硕士对疣荔枝螺细胞色素P450酶系及其基因CYP的研究毕业论文.doc

目 录目录1中文摘要4英文摘要5缩略语71 前言81.1 环境激素及有机锡81.2 性畸变机制的相关研究101.3 细胞色素P450酶系简介121.3.1 细胞色素P450酶系的基本特征121.3.2 对细胞色素P450的几点认识121.3.3 分类与命名121.4 CYP19、CYP4131.4.1 激素合成与CYP19131.4.2 CYP4141.5 细胞色素P450基因CYP的克隆策略151.6 本论文的研究内容和研究意义162 主要仪器与试剂182.1 主要仪器182.2 主要试剂183 实验材料194 实验方法194.1 雌、雄及性畸变疣荔枝螺 P450酶系生化水平上的研究194.1.1 微粒体酶源的制备194.1.2 蛋白质含量测定194.1.3 细胞色素P450含量测定204.1.4 细胞色素b5含量测定204.1.5 NADPH细胞色素P450还原酶活性测定204.1.6 SDSPAGE204.2 对雌疣荔枝螺细胞色素P450基因CYP的探索研究214.2.1 疣荔枝螺基因组DNA的提取214.2.2 疣荔枝螺RNA的提取214.2.3 对疣荔枝螺CYP19基因的探究224.2.3.1 简并引物的设计与合成224.2.3.2 简并引物PCR反应条件的摸索254.2.3.3 RTPCR264.2.3.4 目的条带回收及二次PCR264.2.3.5 二次PCR产物的克隆264.2.4 对疣荔枝螺CYP4基因的探索284.2.4.1 简并引物的设计与合成284.2.4.2 RTPCR反应的程序步骤284.2.5测序结果分析285 结果与分析295.1 细胞色素P450酶系生化水平的分析295.1.1 细胞色素P450的吸收光谱295.1.2 细胞色素b5的吸收光谱295.1.3 雌、雄和性畸变疣荔枝螺P450酶系三种组分的比较295.1.4 雌、雄和性畸变疣荔枝螺内脏团微粒体蛋白SDSPAGE电泳结果305.2 疣荔枝螺细胞色素P450分子水平的探索研究305.2.1 疣荔枝螺基因组DNA的提取结果305.2.2 疣荔枝螺RNA的提取结果305.2.3 引物1、引物2研究的结果315.2.3.1 PCR结 315.2.3.2 RTPCR结果315.2.3.3 克隆和酶切分析325.2.3.4 测序结果与序列比较335.2.3.5 BLAST序列分析335.2.5 引物3、引物4对疣荔枝螺的研究结果345.2.5.1 雌螺腹足RTPCR的结果365.2.5.2 克隆、酶切分析及测序365.2.5.3 雌螺内脏团RTPCR及测序的结果375.2.6 由引物3、引物4所得序列之分析376 讨论406.1 疣荔枝螺生化水平的分析406.1.1 微粒体细胞色素P450酶系及其防护性生化反应406.1.2 微粒体细胞色素P450酶系在性激素合成和转化过程的功能以及性畸变现象406.1.3 对细胞色素P450吸收光谱的分析416.1.4 对疣荔枝螺细胞色素P450酶系测定结果的分析416.2疣荔枝螺分子水平的分析416.2.1 简并PCR与简并引物设计416.2.2 相关结果讨论427 小结45参考文献46附49致谢50摘 要大量事实证明，有机锡污染是导致海洋腹足类动物发生性畸变的主要原因，但有机锡致性畸变的机制尚未完全清楚。多数人认为，有机锡抑制了正常螺体内细胞色素P450芳香化酶的活性而导致性畸变现象产生。结合细胞色素P450酶系在生物体内所起的重要作用，本文决定以此为切入点，以分布最广、性畸变现象最普遍、特征最明显的疣荔枝螺为研究对象，对其细胞色素P450酶系进行生化水平的部分研究，同时也深入到分子水平进行探索，以期在更深的层次对性畸变现象做出阐释。首先，本实验从雄性、雌性和性畸变疣荔枝螺内脏团制备得到微粒体酶液，对细胞色素P450酶系三个主要成分：细胞色素P450、细胞色素b5、NADPH细胞色素 P450还原酶进行测定，结果发现性畸变螺的细胞色素b5含量与雌、雄螺存在显著差异，通过比较还发现性畸变螺的细胞色素P450含量、NADPH细胞色素 P450还原酶活性与雄螺更接近。说明性畸变螺不但在表型与雄螺相象，而且体内P450酶系的部分成分也更接近于雄螺。其次，通过生物软件分析出CYP19的氨基酸保守序列，自行设计简并引物，分别以雌疣荔枝螺总RNA和基因组DNA为模板，进行简并RTPCR及简并PCR，将所得产物进行克隆、测序，结合生物信息学中BLAST序列比对，对结果进行分析。结果显示RNA及基因组DNA均含有一长约746bp的未曾报道过的序列，它与Genbank现已公布的细胞色素P450相关性较小，而与部分海洋鱼类反转录酶相关性较大，且与斑马鱼DNA序列相似。