第八篇-昆虫病原细菌利用

第八章昆虫病原细菌的利用 昆虫病原细菌的主要类群金龟子乳状病芽孢杆菌球性芽孢杆菌苏云金杆菌 在自然界中 细菌种类繁多 数量大 分布广泛 其中能使昆虫感染致病的虫生细菌相当多 昆虫因细菌而引起的疾病称为细菌病 细菌病有多种 不同的细菌引起的症状 Sympton 也各不相同 但细菌病有其共同的特征 即当昆虫感病后 不大活动 食欲减退 口腔及肛门常有排泄物 病原菌侵入体腔后引起败血症 死后虫体色加深 一般都有一股臭味 由于体都软化腐烂 所以通称为软化病 但软化病不完全是细菌病 一 昆虫病原细菌的主要类群 Bucher 1960 曾按昆虫病原细菌的特性和致病所需条件如侵染剂量 侵染部位 对寄主的专化性和作用的特定方式分为 专性病原细菌 产生晶体的芽孢杆菌 兼性病原细菌和潜势病原细菌 似可突出产晶体的芽孢杆菌 但产晶体的苏云金杆菌亦属兼性 兼性病原中的球形芽孢杆菌中的有毒菌株也能产生晶体 因此大致可划分为专性 兼性 潜势病原细菌3类 一 专性昆虫病原细菌 Obligateentomopathogenicbacteria 是一类专性寄生的芽孢杆菌 只能在寄主细胞中生长繁殖 不能腐生 不能在人工培养基上正常生长 对特定的寄主昆虫有很强的致病力 经口容易传染 自然界中寄主范围较窄 如日本金龟子芽孢杆菌 Bacilluspopilliae 和天幕毛虫芽孢杆菌 Clostridiummalacosomae 前者在另节介绍 Bacilluspopilliae 二 兼性病原细菌 Facultativeentomopathogenicbacteria 是一类可在昆虫体以外的生境中增殖 也能在人工培养基上正常生长发育的细菌 包括产孢和不产孢的杆菌 寄主范围较广 细菌在寄主消化道内增殖 并侵入体腔内 造成寄主染病死亡 有些种类能产生毒素 如果毒素进入消化道内 就能引起昆虫中毒 这类细菌包括引起细菌性中毒病的苏云金杆菌及其变种以及能引起灵菌败血病的粘质沙雷氏菌等 三 潜在病原菌 Potentialentomopathogenicbacteria 多数为腐生菌 普遍存在于昆虫的消化道中 由于毒素和酶的产生数量少 难以侵入体腔内给宿主造成危害 作为寄主的昆虫种类很多 不是特定昆虫种的病原体 能引起家蚕细菌性败血病和细菌性肠道病的一些细菌便属于这一类 四 细菌杀虫剂的特点自然界中广泛存在能够引起昆虫疾病的病原细菌 以上介绍的仅是其中的一部分 还有许多有待进一步探索 但作为一种微生物杀虫剂 并不是所有病原细菌都可以入选 而应该具备下列一些基本属性 1 毒力高 菌剂毒力足以压倒害虫的抗病力 能够稳定可靠地使害虫发病致死 2 稳定性 菌剂不致因受自然环境影响 如日光 干燥等 人工处理 悬浮剂 载体 贮藏 不同施药方式等而减低杀虫效力 3 残效期长 并有在害虫种群中自然传播的能力 4 作用迅速 5 有选择性 即对防治对象剧毒 而对植物 益虫以及哺乳动物等无毒 6 可以大规模生产 经济安全 二 金龟子乳状病芽孢杆菌 Dutky 1940 报道日本金龟子芽孢杆菌 B popilliae 和缓死芽孢杆菌 B lentimorbus 能引起日本金龟子等幼虫的乳状病 Milkydisease 二菌所致病情略异 分别称为 和 型 其后世界各国从不同金龟子幼虫分离出乳状病原细菌多种 用金龟子芽孢杆菌防治日本金龟子是生物防治最典型的例子之一 第一个日本金龟子芽孢杆菌制剂于1950年在美国登记 成为美国政府批准的第一个生物防治制剂 Grubinfectedwithmilkydisease left causedbyabacteriumcallBacilluspopilliae Healthybeetlelarva left larvainfectedwithB popilliae right Bacilluspopilliae 1 侵染金龟子芽孢杆菌主要通过芽孢感染和传播 芽孢经口摄入 当幼虫吞食芽孢后 