动物实验中的本技术与方法.ppt

1 第七讲动物实验中的基本技术和方法 2 第一节实验动物的抓取与固定抓取与固定是动物实验的一项基本技术 其目的是使动物保持在安静的状态下 顺利地进行各项实验 同种动物不同实验目的 实验内容 抓取与固定方法也可以不同 一 小鼠的抓取保定 器材 小鼠饲养盒 面罩1套 方法步骤 1 用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部将小鼠提起 放在饲养合的面罩上 2 用左手拇指和食指迅速 准确地捏住小鼠的两耳后及颈背部的皮肤 将小鼠提起 3 翻转左手掌 以左手掌心和中指夹小鼠背部的皮肤 使小鼠整个呈一条直线 4 用左手无名指压住小鼠背部的皮肤 小指压住小鼠的尾巴根部 5 松开捏住小鼠尾巴的右手拇指和食指 此法适用于肌注 腹腔注射 灌胃等 5 2 固定板 器 固定 1 将小鼠麻醉后 用细绳捆住小鼠四肢 2 准备一个15 20cm 边缘钉有5个钉子的方木板 3 将四肢用细绳固定在木版两侧的钉子上 在上颚切齿处用细绳固定在木版前方的钉子上 固定板固定适用于大多数动物手术 小鼠固定器适用于尾静脉注射 6 二 大鼠和地鼠 一 抓取1 周龄较小的大鼠和地鼠 可以像小鼠一样抓住尾部提起 7 2 周龄较大的大鼠可张开左手虎口 迅速将拇 食指插入大鼠的腋下 虎口向前 其余三指及掌心握住大鼠身体中段 并将其保持仰卧位 然后调整左手拇指的位置 紧抵在下颌骨上即可进行实验操作 8 注意 操作者第一次抓取大鼠时 最好戴防护手套 不能捉提尾尖 也不能长时间将大鼠悬在空中 9 二 固定1 徒手固定 对体重较小的大鼠可用拇指 食指捏住大鼠耳部及颈部皮肤 余下三指紧捏住背部皮肤 置于掌心 调整好大鼠在手中的姿势即可进行实验操作 如 灌胃 腹腔注射 肌肉注射 皮下注射等实验 10 2 固定板固定 方法与小鼠固定板固定相同 只是需选择更大一些的固定板 3 固定器 盒 固定 方法与小鼠固定器 盒 固定相同 只是固定器较小鼠的大 同样适用于大鼠尾静脉注射 11 三 豚鼠 一 抓取抓取幼龄豚鼠时 用两手捧起 成熟豚鼠可以用左手大把抓起 12 注意 豚鼠性情温和 但胆小易惊 易造成自伤 抓取时 不能太粗野 更不能抓腰腹部 在操作过程中 如果豚鼠挣扎 手不要越握越紧 否则会造成豚鼠呼吸困难 甚至死亡 13 二 固定1 徒手固定 用左手的食指和中指放在豚鼠颈背部两侧 拇指和无名指放在肋部 分别用手指挟住左右前肢抓起 然后反转左手 用右手的拇指和无名指挟住右后肢 用中指和无名指挟住左后肢 使鼠体成为一条直线 2 固定板 器 固定 与大 小鼠 豚鼠固定板固定基本一致 四 兔的抓取保定 一 方法1 步骤 1 用右手抓住兔颈部的被毛和皮肤 轻轻把兔提起 2 用左手托住兔的臀部 二 方法2 器材 兔保定架1个 步骤 1 打开保定架的上盖 抓取并将兔放进架内 迅速关上保定架的上盖 2 右手抓住兔耳朵将头部拉过保定架的卡栓 将兔的脖子保定 3 如果兔挣扎 可用手在它的背上轻轻抚摸 使其安静 16 注意 家兔温顺 一般不会咬人 但脚爪较锐利 要防止被抓伤 另外抓取时不能只提兔耳或四肢 也不能用单手只抓颈背部皮肤 17 五 实验犬 一 抓取可用特制的长柄铁钳夹住犬的颈部 由另一人用布带或粗绳缚其嘴 并将布带 绳固定在狗耳后颈部 防止脱落 注意 狗性情凶恶 咬人 避免被其咬伤 在缚嘴时 动作要迅速 捆绑松紧要适中 18 二 固定实验台固定 用特制的长柄铁钳夹住犬的颈部后 麻醉动物 将麻醉的犬放在实验台上 再用粗棉带 绳 固定四肢于实验台上 并将犬舌拉出 此固定方法仰卧位适用于口腔 颈 胸 腹 四肢等部位的实验 俯卧位适用于脑 背部位的实验 19 三 实验动物编号与标记方法 一 染色法 