另外，还根据昆虫CYP4家族的特异性氨基酸序列及P450超家族的共同特征序列，采用另一对简并引物，同样进行有关研究，结果显示：疣荔枝螺不同组织的RNA中都含有一长468bp左右的序列，这同样是一段新序列，与部分物种的CYP4存在一定的相关性，可能在螺体内起一定重要的作用，但具体功能有待进一步研究。展望通过相应的分子生物学技术，如在此基础上用cDNA末端快速扩增法（RACE）获得其全长cDNA序列，再进行表达实验等，可以对其功能进行深入研究。细胞色素P450酶系是一种普遍存在于动、植物中的代谢酶系，催化多种反应，在生物体内的生理生化功能中发挥着重要作用。本文在生化水平对疣荔枝螺细胞色素P450酶系进行研究，所得结果能为从细胞色素P450角度解释疣荔枝螺性畸变现象提供基础。同时也从疣荔枝螺RNA及基因组DNA得到有关的基因序列，为进一步探讨该基因在螺体内的作用打下基础，也为海洋软体动物的分子生物学研究提供参考。关键词：疣荔枝螺；性畸变；细胞色素P450酶系；简并PCR；有机锡AbstractA large number of studies have demonstrated that imposex in marine gastropods is induced mostly by organotin pollutants. But the mechanism of imposex has not been identified. It has been accepted that the inhibition of cytochrome P450 aromatase by organotin compounds will result in the imposex phenomena. In this thesis, Marine gastropod, Thais clavigera, was chosen as the experimental material, because they are widespread，sensitive to organotin and have high imposex frequency. Considering P450 enzymes catalyze many reactions that are important in organism, cytochrome P450 enzymes and its genes in T. clavigera were studied. The results may contribute to further explain the imposex phenomena.Firstly, microsomes were respectively prepared from the visceral masses of male, female and imposex samples of T. clavigeras. The main components including cytochrome P450, cytochrome b5 and NADPH-cytochrome P450 reductase in microsome cytochrome P450 enzymes were determined by spectrophotometry. The results indicated that the content of cytochrome b5 in male and female was twice as that in imposex T. clavigeras，and the differences among them were significantly. Compared among the male, normal female and imposexed female snails, the content of cytochrome P450 and the activity of NADPH-cytochrome P450 reductase in imposex snails were more close to that in males. The result hinted that imposex snails were similar to males not only in morphology but also in some biochemical