芽孢可以在肠道中萌发成杆状的营养细胞 营养细胞能够侵染中肠细胞 随后穿过肠壁进入体腔 并大量繁殖 使幼虫的血淋巴呈乳状 死亡幼虫呈乳白色 故又称为乳状病 2 增殖金龟子芽孢杆菌在体腔中的增殖经历4个时期 1 芽孢萌发期 即所有细菌都是营养细胞 2 营养繁殖期 即90 是营养细胞 3 芽孢形成期 65 70 是营养细胞 17 28 是含芽孢的细胞 4 芽孢成熟期 即95 的细菌含芽胞 感染约10 14d后 被感染的昆虫幼虫死亡 幼虫的死亡原因还不是很清楚 一般认为是营养物质耗尽 或是存在稳定毒素 或是氧化酶代谢紊乱 3 培养繁殖金龟子芽孢杆菌的芽孢能在寄主体外存活 营养体也能在人工培养基上生长繁殖 但却不能在人工培养基上正常地形成芽孢 因此 商品制剂Doom Japidemic和MilkySpore都是采用幼虫活体培养的方法制备的 一般每头幼虫可产生2 5 109芽孢 近年来 国外试图克隆编码金龟子芽孢杆菌的杀虫活性蛋白的基因 并将其导入其它受体菌中进行表达 这为进一步开发利用此菌提供了新的途径 三 球性芽孢杆菌 球形芽孢杆菌 Bacillussphaericus 是一种在自然界广泛分布的芽孢杆菌 大多数菌株对昆虫没有毒性 但从中发掘出了一些对蚊幼虫有高毒力的菌株 它的毒效成分在细胞内 不分泌到细胞外的培养液中 因此 只有昆虫吞食细胞后才显示毒性 迄今已分离到各种球形芽孢杆菌的菌株近700株 仅有50多个菌株是有毒菌株 1 球形芽孢杆菌的毒素球状芽孢杆菌有两类毒素 一种来自营养细胞 是一种在营养生长期产生的蛋白质 这种蛋白的基因已被克隆和作序列分析 另一种毒素来源于伴孢晶体 是分子量分别为42Ku和51Ku的蛋白质 并且只有当两种蛋白质在一起时才产生毒性 球形芽孢杆菌的伴孢晶体与苏云金芽孢杆菌不同 它的伴孢晶体被部分地包在芽孢外壁之中 使得芽孢和伴孢晶体在离体的条件下仍是一个整体 2 球形芽孢杆菌的杀虫范围球形芽孢杆菌的杀虫范围仅限于蚊虫的幼虫 它通过取食过程进行感染 蚊子的幼虫在取食8 12h后 即可发生死亡 幼虫吞入球状芽孢杆菌后 菌体在肠道中被消化 细胞壁破裂 菌体内的毒素释放出来 从而杀死蚊虫的幼虫 3 球状芽孢杆菌的利用球状芽孢杆菌在昆虫死后 可以在虫尸中重新增殖 芽孢的数目增加 由此可见球状芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体在环境中持效期较长 并有可能在环境中再循环 因此 从20世纪80年代中后期开始 球状芽孢杆菌高毒菌株的筛选工作开始受到重视 迄今为止 美国 法国及我国等10个国家研制了不同剂型的产品十余种 但多是一些实验剂型 主要用于杀蚊幼虫的效果评价 我国生产了Bs 10 C3 41等乳剂 曾在野外大面积用于蚊虫的防治 四 苏云金杆菌 苏云金芽孢杆菌 Bacillusthuringiensis 简称B t 最早发现于1902年 1938年世界上第一个苏云金芽孢杆菌制剂Sporeine在法国问世 从而掀开了苏云金芽孢杆菌杀虫剂生产的序幕 特别是近10年来 苏云金杆菌已经成为加拿大控制枞色卷蛾 sprucebudworm 的主要手段 在其它国家 苏云金杆菌运用于控制毛虫 caterpillar 吉卜赛毒蛾 gypsymoths 等 目前全世界约有苏云金芽孢杆菌杀虫剂100个多个品种 年销售额近1亿美元 ThisleafrollercaterpillardiedafteringestingBacillusthuringiensis Discolourationofthegut asseenhere istypicalofmortalityfromBacillusthuringiensis 一 基本特征1 营养体苏云金杆菌是G 的好气性芽孢杆菌 营养体大小1 0 1 2 3 0 5 0 m 两端钝圆 周生鞭毛 能运动 少数无鞭毛 营养体单个存在或2 5个成链状 内生芽孢椭圆形或圆形 直径小于菌体的宽度 孢囊不膨大 