1 单色涂染法 在每组动物不超过l0只或一个实验不超过40只的情况下适用 实验动物 大鼠 小鼠 常用染色剂 3 5 苦味酸溶液 可染成黄色 2 硝酸银溶液 涂染成咖啡色 涂后需光照10min 0 5 中性红或品红溶液 涂染成红色 煤焦油酒精溶液 涂染成黑色 龙胆紫溶液 涂染成紫色 方法步骤 1 涂染原则 从左到右 从上到下 2 左前肢为l号 左侧腹部2号 左后肢3号 3 两耳后部4号 背中部5号 后肢背部6号 4 右前肢7号 右侧腹部8号 右后肢9号 5 尾巴根为10号 6 额部为20号 2 双色涂染法 在每组动物不超过100只的情况下适用 实验动物 大鼠 小鼠 常用染色剂 1 3 5 苦味酸溶液 可染成黄色 作为 个 位数 2 0 5 中性红或品红溶液 可染成红色 作为 十 位数 方法步骤 1 用两种颜色同时进行染色标记 2 用苦味酸 黄色 染色标记作为个位数 个位数的染色标记方法同单色涂染法 3 用品红 红色 染色标记作为十位数 4 左前肢为10号 左侧腹部20号 左后肢30号 两耳后部40号 背部50号 后肢背部60号 右前肢70号 右侧腹部80号 右后肢90号第100号不作染色标记 二 穿耳孔法用专用耳空器在动物耳朵不同部位打一小孔或缺口表示一定号码的方法 原则是 左耳代表十位 右耳代表个位 实验动物 兔 犬 猪 三 标牌法一般挂在动物的颈部 耳朵 脚上或实验动物 犬 猴 四 烙印法 五 剪毛法 26 第三节实验动物的给药途径与方法实验动物的给药方法主要有 注射法和胃肠给药法两种 此外还有用于皮肤的涂布给药法和用于呼吸道的吸入给药法 裸鼠 27 一 注射分为 皮内注射 皮下注射 肌肉注射 腹腔注射 静脉注射 脑膜下注射 脑内注射 胸腔内注射 腰椎内注射 关节腔注射和心内注射 在实验过程中 应根据实验目的 动物种类 药物类型选择给药途径和方法 若是临床前药物的动物实验 给药方法应与人的给药途径一致 28 29 30 二 注射给药1 皮下注射给药 原理 将药液注入皮下结缔组织 经毛细血管 淋巴管吸收进入血液循环 器材 1m1注射器1支 生理盐水 烧杯 酒精 碘酒 棉球 方法步骤 1 注射部位 颈背部 腋下 腹侧和后肢的皮下 2 常规消毒注射部位的皮肤 用注射针头取一锐角角度刺入皮下 3 将针头轻轻向左右摆动 易摆动则表示已刺入皮下 再轻轻抽吸 如无回血 可缓慢地将药物注入皮下 注射量 0 01ml 0 03ml g体重 2 皮内注射 此法用于观察皮肤血管通透性变化或皮肤反应 注射部位 动物背部脱毛 用针头平直进入皮内 注射药液后 皮肤表面鼓起小泡 停片刻拔出针头 3 肌肉注射给药原理 将药液注入动物的肌肉组织 经毛细血管吸收进入血液循环器材 1ml注射器1支 生理盐水 烧杯 酒精 碘酒 棉球 注射部位 一般选择肌肉丰富而无大血管通过的臀部或大腿外测 回抽无血即可注射 4 静脉注射给药 1 大小鼠尾静脉注射原理 将药液注入小鼠的尾静脉 器材 1m1注射器1支 生理盐水 烧杯 金属笼或大小鼠器 酒精 碘酒 棉球 方法步骤 1 将大小鼠放在金属笼或小鼠固定器中 通过金属笼或大小鼠固定器的孔拉出鼠尾巴 2 用左手捏住鼠尾巴中下部 用75 酒精棉球反复擦拭尾部 3 注射时 以左手拇指和中指捏住鼠尾两侧 用食指从下面托起尾巴 以无名指夹住尾巴的末梢 4 右手持4号针头的注射器 使针头与静脉平行 小于30度角 5 从鼠尾巴下1 4处进针 仔细观察 如果无阻力 无白色皮丘出现 说明已刺入血管 即可注入药物 6 拔出针头后 用干棉球压住注射部位约l 2min 防止出血 注射量 小鼠0 005m1 0 01m1 g体重 大鼠1 0 2 0m1 100g体重 2 兔耳缘静脉给药原理 穿刺兔的耳缘静脉器材 兔保定架 注射器1支 