properties.Secondly, CYP genes were studied. CYP19 conserved regions were derived by aligning amino acid sequences by Clustal X. Degenerate primers were designed with Primer Premier 5. Genomic DNA and total RNA were isolated from T. clavigeras. The corresponding sequences were amplified by degenerate PCR and degenerate RT-PCR. Then the amplified fragments were ligated into pUCm-T vector and cloned. Their nucleotide sequences were determined. The result showed that a same fragment of 746bp was amplified from genomic DNA and total RNA. The BLAST programs were used for searching protein and DNA databases for sequence similarities. The BLAST result showed that it was a new sequence and similar to zebra fish DNA sequence and some fish reverse transcriptase. But it has small homology of CYP19 gene sequences that have been in Genbank.In addition, sequences were amplified by RT-PCR with using degenerate primers that were designed against CYP4 sequences. However, the result of sequence analysis revealed that there was a 468bp fragment that existed in pleopod and viscera of T. clavigeras. It is a new sequence and its function is unknown. But it shows some sequence homology with the corresponding regions of insect CYP4. Its potential function needs further studies, such as RACE, blotting, gene expression to demonstrate. It is well-known that cytochrome P450 enzymes can be found in many types of tissues and organisms. They are very important to organisms. They play an essential role in drug metabolism, catalyze many physiological reactions such as carbon source assimilation, biosynthesis of hormones, and so on. In this paper, the experimental results of P450 enzymes were helpful to further understand the mechanism of imposex that caused by organotin compounds in T. clavigeras. And what we have studied on CYP genes could make foundation for further study on mollusks on the level of molecular biology.Key words：Thais clavigera；imposex；cytochrome P450 enzymes；degenerate