营养体为繁殖阶段 横裂生殖 对数生殖期往往2 4 8个或更多的营养体连在一起成串状 此时繁殖快 代谢旺盛 适于用作接种材料 营养体在芽孢出现前先停止繁殖 细胞质浓缩 出现液泡和微粒 并逐渐形成芽孢和伴孢晶体 2 芽孢囊在形成芽孢的同时 在菌体内的一端或两端能形成具蛋白质性质的一个 两个乃至多个菱形 方形 长方形 椭圆形 镶嵌形或不规则形的伴孢晶体 是其主要的活性成分 伴孢晶体由不同分子量的多肽 原毒素 protoxin 组成 伴孢晶体具多种形态 典型的为梭状六面体 在显微镜下成菱形 也有四面体 圆形 方形和不规则形的 Bacillusthuringiensissporeandproteincrystals 3 苏云金芽孢杆菌的类群根据营养细胞鞭毛抗原的血清学反应及其它特性 苏云金芽孢杆菌可划分为40个血清种和54个血清型亚种 到目前为止 已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋白至少对脊椎动物中4个门和节肢动物门中9个目的有害生物有活性 1977年从以色列分离到血清型H 14 对蚊 蚋 白蛉幼虫有速效 无残效 但对蠓类和家蝇幼虫无作用 少数苏云金杆菌产生外毒素 exotoxin 血清 对家蝇亦有毒性 4 苏云金杆菌不同变种或菌株对昆虫的致病性和毒力的差异苏云金杆菌的不同变种对昆虫的毒力差异很大 属于不同血清型的变种或具有相同血清型的不同变种的寄主范围是不同的 即使是苏云金杆菌类群中的同一个变种 不同的菌株对昆虫的毒力差异也可以很大 毒力的大小与产生的毒素有关 也与细菌的致病机制和寄主昆虫的特异性有关 这对工业生产中有效菌株的选择以及高毒力或其他特异性菌株的选育具有重要意义 5 苏云金杆菌的培养特征苏云金杆菌对营养的要求不严 能在常用的细菌培养基 如牛肉膏蛋白胨培养基 中生长快而旺盛 并形成芽孢和伴孢晶体 在以黄豆饼粉 棉子仁粉 玉米浆等农副产品为主要养料的深层发酵中进行大量培养 每ml发酵液活芽孢数可达20 150亿 大致有同等数量的伴孢晶体 发酵液加填充料经板框压滤浓缩后 用喷雾干燥法制成菌粉 或将发酵液浓缩 离心或真空减压浓缩 后 加助剂制成液剂 乳剂或油剂 苏云金杆菌制剂亦可用半固体发酵法进行生产 二 苏云金杆菌的毒素和致病机理苏云金杆菌对昆虫的致病作用主要通过昆虫食入菌剂而引起 菌剂包括芽孢和细菌所产生的毒素 菌体本身的繁殖可导致害虫的死亡 而昆虫能在短时间内死亡往往是苏云金杆菌产生的毒素所致 苏云金杆菌对多种昆虫能引起发病而死 但对另一些昆虫则致病力很差 甚至没有作用 该类细菌的杀虫作用及其有效范围与致病机制和昆虫寄主密切相关 1 苏云金杆菌的毒素苏云金杆菌产生的毒素分为两大类 一类是内毒素 即伴孢晶体内所含毒素 另一类是外毒素 是细菌在生长过程中分泌在菌体外的代谢产物 苏云金杆菌所产生的毒素主要是 外毒素和 内毒素 1 甲体外毒素 exotoxin 是一种能被热破坏的 120 20min 蛋白质 在菌体培养对数期的后期时 先于芽孢和晶体的形成产生 口服能使某些害虫中毒 苏云金杆菌类中的不少变种能产生这种外毒素 2 乙体外毒素 exotoxin 又称热稳定外毒素 蝇毒素 能忍耐121 15min 的高温和对家蝇幼虫有毒性 苏云金素是广谱毒素 对较多目的昆虫有毒性 外毒素是一种腺嘌呤核苷酸衍生物 相对分子量约为700 它是苏云金芽孢杆菌在一定培养条件下所产生的细胞外毒素 可溶于水 热稳定性好 经高温高压处理后仍能保持毒性 热稳定外毒素包含两种核苷酸衍生物 为苏云金素A thuringiensinA 和苏云金素B thuringiensinB 菌素B是菌素A的r 内脂 菌素A加热失水而成B 而菌素B可由碱水解而成A 对家蝇毒力A大于B约8倍 3 丙体外毒素 exotoxin 是一种 或多种 未经鉴定的酶 能使卵黄琼脂变清 例如见于杀虫变种 4 丁体内毒素 endotoxin 通常又被称为伴孢晶体 