银杏叶中黄酮的提取及其抑菌性检测.doc

目录第一章绪论41.1银杏叶功效成分简述41.2 银杏叶主要成分研究情况41.3黄酮类化合物4（1）组成及结构4（5） 银杏黄酮类化合物的理化性质5第二章理论分析62.1银杏叶采集分析62.2 提取分析6第三章实验仪器及其材料7第四章实验方法及其过程74.1银杏叶采集、干燥74.2银杏叶中黄酮等物质的提取74.3细菌培养84.4制作菌悬液94.5提取物的抑菌性检测实验9第五章实验结果分析10第六章结论14银杏叶中黄酮的提取及其抑菌性检测摘 要银杏是我国的特有植物，又称公孙树。银杏叶为最古老的中生代孑遗植物银杏的干燥叶。银杏有裸子植物活化石之称。据本草纲目记载，银杏果具有敛肺平喘、止遗尿、白带的作用。在医药上有很高的利用价值。银杏所含黄酮类成分主要为银杏双黄酮、异银杏双黄酮，去甲基银杏双黄酮，其他还有二萜内酯、银杏内酯A、B、C等，其中黄酮类和二萜内酯类物质具有捕获游离基和抑制血小板活化因子、扩张脑血管、促进血液循环、抗氧化等功能，从而广泛用于治疗冠心病、心绞痛、治疗老年痴呆症和增强记忆功能、防治皮肤病、脱发等多种疾病，随着深入的研究银杏的开发和利用，银杏所特有的医药、经济价值逐步受到重视。银杏叶的提取方法有有机溶剂萃取法、水提取法、碱性稀醇或碱性水提取法、超临界萃取法、超声波提取法、酶法等。本文采用有机溶剂提取黄酮类化合物，结果表明实验证明提取银杏叶黄酮等物质用乙醚3小时提取70下2次回流最佳。菌体浓度试验表明当实验用菌体浓度在OD值为0.557，稀释到10-5和10-6比较适合，涂布能够成为单菌落，便于以后进行试验。提取抑菌性试验证明加入0.5ml时对大肠杆菌就有明显抑制作用，其抑菌效果随着提取物浓度的增加而增强，当提取物加入2.0ml时具有完全抑菌效果。关 键 词：银杏叶，总黄酮，乙醇，抑菌性检测 第一章绪论1.1银杏叶功效成分简述银杏树是目前发现的当今世界上最奇特1.5倍行距、对人类贡献最大的植物，特别是银杏叶具有五大成分五大功效，银杏叶将是世界上最有发展前景的中药材，能够治疗世界上很多的疑难杂症：（1）黄酮苷类：对心脑血管疾病，高血脂，高血压，清除氧自由基具有显著的疗效，是目前世界上治疗该类疾病最显著的药物。（2）银杏内酯A、B、C、M类：是血小板活化因子（PAF）拮抗剂，是银杏叶中最重要的活性成分，是治疗神经系统疾病的特效药物。（3）白果内酯类：白果内酯有很强的生物活性，为神经精神病药物，对因年老的呆傻症有奇异的疗效，它能抗神经末梢的衰老，被誉为真正抗衰老化学物质。（4）银杏酚酸类：可促进胃液和胆汗的分泌；具有抗细菌和消炎的作用；制成无残留农药；含有抗真菌物质，能够真正刺激促进造神经中枢系统的作用。（5）聚异戊烯醇类：血功能，改善肝脏机能，对再生障碍性贫血（白血病），对各种肝病、糖尿病具有最显著的疗效，是治疗这类疾病最具有开发前景的药物。1.2 银杏叶主要成分研究情况自20世纪60年代开始，许多国家采用现代分离技术对银杏叶的化学成分进行研究，经药理实验和临床验证，发现银杏叶的多方面生物活性与其所含特定化学成分有关。德国Willamar Schwabe首次注册了银杏叶的一种简单提取物，并于1972年申请了专利（W Schwabe DE 176708和DE 2117429），定名为EGb761，将其用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病，具有显著疗效，且无毒副作用；银杏内酯类化合物（ginkgolides）具有显著疗效，且无毒副作用；银杏内酯类化合物具有增强血小板活化因子（PAF）拮抗的作用。将银杏制剂列为治疗药物的国家有德国、法国和中国，其他国家均只将其用为保健食品或非处方用药。美国开发出的银杏保健食品已经获得FDA的批准，使人们对银杏叶的保健药用价值更加重视，对银杏叶化学成分研究也越来越深入。最近不断从银杏叶中发现一些新的生物活性成分。1.3黄酮类化合物（1）组成及结构黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。银杏叶中黄酮类化合物(flavonoids)可分为黄酮、双黄酮和儿茶素等三类化合物，共有36种，主要以苷的形式存在，是银杏叶的主要药理成分之一，含量较高，在银杏叶中含量变化较大。