下作低温处理，处理1530min后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入蒸馏水50ml。B杯常温处理，加入蒸馏水50ml。将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气2030min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。C杯加入蒸馏水50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸1015min（煮沸时间依不同植物叶片而定），冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续浸泡叶片。将A、B、C三杯放置室温下浸提1 h左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。3. 电导率测定用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定蒸馏水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表：电导率测定记录表处理电导率(S cm1)电解质的相对外渗率（）蒸馏水（空白）A（低温）B（常温）C（煮沸）五、结果计算按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率： 处理电导率 空白电导率电解质的相对外渗率（） 100% 煮沸电导率 空白电导率实验六 植物体内丙二醛含量的测定一、实验目的通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。二、实验原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑2、4二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100300gg1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5nmol L1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。三、实验材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片。2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3. 试剂：10三氯乙酸；0.6硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。四、实验步骤1. 丙二醛的提取称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。2. 显色反应及测定取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。五、丙二醛含量计算：由于蔗糖TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4103，MDATBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4103和155103。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。方程组： A450=（85.4103）C糖 （A532A600）=（155103）CMDA+（7.4103）C糖解得： A450 C糖= = 11.71A450（mmolL1） 85.4103 CMDA= 6.45（A532A600）0.56A450-（molL1）公式中：A450在450nm波长下测得的吸光度值A532在532nm波长下测得的吸光度值A600在600nm波长下测得的吸光度值 1.55105为摩尔比吸收系数C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。1. 按下式计算提取液中MDA浓度 反应液体积（ml） CMDA 1000 提取液中MDA浓度（molml1）= 测定时提取液用量（ml）2. 按下式计算样品中MDA含量 提取液中MDA浓度（molml1）提取液总量（ml） MDA含量（molg1 Fw）= 植物组织实验七 脯氨酸含量的测定一、实验原理用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。二、实验材料、仪器设备及试剂 （一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。 （二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70）溶解，贮于冰箱中；2. 3磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。三、实验步骤 1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100g。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6g/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（g/2ml）。 2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。四、结果计算据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下： 脯氨酸含量（g/g）X5/2/样重（g）。实验八 植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。一、考马斯亮蓝法一、实验原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0100g/ml），蛋白质色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。二、仪器与用具仪器：分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。 试剂： （1）牛血清白蛋白 配成1000g/ml和100g/ml； （2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月； （3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。 三、实验方法 1.标准曲线的绘制 （1）0100g/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0100g/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。表1 配制0100g/ml血清白蛋白液管 号123456100g/ml牛血清蛋白量(ml)蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20.80.020.40.60.040.60.40.060.80.20.081.000.10（2）01000g/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制01000g/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出01000g/ml的标准曲线。表2 配制01000g/ml血清蛋白血液管 号7891011121000g/ml牛血清白蛋白（ml）蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20.80.20.40.60.40.60.40.60.80.20.81.001.0 2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 四、结果计算样品蛋白质含量（mg/g鲜重）= 式中 C查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V提取液总体积（ml）；a测定所取提取液体积（ml）；W取样量（g）。二、LOWRY法一、实验原理 Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈315倍，为双缩脲法100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。二、仪器与用具 仪器：试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50l；分光光度计。 试剂：Na2WO42H2O；Na2MoO42H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO45H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。三、实验方法 1.酚试剂的制备 （1）取Na2WO42H2O 100g，Na2MoO42H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。安上回流冷却装置（使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。冷却后加入Li2SO4H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。 使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度，用时适量稀释，使最后浓度为1mol/L H，此为Folin-酚试剂乙液。（2）首先配制4% Na2CO3溶液；0.2mol/L NaOH溶液；1% CuSO4溶液；2%酒后石酸钾钠溶液；使用前与等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液；将与等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按501混合；配成Folin-酚试剂甲液。此试剂只能用一天。 2.标准曲线的绘制 （1）取7只试管编号,分别加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml标准蛋白质溶液，用水补到1ml，便成为每管含蛋白为0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg标准系列（必要时可做重复）。 （2）加5ml试剂甲，混匀，于30放置10min。 （3）喷射加入0.5ml试剂乙，立即振荡混匀，在30下保温30min。 （4）准确到30分后，以不加标准蛋白的管为空白，在500nm波长下比色测定吸光度值。 （5）以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 3.样品测定 （1）取50l样液加入试管中，（样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例，提取方法见各酶活测定）加蒸馏水补至1ml，然后重复步骤2的（2），（3），（4），以空白为参比，测吸光度值。（2）根据吸光度值，查标准曲线求得蛋白质含量。 四、结果计算蛋白质含量（mg/g鲜重）式中 C查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量（mg）；V提取液总量（ml）；a测定时取样液量（ml）；W取样量（g）。【注意事项】 1.Folin试剂乙只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前，还原反应即能发生。 2.为了保证反应进行完全，反应在2530水浴中进行，反应30min后准时比色。 3.还原物质干扰本实验。 【方法评述】上述两种方法均是灵敏度为微克级的高灵敏度定量测定蛋白质方法，前者稳定，后者简便；二者均优于现有的其它方法。二者的缺点是：Lowry法受植物体内存在的酚类物质干扰；考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低，且不同蛋白质与色素结合状况有差异。实验九 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）一、实验原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。二、实验材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30恒温水浴中保温1