Parasporalcrystal 伴孢晶体包含体 Parasporalcrystalinclusionbody 晶体蛋白 Crystalprotein 晶体毒素 Crystaltoxin 杀虫晶体蛋白 Insecticidalcrystalprotein ICPs 是苏云金杆菌具有杀虫性能的主要毒素 但晶体蛋白须在昆虫中肠碱性条件下经蛋白酶的消化作用裂解为有作用部分和无作用部分 只有有作用的部分或核心才能算丁体内毒素 晶体毒素的形成和形态晶体与芽孢同时形成 其主要成分是蛋白质 晶体的形成与芽孢的形成有密切关系 如能抑制芽孢形成的化合物如醋酸氟也能抑制晶体的形成 但二者的形成又是相对独立的 如在低温 14 15 培养条件下不能形成芽孢 但晶体仍能产生 伴孢晶体的成分B t 的伴孢晶体包涵体中含有一或多种杀虫晶体蛋白 Insecticidalcrystalprotein ICPs 按一定方式聚合成晶体结构 包括二聚体亚单位的多肽 多肽链中的半胱氨巯基大多处于分子表面 与相邻亚单位形成二硫键共价聚合的形式使原毒素 Protoxin 蛋白包容在伴孢包涵体中呈稳定的结构 晶体不溶于水和有机溶剂 可溶于碱性溶液 虽属热敏感毒素 但具有一定的耐热性 在65 中可保持1h 80 下20min也不致破坏 80 100 下30min可被破坏 晶体由18种氨基酸组成 各变种在氨基酸的组成上是相同的 其含量也相近 可见不同变种对昆虫表现出的不同毒力可能存在于高一级的结构单位之中 杀虫晶体蛋白基因 ICPgenes Hofte等 1989 根据核苷酸序列的同源性和杀虫范围的不同将Cry基因分为Cry 高抗鳞翅目昆虫 Cry 抗鳞翅目和双翅目昆虫 Cry 高抗鞘翅目昆虫 Cry 抗双翅目昆虫 Cyt Cytolytictoxin 溶细胞蛋白毒素基因 5类14个亚类 Feitelstein等 1992 将Cry基因分为7类 增加对鳞翅目和鞘翅目都有抗性的Cry 对线虫有效的Cry 29亚类 Crickmore等 1995 将其修订为Cry1 含22亚类 Cry2 Cry8 Cry9 各含3亚类 Cry3 含4亚类 Cry4 Cry5 Cry6 Cry7 Cry11 各含2亚类 Cry10 Cry12 Cry13 Cry14 Cry15 Cyt1 Cyt2 各含1类 CryIA 2 苏云金杆菌致病机理苏云金芽孢杀死宿主昆虫主要靠芽孢及毒素 在敏感昆虫吞食苏云金芽孢杆菌的芽孢后 芽孢在昆虫肠道中迅速萌发并增殖 引起肠道麻痹 最后穿透肠壁进入血液 引起昆虫败血症而中毒死亡 1 外毒素的致病机理 它是RNA聚合酶的竟争抑制剂 可干扰有关激素的合成 从而导致幼虫发育畸形或不能正常化蛹 苏云金芽孢杆菌虽然有较强的杀虫能力 但它必须经吞食过程进入体内才能杀死昆虫 因此在实际应用中 将其与吸引昆虫的物质一起喷洒 可以增加昆虫吞食的可能性 2 内毒素的致病机理 当敏感昆虫摄食苏云金杆菌的伴孢晶体后 在中肠肠液碱性条件下打开二硫键溶解成原毒素 进而在肠道胰蛋白酶的作用下激活成抗原蛋白酶的毒素核心片断 toxiccorefragment 才能与刷状缘 brushborder 上特异性受体高亲和性地结合 快速而不可逆地插入细胞质膜 形成孔或损伤 lesion 并破坏钾 钠离子梯度 引起膜的非极性化 最后通过胶体渗透裂解 Colloid osmoticlysis 将细胞膨胀并裂解 昆虫幼虫停止取食 最终导致死亡 三 Bt 内毒素的利用1 含Bt 内毒素新菌株的利用从20世纪80年代中后期开始 随着生物技术的广泛应用 人们利用DNA重组技术对毒素基因进行改造 构建综合性能优良的重组菌株并发展遗传重组杀虫剂已成为国外各大生物农药公司的目标 至90年代初 已有10余种遗传重组杀虫剂被批准进行后期田间试验 通过构建重组菌株可以实现以下目标 1 扩大杀虫谱 2 延长杀虫毒素的持效期及改进释放性能 3 提高毒力和杀虫晶体蛋白的产量 例如 