据对贵州等地330份样品及银杏叶生产发育期间黄酮苷含量的检测分析表明：不同地区、各单株之间变化幅度在0.2%2.74%；叶中黄酮苷含量0.8%者占测定数的48.0%；不同生育期间叶中黄酮苷含量相差2倍左右，4月份含量最高，46月份呈下降趋势，6至10月含量变化不明显。（2）银杏黄酮：银杏黄酮的苷元有7种，即槲皮素（quercetin）、山奈素（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、杨梅素（myricetin）、芹菜素（apigenin）、木犀草素（luteolin）、三粒小麦黄酮（tricetin）等，前三种是其主要成分。银杏叶及其提取物（GBE）的质量控制中主要检测这三种黄酮苷元的含量。（3）双黄酮： 银杏叶中的双黄酮是由两分子黄酮母核通过CC键聚合而成的一类化合物，一共有6种。（4）儿茶素类：儿茶素类化合物具有治疗肝中毒的作用和抗肿瘤活性。银杏叶中的儿茶素类化合物有6种。（5） 银杏黄酮类化合物的理化性质黄酮类为酚性成分，属多环多元酚类，由于含有苯并-吡酮而形成-烯醇酮（-enolone）结构，这种烯醇酮结构所表现的特性是黄酮分子中的酚羟基的弱酸性与铁盐的显色反应；还能与铝形成配合物，使光吸收长移，显较深的颜色，可用于鉴定黄酮类化合物（即铝盐比色法）；同时酚羟基具有还原性，表现在提取加工过程中的氧化变色，在提取分离时可加入还原剂进行保护。银杏黄酮类化合物的苷元多为结晶体、苷多为无定性粉末。黄酮苷类由于在结构中引入糖基，故均有旋光性，且多为左旋。银杏黄酮、黄酮醇及其苷类子含有7，4-位助色团，颜色为深黄色；在紫外光下产生荧光，可用于银杏黄酮类化合物的定性检验。银杏黄酮类化合物的苷元一般难溶于或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中。银杏黄酮苷与糖结合成苷后，水溶性相应增大，一般可溶于热水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯中，难溶于乙醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂。银杏黄酮类化合物因分子中具有酚羟基而显弱酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺等。第二章理论分析2.1银杏叶采集分析银杏秋季黄叶药用有效成份的含量，是春季绿叶的3.6倍，是夏季绿叶的4.1倍，是秋季绿叶的1.1倍。由此可见，采摘银杏叶的最佳时间，应是霜降前的1015天，即10月上、中旬。这样，一方面不会影响银杏树的生长，另一方面也最大限度地保证了叶片的利用价值。因此在采集时要把当时的绿叶和黄叶分好标明，同时也要用细绳测出树干周长，以便估算出树龄。2.2 提取分析（1）溶剂提取法：国内外使用最广泛的方法，步骤多、周期长、产率低、产品中有机溶剂易残留。溶剂系统主要有乙醇，水溶液、丙酮-水溶液、NaOH-水溶液、NaOH-乙醇等。精提物常在粗提物制备基础上精制，常用液-液提取法、沉淀法和吸附洗脱法。以60丙酮为起始溶剂粗提取，再脱脂、去银杏酚酸等15道工艺制成提取物。NaOH-水溶液提取效果最好，NaOH-乙醇溶液次之，正丁醇萃取水溶液中银杏黄酮苷，获得最佳萃取条件为萃取5 min温度604次，萃取物中黄酮苷含量为57。V水：V正丙醇=1:25最佳。银杏叶精提物树脂吸附纯化法以石油醚回流提取，再以80乙醇回流提取，减压浓缩，新型澄清剂沉降，树脂分级吸附，pH值为34酸水和酸性25乙醇洗涤，75乙醇洗脱，喷雾干燥。（2）超临界流体萃取法(SFE法)：利用临界或超临界状态的流体及被萃取的物质在不同蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离纯化的操作。最佳萃取实验工艺条件为萃取压力15 MPa、乙醇浓度90、萃取温度55，此时，黄酮类化合物萃取得率较理想。（3）高速逆流色谱技术提取法：是一种不用任何固定载体的液一液分配色谱技术W=70%的乙醇连续循环喷淋逆流6级萃取，m乙醇：m银杏叶=5:1，总萃取时间240min,萃取温度5055度，萃取率99%以上。