生理盐水 烧杯 酒精 碘酒 棉球 方法步骤 1 将兔放在保定架内保定 2 酒精消毒并揉搓血管 使兔的耳缘静脉充盈 3 用左手食指和中指夹住兔的耳缘静脉的近端 拇指绷紧静脉的远端 无名指和小指放在耳郭下作垫 4 右手拿注射器 针尖的斜面朝上 将针头从远心端插入血管 放松对静脉近心端的压迫 回抽有血即可注射 拔针后用棉球止血 42 二 胃肠给药法分为 自动口服给药灌胃给药直肠给药 43 表常用动物一次灌胃能耐受的最大容积 动物种类体重 g 最大容积小鼠 301 025 300 820 240 5大鼠 3008 0250 3006 0200 2494 0 5 0100 1993 0豚鼠 3006 0 250 3004 0 5 0家兔 35002002500 35001502000 2400100猫 3000100 1502500 300050 80犬10 000 15 000200 500 44 45 第四节实验动物血液和尿液的采集 一 动物血液的采集方法实验动物血液的采集方法有很多 一 按采血部位不同可分为 眼部采血 耳部采血 心脏采血 大血管采血及尾部采血等 小香猪 46 二 按采血使用的手段不同可分为 鼠尾刺血 剪尾采血 眼眶静脉丛采血 心脏采血 断头采血 颈静 动 脉采血 腹主动 静 脉采血 耳缘剪口采血 耳静脉采血 后肢外侧小隐静脉 前肢内侧皮下头静脉采血 翼下采血等 采血时 应根据动物的种类 检验项目 方法及需采血量确定采血的部位和方法 小鼠各种采血方法的最大采血量 剪尾巴采血 0 1ml 次 可以用温水 50 浸泡几分钟或放恒温箱几分钟 使其尾巴血管充盈 剪去尾巴1 2mm 摘眼球采血 0 1 0 6ml 次心脏采血 0 5 0 6ml 次断头采血 0 8 1 0ml 次眼眶静脉丛采血 0 2 0 3ml 次 取内径为1 0 1 5mm的玻璃毛细管 临用前折断成1 1 5cm长的毛细管段 浸入1 肝素溶液中 干燥后用 大鼠 豚鼠 兔均可采用此法 48 49 50 51 52 表常用动物的最大安全采血量动物种类最大安全采血量 ml 最小致死采血量 ml 小鼠0 10 3大鼠12豚鼠510家兔1040狗50300猴1560 四 大鼠的采血眼眶后静脉丛 窦 取血 器材 毛细管 玻璃或塑料均可 1 肝素溶液 干燥皿 乙醚 试管 干棉球 方法步骤 1 先将毛细管浸泡在1 肝素溶液中数分钟 然后取出干燥备用 2 将大鼠进行麻醉 使大鼠保持侧卧位 3 左手拇指 食指抓住两鼠耳之间的颈部头皮 并轻轻向下压迫颈部两侧 致大鼠静脉血回流障碍 眼球外突 眶后静脉丛充血 4 右手持毛细管由大鼠的内毗部插入结膜 使毛细管与眶壁平行地向喉头方向推进 深度约3 5mm 5 轻轻旋动毛细管 使其穿破静脉丛 让血流顺毛细管流出 采血量 0 4 0 6ml 次 56 二 尿液采集 一 代谢笼采集代谢笼的特点是能将动物排泄的大小便分开 达到采集尿液的目的 此法常用于大鼠 小鼠 豚鼠 兔等中小型动物的尿液采集 二 导尿法采集在动物的尿道或输尿管内插一根塑料导管采集尿液 此法适用于兔 犬 猫等 二 尿液的采集实验动物的尿液常用代谢笼采集 也可通过其他装置来采集 一 用代谢笼采集尿液代谢笼用于收集实验动物自然排出的尿液 是一种特别设计的为采集实验动物各种排泄物的密封式饲养笼 有的代谢笼除可收集尿液外 又可收集粪便和动物呼出的CO2 一般简单的代谢笼主要用来收集尿液 防在代谢笼内饲养的实验动物 可通过其特殊装置收集尿液 二 导尿法收集尿液施行导尿术 较适宜于犬 猴等大动物 一般不需要麻醉 导尿时将实验动物仰卧固定 用甘油润滑导尿管 对雄性动物 操作员用一只手握住阴茎 另一只手将阴茎包皮向下 暴露龟头 使尿道口张开 将导尿管缓慢插入 