PCR； organotin缩略语aa amino acid（氨基酸）Acracrylamide（丙烯酰胺）Ampampicillin（氨苄青霉素）BisN, N-methylenebisacrylamide（N, N-甲叉双丙烯酰胺）bp base pair（碱基对）BSAbovine serum albumin（牛血清白蛋白）CO carbonic oxide（一氧化碳）CYP cytochrome P450（细胞色素P450）DEPCdiethyl pyrocarbonate（焦碳酸二乙酯）DTT1,4dithiothreitol（1,4二硫苏糖醇）EBethidium bromide（溴化乙锭）EDCsEndocrine Disrupting Chemicals（内分泌扰乱化学物）EDTAethylenediaminotetra-adetic acid（乙二胺四乙酸二钠）g 离心力加速度单位IPTGiso-propyl thiogalactoside（异丙基硫代半乳糖苷）Kbkilobase（千碱基） LBluria-bertani medium（LB培养基） mer 引物长度单位，相当于单碱基MOPS2-(N-morpholino) propane sulfonic acid（2-(N-吗啉代)丙磺酸）ODoptical density（光密度）PAGEpolyacrylamide gel electrophoresis（聚丙烯酰胺凝胶电泳）PBSphosphate buffered solution（磷酸缓冲液）PCRpolymerase chain reaction（聚合酶链反应）PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride（苯甲基磺酰氟）POPs Persistent Organic Pollutants（持久有机污染物）RACErapid amplification of cDNA ends（cDNA末端快速扩增）rpmrevolutions per minute（每分钟转数）RT-PCRreverse transcription-PCR（反转录-PCR）SDSsodium dodecyl sulfate（十二烷基硫酸钠）TAE Tris乙酸缓冲液TEtris ethylenediaminotetra-adetic acid（Tris-EDTA 溶液）TEMEDN, N, N, N-tetramethylethylenediamine（N, N, N, N-四甲基乙烯二胺）X-gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-B-D-Galactopyranoside（5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷）1. 前言疣荔枝螺（Thais clavigera）属软体动物门，腹足纲，新腹足目，骨螺科，广泛分布于我国黄渤海、南海和台湾等水域1，生活在潮间带低潮区岩缝及石块下2, 是沿海居民喜食的一种软体动物，因其根部有较强辣味，民间称其为辣螺, 其贝壳可医皮肤病，肉可治胆囊炎，并具降血压功效2。自上世纪七十年代，国外不断有调查发现沿海海域腹足类出现了性畸变（Imposex）现像，近几年我国学者黄长江、施华宏等对我国沿海地区进行的大量调查研究也证实，我国多种底栖软体动物也存在性畸变现象。其中疣荔枝螺是分布最广、性畸变现象特征最明显的一种。所谓性畸变，即雌螺体内长出不应有的雄性生殖器官，包括阴茎、输精管等3。大量相关研究证明，性畸变现象与三丁基锡（Tributyltin，TBT）、三苯基锡（Tripheyltin，TPT）等有机锡类化合物污染有关314。1.1 环境激素及有机锡通常人和其他生物通过体内合成的激素（Hormones）来调节机体代谢活动和生长发育。激素是生物正常新陈代谢，繁衍不息的重要调节物质。然而，近些年来人们不断发现环境中存在于生物机体之外的、具有与人体生物激素作用类似的、能引起生物内分泌紊乱的环境激素。所谓的环境激素是人类生产活动释放到周围环境中的外源性化合物，它们干扰生物正常激素活动，干扰生物体内激素的释放、转移、代谢、结合、反应和消除等，能致使生物及其后代出现内分泌功能紊乱，因而也被称为内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs）。1997年世界野生动物基金会（WWF）报道环境激素有68种。依其功能分为干扰雌激素环境化学物、干扰睾酮环境化学物、干扰甲状腺素环境化学物等。