（4）微波提取法：微波提取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多及热效率较高，升温快速均匀，大大缩短了提取时间，提高了萃取效率。以水为介质的条件下，对银杏叶进行微波处理。（5）超声提取法：超声技术应用于天然活性产物的提取，具有速度快、提取率高、节省溶剂、节约能耗、不破坏有效成分的特点。最佳操作条件为超声波频率40kHz处理时间10min、静置时间12 h。以水为介质，在较低温度下。（6）酶提取法: 加入淀粉部分水解产物及对葡糖基有转移作用的葡糖苷酶或转糖苷酶，使油溶性或难溶于水或不溶于水的有效成分转移到水溶性苷糖中，既提高了有效成分的提取率，又促进难溶于水或不溶于水的有效成分在体内的吸收. 在常规的醇一水浸提之前用纤维素酶对原料进行酶预处理(酶解时间为2h)。（7）分子烙印技术: 在极性溶剂中，以丙烯酞胺作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了分子烙印聚合物(MIP) MIP对槲皮素具有特异的亲合性，将该MIP直接用于分离银杏叶提取物水解液。第三章实验仪器及其材料仪器：研钵、电子天平、索氏提取器、水浴锅、锥形瓶、量筒、平皿、移液管、试管、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台。材料、试剂：银杏叶、60%乙醇、70%乙醇、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、石油醚。第四章实验方法及其过程4.1银杏叶采集、干燥（1）银杏叶采集于2012年9月初河北化工医药职业技术学院内，直径10cm，树龄20年左右，雌株。（2）采集后的银杏叶于60烘干至恒重，置于研钵中碾压成粉末状用于之后实验。4.2银杏叶中黄酮等物质的提取（1）乙醇提取用电子天平称取银杏粉末10g，置于索氏提取器中加入70%乙醇60ml，提取器下接圆底烧瓶，瓶中加30ml70%乙醇，于水浴锅中7080恒温加热回流两次，蒸馏回收乙醇，得银杏叶黄酮提取物。乙醇浓度为50一70时,提取率随浓度增加提高，当浓度70时提取率达最大。随水浴温度升高总黄酮提取率快速增加。当温度80时提取率达最大。（2）石油醚提取用电子天平称取银杏粉末10g，置于索氏提取器中加入石油醚70ml，提取器下接圆底烧瓶，瓶中加30ml石油醚，于水浴锅中7080恒温加热回流两次，蒸馏回收石油醚，得银杏叶黄酮提取物。（3）提取过程结束后将两组提取物置于水浴锅中蒸干。4.3细菌培养（1）培养基的制备培养基配方: 牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂1.5g，水100ml要配置2000ml培养基，称取牛肉膏3 g两份，蛋白胨10 g两份，琼脂15 g两份，分别加入到1000ml大烧杯中。加蒸馏水至1000ml搅拌摇匀。后用氯化钠和盐酸调节ph至7.0.。分装于4只锥形瓶中。（2）所用仪器的灭菌用报纸将所用到的仪器包好，平皿12个，移液管7只，培养基500ml，10ml无菌水试管6只，涂布器4个。再将包好的仪器放入高压蒸汽灭菌锅中120灭菌30分钟。正确的操作流程：检查水位加水摆放物品盖锅盖接通电源设置杀菌温度和时间点击“work”工作按钮杀菌（升温保温降温）切断电源开盖取出物品。 操作注意事项：加水不可过多，不超过锅内平台，避免浸湿物品；每次杀菌前一定要检查水位；盖锅盖时应该对称拧紧三对螺母，避免一顺操作造成盖子一边紧一边松，不平衡而漏气；盖完盖子后要检查盖上的两个阀门是否都闭上了，切忌没关上就离开，否则杀菌过程中温度无法上升到100度以上；一定要按“work”工作按钮，否则杀菌锅是不会开始工作的；杀菌锅报警后，没有特殊情况，不应过早放气，应该等待自然冷却；压力表指针回零后方能开盖。（3）划线涂布培养准备工作：应穿上白大褂，带上口罩，进入无菌室，先用酒精清洁双手，然后将物品合理摆放，左手用的东西放在左边，右手用的东西放在右手边，禁止跨过酒精灯取东西；然后用酒精棉球从中心到周围清洁台面，将酒精灯放在正中间，点燃酒精灯；再清洁一遍双手，才可以进行操作。