导尿管推进到尿道膜部时有抵抗感 此时注意动作轻柔 继续向膀胱推进导尿管 即有尿液流出 雌性动物尿道外口在阴道前庭 导尿时于阴道前庭腹侧将导尿管插入阴道外口 其后操作同雄性动物导尿术 用导尿法导尿可采集到没有污染的尿液 如果严格执行无菌操作 可收集到无菌尿液 1 尿液收集前一定要禁食 不然对结果的影响很大 2 尿液收集期间需检查各收集器皿是否有漏 防止损失 三 输尿管插管采集尿液一般用于要求精确计量单位时间内实验动物排尿量的实验 剖腹后 将膀胱牵拉至腹腔外 暴露膀胱底两侧的输尿管 在两侧输尿管近膀胱处用线分别结扎 于输尿管结扎处上方剪一小口 向肾脏方向分别插入充满生理盐水的插管 用线结扎固定插管 即可见尿液从插管滴出 可以收集 采尿过程中要用38 热生理盐水纱布遮盖切口及膀胱 四 压迫膀胱采集尿液实验人员用手在实验动物下腹部加压 手法既轻柔又有力 当增加的压力使实验动物膀胱括约肌松弛时 尿液会自动流出 即行收集 五 穿刺膀胱采集尿液实验动物麻醉固定后 剪去下腹部耻骨联合之上 腹正中线两侧的被毛 消毒后用注射针头接注射器穿刺 取钝角进针 针头穿过皮肤后稍微改变角度 以避免穿刺后漏尿 然后刺向膀胱方向 边缓慢进针边回抽 直到抽到尿液为止 六 剖腹采集尿液按上述穿刺膀胱采集尿液法做术前准备 其皮肤准备范围应更大 剖腹暴露膀胱 直视下穿刺膀胱抽取尿液 也可于穿刺前用无齿镊夹住部分膀胱壁 从镊子下方的膀胱壁进针抽尿 七 提鼠采集尿液 即反射排尿法 鼠类被人抓住尾巴提起即出现排尿反射 以小鼠的这种反射最明显 可以利用这一反射收集尿液 当鼠类被提起尾巴排尿后 尿滴挂在尿道外口附近的被毛上 不会马上流走 操作人员应迅速用吸管或玻璃管接住尿滴 八 膀胱插管法腹部手术同输尿管插管 将膀胱翻出腹外后 用丝线结扎膀胱颈部 阻断它同尿道的通路 然后在膀胱顶部避开血管剪一小口 插入膀胱漏斗 用丝线做以荷包缝合固定 漏斗最好正对着输尿管的入口处 注意不要紧贴膀胱后壁而堵塞输尿管 下端接橡皮管插入带刻度的容器内以收集尿液 60 第五节实验动物的麻醉方法实验动物的麻醉就是用物理或化学的方法 使动物全身或局部暂时痛觉消失或迟钝 以利于实验操作 比格犬 61 一 全身麻醉 指麻醉药通过呼吸道吸入 静脉 肌肉或腹腔注射 使动物产生短时间的意识丧失 痛觉消失 肌肉松弛和反射抑制等中枢神经系统抑制现象 分为吸入麻醉和注射麻醉 1 吸入麻醉指挥发性麻醉剂经动物呼吸道吸入体内从而产生麻醉效果的方法 常见的吸入麻醉剂有乙醚 一 麻醉类型及方法实验动物的麻醉分为全身麻醉和局部麻醉两种类型 62 1 步骤与方法 1 准备容器 小型实验动物 5000ml标本瓶1个 10ml试管或离心管1个 如鼠类中型实验动物 适当大小的玻璃箱1个 试管或离心管1个如猫 兔大体形动物 麻醉口罩 如犬 63 2 操作步骤 放入挥发性麻醉剂 放入动物 密闭4 6分钟 麻醉 实验 小容器追加麻醉 64 2 吸入麻醉的注意事项 A 容器密封性 B 防止麻醉窒息和过量 C 适时追加麻醉 65 2 注射麻醉 通过注射的方法 将麻醉剂注入动物的体内 使动物进入麻醉状态的方法 常用的注射方法有静脉注射 肌肉注射和腹腔注射等 66 注射麻醉方法 腹腔注射 固定动物 头下位 腹部后1 3处靠外侧 静脉注射 固定动物 血管 注射肌肉注射 固定动物 肌肉发达 注射 67 2 注射麻醉的注意事项 A 腹腔注射时使动物的头处于低位 使内脏向上腹移动 可避免注射时伤及内脏 B 静脉注射必须缓慢 过快会引起麻醉意外 C 肌肉注射应在肌肉较发达的部位注射 有利于麻醉剂的吸收 腹腔注射 肌肉注射和静脉注射麻醉动物各有优缺点 应根据麻醉剂的特性 动物解剖特点选择方法简单 麻醉效果好的注射方法 68 常用实验动物全身麻醉药及用法和剂量 