依其来源分为人工合成激素（如雌三醇、雌酮、己烯雌酚、雌二醇等）、植物性激素（包括来自豆科植物及白菜、芹菜等的植物性激素）、真菌性激素和环境中激素样物质。依其化学结构分为多氯联苯类、邻苯二甲酸酯类、氯代烃类、芳香族碳化氢类、烷基酚类、双酚类、联苯酚类、氯酚类、金属类、硝基苯类、呋喃类和有机锡类等。这些化合物主要用于杀虫剂、杀菌剂、防污剂、表面活性剂及染料、化妆品和医药品合成原料等1518。其中部分物质难以降解而长期存留，并通过空气、水和迁徙物等长距离迁移沉积于远离其排放点的地区，严重危害人类健康和造成环境严重污染，此类物质被称为持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）。有机锡类化合物即为此类。有机锡化合物（Organotin Compounds）是至少含一个SnC共价键的金属有机化合物，被广泛应用于工农业、交通和卫生等部门。其中，三丁基锡和三苯基锡由于对多种海洋污损生物具有长期有效的杀生效果，被大量用作船体涂层添加物，以防止附着生物在船壳上附着生长。上世纪60年代三丁基锡等防污涂料被广泛使用于船坞保护业，到80年代中期，世界各地海水、底泥和生物中都相继发现了有机锡化合物的存在。TBT对水生和底栖动物，如鱼类、甲壳类、软体动物和海洋藻类有很大毒害作用，被认为是迄今人为引入海洋环境中毒性最大的物质之一。有机锡的半衰期长，在天然水体中半衰期达几个月，当结合到沉积物以后则更加稳定，半衰期可达10年以上，多数海洋生物对有机锡有很强的富集能力，大部分生物的富集因子为102104（浮游植物为51033104；贝类为1035104；鱼类为21035104）。因此，很低的TBT浓度就能引起海洋生物累积性中毒。研究证实性畸变是致多种螺类种群数量减少的元凶。性畸变即雌性螺长出阴茎和输精管等雄性器官，而其雌性器官则发育不全，输卵管卷曲堵塞，阻碍卵子释放和受精，繁殖力下降。有关调查表明，性畸变现象是由TBT等有机锡化合物引起的。目前TBT致畸现象已在世界广为报道，包括英国、美国、日本、巴西、新西兰等。到1991年已记录了63属118种前鳃亚纲动物有性畸变现象，包括疣荔枝螺（Thais clavigera）、黄口荔枝螺(Thais luteostoma)、蛎敌荔枝螺（Thais gradata）、甲虫螺（Cantharus cecillei）、花枕宝贝（Cyprea eglantina Duclos）、泥东风螺（Babylonia lutosa）、瓜螺（Cymbium melo）、红螺（Rapana bezoar）、带鹑螺（Tonna olearium）等。其中荔枝螺性畸变现象最为普遍，特征最明显。日本的22个县93个点荔枝螺的调查，发现87个点荔枝螺出现异常；在英国水域发现荔枝螺性变异和群体衰败，许多地区荔枝螺种群消失。施华宏等调查发现我国沿海多个港口腹足类都存在严重的性畸变现象。笔者对汕头北山湾采样调查，发现该点荔枝螺几乎百分之百出现性畸变现象。2004年Mari S. Golub和John D.通过体外实验证明，TPT能直接激活雄激素受体介导的转录（androgen receptor-mediated transcription），抑制与甾类激素代谢（steroid hormone metabolism）相关的酶。他们推断TPT在哺乳动物体内可能会是生殖毒药（reproductive toxicant），或者是人类内分泌扰乱物（endocrine disruptor）18。 有机锡污染问题已引起多个组织和国家的广泛关注，多个西方国家已制定了相应的措施限制有机锡生产和使用。应海洋环境保护委员会的要求，国际海事组织颁布了防污漆中使用有机锡的最终期限，在防污涂料中使用有机锡的最终期限为2003年1月1日，在船体上含有有机锡防污漆的最终期限为2008年1月1日等。然而在亚洲，尤其是发展中国家，有机锡污染形势依然严峻，其中我国情况更令人担忧。我国在有机锡污染对环境和生物影响方面的研究才刚刚起步，仅限于有机锡污染调查等工作。1.2性畸变机制的相关研究虽然现已有多方面证据证明性畸变现象与TBT等有机锡化合物污染密切相关，但对于其致性畸变的机制尚未完全清楚，目前主要有以下几种观点：（一）TBT抑制神经内分泌因子的释放软体动物神经系统兼有内分泌功能，脑神经节可以释放某些因子，它们直接或间接控制动物体内类固醇激素的产生和代谢活动。正常情况下雌体内神经内分泌因子能控制雌激素产生，使雌性动物只发育雌性生殖器官，抑制雄性器官的产生。当TBT在螺类脑神经节中大量积累后，就会扰乱神经内分泌的正常活动，抑制这种神经内分泌因子的释放，导致雌性软体动物出现性畸变。