美国的Sandoz公司通过略加改进Bt wuhanensis基因毒蛋白的氨基酸组成 使之杀虫毒性提高2 3倍 然后又将基因克隆并经穿梭质粒导入Bt kurstaki基因 这种具有杂合Bt毒素基因的工程菌已于1990年进入放大试验 具优异效果 利用抗生性标记法检测证实 该工程菌除毒力增强和杀虫谱扩大外 其它特性与原Bt菌无差异 未发现该工程菌对环境产生不良影响 不少国家在进行类似的研究 以期获得对多种害虫高效的新型Bt工程菌 2 含Bt 内毒素的转基因作物的利用1981年 Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt 杀虫晶体蛋白基因 揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕 迄公为止 已先后分离出4万多个Bt 菌株 68个亚种 对多个杀虫晶体蛋白基因序列进行了分离测定 1987年 比利时Vacek等人报道了首例有关转Bt基因烟草和番茄的研究结果 经过密码子优化的B t 基因已被成功地导入烟草 水稻 玉米 棉花 油菜 大豆等多种植物 以抗鳞翅目昆虫为主要目标 获得了一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源 产生了显著的社会经济效益 目前B t 基因己成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛 最具潜力和应用前景的抗虫基因 目前全世界总共已获得了50多种转B t 杀虫晶体蛋白基因植物 其中以双子叶植物居多 而单子叶植物由于其遗传转化较困难 所以获得的转Bt基因的植物就相对较少 在已获得的转B t 杀虫晶体蛋白基因植物中 绝大多数植物对靶标昆虫产生了强烈的毒杀作用 有效地减少了害虫损失 2004年全球转基因玉米 大豆 棉花和其它作物播种面积达到了2亿英亩 比2003年的1 67亿英亩增长了20 转基因作物的优点 1 己发现的高水平的Bt抗性基因都是隐性基因 在植物体内可稳定地遗传与表达 2 杀虫蛋白对昆虫的幼虫特别有效 可实现虫害的早期防治 3 可实现植物的整株保护 尤其是化学药剂喷施不到的部位的防治 如钻心虫 4 对人 畜及非靶标动物群休无害 不会破坏生态平衡 由于毒蛋白存留在植物组织中 不会污染环境 5 抗性持久 不易被环境因素所破坏 转基因Bt作物开始商业应用后 人们对Bt作物和目标害虫之间的互作关系 即Bt作物的抗虫性及害虫对Bt作物的抗性 进行了一系列的研究 其中害虫的抗性问题受到了特别的关注 近年来 转基因Bt作物环境释放的安全性成为国际上关注的另一个焦点 其中之一就是转基因Bt作物对不同营养层次上的非目标生物将会发生怎样的影响 目前比较关注的Bt作物和天敌的关系包括以下几方面 1 Bt作物对天敌存活和发育的直接 Bt毒素 或间接 通过害虫 影响 2 天敌对Bt作物上的目标害虫的行为反应 天敌和Bt作物对目标害虫的联合控制作用及其与害虫抗性治理之间的关系 3 Bt作物田中天敌的群落结构和种群动态 既包括有个体水平 生理 行为 上的效应 也可能有种群及群落水平上的影响 3 害虫对B t 内毒素的抗性自20世纪90年代以来 在美国 泰国 马来西亚 日本 中国等先后发现小菜蛾田间种群对B t 产生抗性以来 至少已有10种蛾类 2种甲虫 4种蚊蝇类经50次以上反复B t 处理而表现有选择抗性 在16种虫种中经3 120代后增高10倍 抗性机制 B t 毒素与中肠上皮细胞刷状边膜结合力降低 在结合发生之前降低毒素在中肠内的溶解性或活化性 降低导致结合后果的敏感性如膜插入和膜孔形成 害虫对B t 抗性的治理途径大致为 1 毒素混用 即认为害虫对混合毒素中每一组成都具抗性的情况少见 2 应用增效剂 如丝氨酸蛋白抑制剂对B t 防治4种蛾类和马铃薯甲虫增效 3 不同毒素轮换使用 但如对毒素间存在交叉抗性时轮换意义不大 四 苏云金芽孢杆菌在害虫