69 70 71 二 术中基本操作技术 一 术部被毛的去除在实验外科操作技术中 对已麻醉 固定就绪的动物首先要作的就是对术部被毛的去除 以免影响术部的消毒 手术操作和创口术后愈合 常用的被毛去除方法有剪毛法 剃毛法和脱毛法 第六节动物实验外科操作技术 72 常用的脱毛剂配方 配方1 硫化钠8g溶于100ml水中 配方2 硫化钠 肥皂粉 淀粉的比例为3 1 7 加水调成糊状 配方3 硫化钠10g加生石灰15g溶于100ml水中 配方4 硫化钠8g 淀粉7g 糖4g 甘油5g 硼纱1g 水75g 共100g 调成糊状 73 一 术后护理影响动物手术成败的因素很多 如动物的选择 动物的健康状况 麻醉 手术熟练程度 术后动物的护理等 其中术后护理至关重要 动物由于受到麻醉及手术的影响 使原来平衡的机体 机能状态发生一系列的变化 74 一 术后动物的特点1 体温下降 麻醉和手术都可使动物体温有不同程度的降低 麻醉时间越长 下降越明显 2 疼痛 动物苏醒够常见的问题是疼痛 动物因疼痛会出现行动异常 嘶叫 饮食异常 心率加快 循环衰竭等 75 3 食欲下降或丧失 大部分手术后的动物因疼痛而食欲下降 有的动物因手术使采食功能丧失 如口腔内手术 4 术部易感染 术后动物饲养在环境卫生恶劣的室内 极易引起术部感染 76 二 术后动物对环境的要求术后动物对的饲养环境温暖 清洁 安静 光线柔和 1 环境温暖 麻醉和手术的动物体温都有不同程度的下降 而低体温休克是动物实验后死亡的一个重要的原因 因此手术后动物饲养室温宜高些 以25 30 为佳 辅以清洁 柔软的铺垫物 也是手术后动物保温的较好办法 77 2 环境卫生 手术后动物饲养室的环境卫生应达到或超过手术前动物对环境卫生的要求标准 环境卫生差 易引起动物手术部位的感染 化脓 甚至死亡 普通动物环境要求无尘粒 无蚊蝇 对环境常消毒 经常更换动物的铺垫物 动物室的通风设备运转良好 室内氨浓度不宜过高 78 3 线柔和 无噪音 手术后动物室的光线宜暗淡些 切忌强光照明 若要观察动物可借助手电筒或局部光源 术后观察动物时 动作宜轻 严禁大声喧哗或出现尖锐的撞击声 79 三 术后动物的其它护理措施术后未苏醒的动物 1保持呼吸道的畅通 2 镇痛3 独笼饲养 80 第七节实验动物的处死方法 C57小鼠 处死实验动物应遵循动物安乐死的基本原则 安乐死是从人道主义和动物保护角度 在不影响实验结果的同时 尽快使动物无痛苦死去的方法 81 实验动物处死方法很多 常用的安乐死方法有 1 颈椎脱臼法2 空气栓塞法3 急性放血法4 断头法药物法等 82 1 颈椎脱臼法颈椎脱臼法常用于小鼠 大鼠 也用于沙鼠 豚鼠 兔 2 空气栓塞法主要用于大动物的处死 3 急性放血法常用于小鼠 大鼠 豚鼠 兔 猫 犬等 四 断头法主要适用于小鼠 大鼠等小动物 83 实验者在抓取和固定动物过程中 因方法不当造成的动物意外损伤 如 皮肤 肌肉或软组织拉伤 关节脱臼 骨折 死亡等意外 二 动物抓取与固定意外 84 发生与对策 1 皮肤 肌肉或软组织以外拉伤 对策 在抓取动物时 方法得当 态度温和 动作轻柔 避免引起动物的不安 惊恐 疼痛和损伤 2 牙齿 口腔黏膜 舌的意外损伤 对策 固定性情凶悍的实验犬时 最好采用麻醉吹管 先麻醉 再固定 85 3 关节脱臼 骨折 对策 对大中型 且性情凶悍的动物 可采用先麻醉 再固定的方法 固定紧松适度 太紧易造成关节脱臼 骨折 太松则固定不牢 4 动物死亡 对策 抓取和固定小动物时 做到方法正确 胆大 心细 保持动物呼吸通畅 固定对大动物时 确保固定牢固 避免坠落 86 1 过敏 对策 对小动物 易获得 经济价值底的动物 实验初期的动物出现过敏反应时 一般无抢救价值 对大动物 稀缺动