Feral.C等人的实验结果在一定程度上支持这个假说。（二） TBT抑制睾丸甾酮硫络合物的形成Ronis等根据对荔枝螺Littorina Littorea离体及活体实验提出此假说。他们用不同浓度TBT处理微粒体，发现即使TBT浓度增加到100M，细胞色素P450芳香化酶活性也只抑制了3040，测定活体螺内依赖于细胞色素P450的14C睾丸甾酮的代谢发现，即使TBT浓度达5mM，15，42h后睾丸甾酮也几乎被完全代谢。他们推断，性畸变是TBT抑制睾丸甾酮与硫的结合，造成I相代谢物和排泄物的积累，进而激活了组织中的雄性激素所造成的。（三） TBT抑制细胞色素P450芳香化酶脊椎动物体内性激素的合成和转化，先由胆固醇（Cholesterol）经一系列步骤转变为雄烯二酮（Androstenedione）或睾丸激素(Testosterone，也称睾丸甾酮)，后者再被转化成雌激素酮（Estrone）或雌二醇（Estradiol），这一过程由细胞色素P450芳香化酶（Cytochrome P450 aromatase）催化，因此它被认为是脊椎动物体内雌激素生物合成的最后一步限速酶。雌激素和雄激素的化学结构非常相近，其生物合成途径也相似，雌、雄性体内均存在此两类激素，仅两者比例不同。因此其生物合成过程中任何一步发生差错都将导致体内激素水平的升高或降低，进而使生物生理特征发生改变。目前对无脊椎动物激素系统的了解很少，但已知某些软体动物含有与脊椎动物同样的类固醇激素，其形成途径也与脊椎动物相似。因此令人联想到TBT是否通过抑制固醇类激素合成过程中酶的作用，而使雄烯二酮或睾丸甾酮不能转化成雌激素酮或雌二醇，使雄性激素在体内大量积累，最终导致软体动物性畸变和雌雄间性现象。图1-1 激素合成简图Fig.1-1 Brief scheme of biosynthesis of hormones鱼类实验发现，经非类固醇芳香化酶抑制剂处理的雌性幼鱼能发育成具有雄性特征的鱼，因而得到启示：当无芳香化酶抑制剂时，雄激素可被芳香化酶催化转化为雌激素，雌激素抑制雄性特征产生。软体动物类固醇作用机理和鱼类的相似，因而认为软体动物芳香化酶被抑制后也会产生类似鱼类那样的性别转化现象。Spooner等提出了TBT抑制芳香化酶而致腹足类动物性畸变的假设。他们将正常成年雌性螺狗岩螺置于含TBT液体中养42d，结果雌螺长出了阴茎，定期检测发现螺体内孕酮和17-雌二醇水平无显著变化，而睾酮浓度却在28d后显著提高。一般睾酮与孕酮水平是互相制约的，孕酮水平没有变化，那么睾酮水平发生的变化不可能是甾体生物合成中的一般规律所能解释的。他们认为TBT的作用使芳香化酶催化睾酮转化17-雌二醇的过程受阻，睾酮积累引起雄性化现象。为了证实提高睾酮含量会导致性畸变的推测，Spooner分别将不同剂量的睾酮注入成年雌性螺狗岩螺体内，然后在无污染的海水中暂养42d，结果注入0.01、0.1和10g睾酮的螺都发生了性畸变，其中注入剂量较高的两组雌螺的阴茎长度显著增加。以后Spooner等的工作被德国研究人员进一步证实。其中Bettin等将两种雌性螺(Nucella lapillus和Nucella reticulatus)置于12244ng/L TBT环境下养56个月，2个月内被处理的两种动物都产生了性畸变现象，睾酮水平也显著提高；他们还发现种不同螺性畸变程度有微弱差别，分析是由于动物体内雄激素受体量有所不同，对TBT的反应有所差别。这一推测解释了为什么生活于同样TBT污染环境下，有些种类软体动物会出现性畸变而有些种类则没有。虽然对性畸变现象机理的解释还没有完全定论，但多数人可以接受的解释为：正常个体中，较高含量的三丁基锡或许能竞争性地抑制细胞色素P450芳香化酶的活性，由此阻止了雄烯二酮或睾丸甾酮向雌激素酮或雌二醇的转化，结果前者的量累积、升高，导致体内激素水平失去平衡，诱发生理病变，到达一定程度便表现为性畸变现象。1.3细胞色素P450酶系简介细胞色素是一类以铁卟啉为辅基的结合蛋白质，通过分子中铁化学价的变化，在细胞的氧化还原反应中传递电子。迄今已发现的细胞色素有十多种，依其光谱特征（即还原型细胞色素的吸收率）分为a、b、c三族。细胞色素P450酶系又称细胞色素P450芳香化酶（Cytochrome P450 aromatase）、加单氧酶（monooxygenase）、多功能氧化酶（Mixed Function Oxygenase，MFO）等，是一古老的基因超家族产物。它广泛存在于不同生物体内各种组织和细胞内，是属于E.C. 1.14.14.1的一种末端氧化酶，并执行多种生理功能，如在碳同化、激素合成、外源物质降解、前致癌物的活化等。