将灭菌后的仪器放到超净工作台上开始划线，涂布。首先进行菌液的浓度梯度稀释，用移液管将原菌液吸取1ml然后放入10ml无菌水试管中，将试管置于手心中震荡摇匀，后依次分别用新的移液管取1ml前一梯度的菌液放入下一梯度，共稀释6个梯度。到平皿，首先将平皿标号分别为103104105106 划线、涂布。待培养基冷却到适宜的温度（50度左右，保持液态，而不烫手）时，解开三角瓶的包扎纸，右手拿起三角瓶，灼烧瓶口后在无菌区开塞；然后将瓶口保持在无菌区，左手拿起一个平板，开盖前过一下火，在无菌区打开皿盖，往皿中倾倒1520ml培养基，在无菌区盖上盖子，从台边缘将平皿快速放到台面，然后轻轻摇匀，放定，在凝之前不要再挪动平皿，否则培养基表面可能不平。注意无菌操作，每次到时都要靠近酒精灯。平皿倒好后平放于工作台上等待其凝固。培养基凝固后开始划线、涂布，首先找出标有10-3,划线的平皿然后用接种针在火焰上灼烧后，沾取103梯度的菌液在这3个平皿上划线，然后再找出标有10-3涂布的平皿，用涂布器在火焰上灼烧后，用梯度稀释时的移液管取0.1ml到平皿上开始涂布。之后的梯度照此方法划线涂布。划线时注意：等平板完全凝固后再划线，完全凝固后再多放几小时效果会更好、划线时，接种环要弄干净、接种环与平板的角度尽量小，划线时要快、准，避免重复划线！涂布时注意事项：样液应该进行充分稀释，保证能分离得到单菌落；用涂布器时，若涂布器经过灼烧，应该待涂布器充分冷却后才能进行涂布，避免太烫破坏培养基；涂布时应该均匀，不要碰平皿边缘。之后将平皿放入培养箱中培养。4.4制作菌悬液将培养后的平皿取出观察挑选单菌落，用接种针挑取适量菌体放入无菌水中，制成菌悬液。制成菌悬液后用分光光度计测量其菌浓。首先接通电源，打开电源开关，指示灯亮，打开比色皿暗箱盖，预热20分钟。波长选择旋钮，选择所需的单色光波长，用灵敏度旋钮选择所需的灵敏档。放入比色皿，旋转零位旋钮调零，将比色皿暗箱盖合上，推进比色皿拉杆，使参比比色皿处于空白校正位置，使光电管见光，旋转透光率调节旋钮，使微安表指针准确处于100%。按上述方法连续几次调整零位和100%位。测出菌浓为：0.557。4.5提取物的抑菌性检测实验（1）实验仪器灭菌：6根移液管；6个装有10ml蒸馏水的试管；24个平皿；1500ml培养基；6个涂布器。（2）将提取物用70%乙醇溶解：共3组提取物2组为石油醚提取，一组为乙醇提取。（3）将灭菌后的仪器在超净工作台上倒平皿，标号10-5对照；10-5 0.5ml；10-5 1.0ml；10-5 1.5ml；10-5 2.0ml；10-6对照；10-6 0.5；10-6 1.0；10-6 1.5；10-6 2.0；分别标三组其中一组表明乙醇组。标好号后就开始倒平皿解开三角瓶的包扎纸，右手拿起三角瓶，灼烧瓶口后在无菌区开塞；然后将瓶口保持在无菌区，左手拿起一个平板，开盖前过一下火，在无菌区打开皿盖，往皿中倾倒1520ml培养基，在无菌区盖上盖子，从台边缘将平皿快速放到台面，然后轻轻摇匀，放定，在凝之前不要再挪动平皿，否则培养基表面可能不平。注意无菌操作，每次到时都要靠近酒精灯。平皿倒好后平放于工作台上等待其凝固。（4）将制作好的菌悬液进行梯度稀释，稀释成6个梯度。（5）在倒好的培养基实验组按照标号分别加入0.5ml；1.0ml；1.5ml；2.0ml提取物，然后用涂布器涂匀。（6）实验组涂布完成后按照平皿上的标号分别滴加0.1ml10-5和10-6梯度稀释的菌悬液，涂布均匀后放入培养箱培养。0ml0.5ml1.0ml1.5ml2.0ml10-5（第一组）200个菌落30个菌落10个菌落8个菌落0个菌落10-6（第一组）200个菌落150个菌落46个菌落27个菌落9个菌落10-5（第二组）200个菌落50个菌落36个菌落12个菌落4个菌落10-6（第二组）200个菌落160个菌落43个菌落20个菌落10个菌落10-5（乙醇）200个菌落190个菌落16个菌落10个菌落0个菌落10-6（乙醇）200个菌落180个菌落20个菌落19个菌落6个菌落第六章结论菌体浓度试验表明当实验用菌体浓度在OD值为0.557，稀释到10-5和10-6比较适合，涂布能够成为单菌落，