近年来该领域已成为国际学术界研究的热点之一。1.3.1细胞色素P450酶系的基本特征细胞色素P450酶系实际上是一类具有不同分子量、不同生化和免疫学特征以及不同催化能力的血红素蛋白的总称，它们所主导的生物转化过程是一个复杂的连锁酶促反应过程，催化的典型反应是通过电子传递系统将分子氧还原，并将其中的一个氧原子加到底物中，反应需要NADPH：RH+O2+NADPH+H+ROH+H2O+NADP+。细胞色素P450酶系由多种组分组成，包括：两种细胞色素（细胞色素P450、细胞色素b5）、两种黄素蛋白（NADPH细胞色素 P450还原酶和NADH细胞色素b5还原酶）以及磷脂等29。细胞色素P450是50年代中期Williams等发现、60年代初Omura等验证的一类b族细胞色素，由于还原型细胞色素的血红素铁接受电子被还原后能与CO结合，其产物在光谱450nm处具最高吸收峰，被命名为细胞色素 P450。它是细胞色素P450酶系主要组分，为滑面内质网膜上的结合蛋白。细胞色素P450都具有一非共价结合的血红素和环绕半胱氨酸的26个氨基残基保守序列，半胱氨酸提供血红素铁的第五个配体（ligand）。它主要分布于动物肝、肺、肾、鳃、皮肤、消化道、肾上腺皮质和髓质、生殖器官等组织。1.3.2对细胞色素P450的几点认识细胞色素P450基因是个古老基因超家族，它们源于35亿年前的同一祖先；古P450与生物在无氧条件下获得能量有关，以过氧化酶方式保护细胞免遭活性氧作用；P450早期功能为同化环境中化合物，以抵御其对机体的伤害；部分高等生物已不具备此功能；P450家族中成员都具有甾醇代谢功能；P450具有代谢内源物质和外来物两大功能2932。1.3.3分类与命名细胞色素P450酶命名以英文缩写CYP表示，后面跟有数字、字母、数字，分别代表家族、亚家族和同工酶。斜体表示P450基因或cDNA，正体代表基因产物mRNA或蛋白质。P450酶系分子量约为4060kDa，至少15%氨基酸序列相同。根据P450氨基酸序列的相似性将P450归于不同的家族或亚家族，同一基因家族成员蛋白质序列大于40的氨基酸残基是相同的，而把相同氨基酸数大于55的细胞色素P450归为同一亚家族。1985年成立了国际细胞色素P450基因命名委员会，对克隆基因进行规范化命名。用大写CYP表示细胞色素P450基因，下设不同的家族（Family），用1、2、3表示，家族下设亚家族（Subfamily），用英文字母A、B表示，亚家族由多个基因成员组成用1、2、3、4表示，有的基因有几个等位基因，用小写v表示，等位基因间在v后加阿拉伯数字加以区分，整个名称的表示如CYP6B4v1。到目前为止，已克隆了504个P450基因，分属70个家族，127个亚家族，其中哺乳动物分属14个家族，6个亚家族，无脊椎动物属10个家族，低等真核生物11个家族（CYP51-CYP62），细菌19个家族，30个亚家族，植物属CYP71-CYP90。1.4CYP19、CYP4细胞色素P450超家族的研究主要包括人类、鼠类、昆虫等。人类的大部分家族及功能都已研究（表1-1）。海洋生物中鱼类的研究较多，有CYP1、CYP2、CYP3、CYP4等，海洋无脊椎动物CYP家族则研究得较少，主要有CYP4家族，甲壳类的CYP2、CYP45，软体动物的CYP30、CYP10等3436。国内细胞色素P450酶系的研究多数集中在人和鼠类，也有对昆虫P450酶系某些家族的研究，但并未见有海洋无脊椎动物P450基因研究的报道。表1-1 人类CYP家族及其主要功能Table1-1 Human CYP families and their main functions. 37CYP familyMain functionsCYP1CYP2CYP3CYP4CYP5CYP7CYP8CYP11CYP17CYP19CYP21CYP24CYP26CYP27CYP39CYP46CYP51Xenobiotic metabolismXenobiotic metabolism Arachidonic acid metabolismXenobiotic and steroid metabolismFatty acid hydroxylationThromboxane synthesisCholesterol 7-hydroxylationProstacyclin synthesisCholesterol side-chain cleavage Steroid 11 -hydroxylation Aldosterone synthesisSteroid 17-hydroxylationAndrogen aromatizationSteroid 21-hydroxylationSteroid 24-hydroxylationRetinoic acid hydroxylationSteroid 27-hydroxylationUnknownCholesterol 24-hydroxylationSterol biosynthesisXenobiotic为异生物质，指环境污染的外来化学制剂，如农药（杀虫剂、除草剂）、多环芳烃、多氯联苯、卤代烃、卤代芳烃和合成染料等38、39。1.4.1激素合成与CYP19雄激素是胆固醇合成雌激素的中间产物，芳香化酶是体内合成雌激素过程的重要酶系，是雄激素转变成雌激素的限速酶。其中包括细胞色素P450超家族中的CYP19，由CYP19基因编码，其复合物可氧化脱去雄激素的19甲基，使雄激素变成雌激素，其活性高低决定体内雌激素水平。人类CYP19与乳腺癌等疾病的产生有关。人为造成编码芳香化酶CYP19基因突变或缺失的实验动物，出现芳香化酶缺失或功能改变，不能产生雌激素，称为ArKO模型。此模型老鼠有生理或病理特征，如生殖能力下降和肥胖症等4042。鳄鱼性别不是由遗传机制决定的，是由其卵孵化温度决定。Willow N .G. 研究美洲鳄鱼（Alligator mississippiensis）雌胚和雄胚时发现两者CYP19基因的表达在晶胚热敏感期(TSP)前无显著差异，但CYP19基因的表达及雌激素的产生在TSP后的卵巢的分化上起重要作用43。Tzchori对欧洲鳗（Anguilla anguilla）性别决定的研究发现，芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor，AI）既能减少幼鱼体内雌二醇合成，还使CYP19基因的表达水平降低44。硬骨鱼性别表型可以通过改变晶胚孵育的温度、幼鱼饲养的温度及性激素水平等方法而发生变化。遗传上为雌性（XX）的日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）幼鱼在18水温饲养30100天，成鱼将是雌性；而在27下饲养后，成鱼将是雄性。T. Kitano等对此比目鱼（XX）的P450芳香化酶基因CYP19的cDNA进行研究，并对其进行半定量分析，发现饲养50天后（还未产生性别分化时）雌雄两组间该基因mRNA水平并无差异；然而，饲养60天后（开始出现性别差异时），雌鱼组该基因mRNA水平迅速增加，雄鱼组轻微减少；同时，雌鱼组17雌二醇含量显著增加，而雄鱼组则保持不变45。此外，CYP19也会影响雌雄鱼类的繁殖能力和性行为。鉴于以上事实及本课题的研究对象疣荔枝螺存在性畸变现象，我们希望在此方面进行探索性研究，寻找疣荔枝螺体内是否存在CYP19基因，以期探讨性畸变现象的分子机制。1.4.2 CYP4CYP4为P450基因家族中的重要成员，在脊椎动物中参与脂肪酸的-羟基化、脂肪酸衍生物的氧化和前列腺素代谢等，这些物质均参与相关性激素代谢。已发现昆虫（如果蝇、蚊子、棉花虫等）CYP4对杀虫剂等化学药品有抵抗作用。有研究认为蟑螂体内的CYP4C与保幼激素（juvenile hormone，JH）生物合成有关。1998年，Mark J. Snyder首次报道，海洋无脊椎动物中存在有CYP4家族。Snyder对种海洋无脊椎动物消化组织的研究，发现小虾（Penaeus setiferus）有CYP4C16，鲍鱼（Haliotis rufescens）有CYP4C17，龙虾（Homarus americanus）有CYP4C18，海胆（Lytechinus anamesis）有CYP4C19、CYP4C20，贻贝（Mytilus galloprovincialis）有CYP4Y1。他还发现贻贝CYP4Y1基因表达因萘黄酮（-naphthoflavone）浓度升高而被抑制，进而会影响体内的其它代谢。他提出海洋软体动物CYP4的表达会因化学药品而改变，而螺体内睾丸激素代谢也因TBT浓度的增加而改变，两者间存在一定联系。另外，体内CYP4 mRNA水平及P450酶活性降低程度可作为软体动物受异生物质（xenobiotic）影响大小的生物标记物（biomarkers，即能反映生物系统和潜在危害之间的联系）。综上所述，已经证明了部分海洋软体动物含有CYP4，为此，我们希望对性畸变指示生物疣荔枝螺进行这方面的探索研究，为搞清性畸变分子机制奠定理论基础。1.5细胞色素P450基因CYP的克隆策略P450基因可以通过有目的、有针对性地采取适当的策略克隆出来46、47：从研究对象中分离和纯化特定目的P450蛋白，以此为抗原制备单克隆或多克隆抗体，用于筛选