蔗糖变位酶及其应用.doc

蔗糖变位酶及其应用臧向莹 贺鹰抟广东省微生物研究所广州510070摘 要：本文详述了蔗糖变位酶(Surosemutase)的性质、研究历史、现状以及应用蔗糖变位酶改变蔗 糖分子结构所形成的一种与蔗糖物理、化学和生理代谢性质完全不同的新糖帕拉金糖的性质、生理 代谢功能与应用。刚 青蔗糖变位酶(Sucrosemutase)又称“一葡糖基转移酶(n-glucosyltransferase)，这种酶能将蔗糖分 子结构由葡萄糖与果糖a-1，2糖苷键相连变位为a-I，6糖苷键相连。形成一种与蔗糖物理、化学性质和 生理代谢完全不同的新糖。这种糖被命名为帕拉金糖(Palatinose)，学名为异麦芽酮糖(Isomaltulose)， 因这种糖有一些新的生理功能而引起人们对这种酶的关注和研究。1蔗糖变位酶的性质因帕拉金糖的特殊功能，随之引发人们寻找转化蔗糖为帕拉金糖的酶及产酶的微生物，1957年，德国 的Weidenhagen和Lorenz首先发现红色精朊杆菌【Protaminobacter rubrum)产生的酶可转化蔗糖为帕拉 金糖。此酶即蔗糖变位酶(Sucrose mutase)，但有的学者称之为*葡糖基转移酶(a-glucosyitransferase)。 本文使用蔗糖变位酶名称，其理由为：即上述12腔中致龋齿菌变形链球菌(smutans)产生一种胞外酶，该 酶也是a一葡糖基转移酶(ct-glucosyltransferase简称为GTase)，该酶也作用于蔗糖，却形成一种致龋齿的、 水不溶性葡聚糖，因而极易与作用于蔗糖形成帕拉金糖的a葡糖基转移酶(ct-glucosyltransferase)混淆， 为了区别这两种不同产物的酶，此外更明确酶的性质，故本文沿用有些文献中使用的蔗糖变位酶名称陋l81。11蔗糖变位酶是诱导酶 蔗糖变位酶须于底物中存有蔗糖时方可诱导产生，故在筛选、诱变或发酵制酶时，其培养基中均添加CN比例较高的蔗糖作为碳源，作为细胞生长增殖的碳源和诱导酶产生的诱导剂。12蔗糖变位酶是胞内酶蔗糖变位酶存在于细胞周质中(Periplasmic space)，为了获取大量酶制剂，必须进行发酵增殖，收集多 量含酶的菌体细胞，离心分离弃去发酵液，收集含酶的活细胞【l9硎。葡萄糖皋糖CH|oH蔗糖变位酶蔗簟(c1，211台帕拉垒糖(c-I6结合)70!：里堕型型兰兰童生旦垫查奎堕垄全丝查叁然图1蔗糖变位酶作用于蔗糖转化为帕拉金糖13蔗糖变位酶专一性高 蔗糖变位酶专一性高，是作用于蔗糖特有的变位酶，该酶仅作用蔗糖分子结构中的果糖，不作用游离的果糖或与其他分子相结合的果糖。经变位酶的催化使nI，2糖苷键相连的蔗糖转化为d1,6糖苷键相连的帕拉金糖，学名为异麦芽酮糖(Isomaltulose)即6-0*D吡喃葡糖基一D一呋喃果糖5(6-0一aglucopyranosylDfmctofuranose)，其反应式为I“116】：14蔗糖变位酶催化效率高股转移酶是催化不同物质分子间某种基团如糖基、甲基等的交换或转移，有供体与受体参与反应 有时酶催化反应是可逆的。然而，蔗糖变位酶催化蔗糖转化为帕拉金糖反应是不可逆的，因供体与受体同 为一个双糖，仅催化改变了葡萄糖与果糖的碳键连结位置，即1，2改为1，6糖苷键，使帕拉金糖成为蔗糖 的同分异构体。这种催化效率很高，底物蔗糖溶液浓度可高达45-75(ww)，其转化率可高达99， 儿乎底物完全转化成产品，仅有J左右副产物，其中主要为10*D葡糖基-D-果糖fd1，1 linked disaccharide即Trehalulose)，转化液经浓缩结晶后可得到很纯的产物帕拉金糖结晶【“】。15蔗糖变位酶稳定性高在海藻酸钙中固定化非生长型活细胞内的变位酶，其稳定性较高，Peter等报道用海藻酸钙固定化非 生长型的人黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici NCPPBl587)菌种，在其适宜条件30 4C下操作，半衰期 (Half-life)可长达8500小时，即达354天时间，若温度变为50C时，半衰期仅有363小时，稳定性降低了95。然而，也不是所有的E rhapontici菌株产生的酶都稳定，例如：E rhapontiei ATCC 29284菌种就不稳定， 仅有625小时，也有些欧文氏菌(Erwinia sp)根本不具催化产生帕拉金糖的能力。因此酶的稳定性与 产酶菌种，旧定化方法及操作条件等因素均有密切关系f“”、1”。16蔗糖变位酶的作用机理Meallister M对普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica)所产的蔗糖变位酶研究结果认为：该酶最 适pH为60，最适温度为30(2，在最适温度下酶活可保持2天不变1澳8定酶分子量为79000道尔顿，等电点 为90，对蔗糖的动力学常数为653m u。Fujii Seloshi报道曾对红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum) 产生的蔗糖变位酶研究指出：该酶为葡萄糖苷酶，作用机理是先水解，将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，此酶也 具有葡糖基转移酶作用，将葡萄糖转移到果糖和山梨糖上，当将葡萄糖基转移到果糖第6碳键上时，则形成ft一1，6糖菅键的帕拉金糖；当将葡萄糖基转移到果糖第1碳键时则形成a1，1糖苷键相连的1-0mD葡糖基-D-果糖(Trehalulose)，二者之间的比约为0 12Il“”1。2产生蔗糖变位酶的菌种任何一种生物催化剂酶的工业化生产重要条件是选育优良产酶菌种。优良的产酶菌种应具备酶活 高、专一性强、稳定性好、副产物少、培养简便并具安全感，现已报道过有蔗糖变位酶的微生物菌种很 多，见表1。表11975年后帕拉金糖生产所用微生物菌种71Protaminobacter rubrum 固定化酶 1981 德国 接里啜inia rhapontici 固定化细胞 】982 英国 Protamino2。礴mbrum固定化细胞 1981 德国Serratia pj渝i饷ca固定化细胞 1983日本Protaminobacter rubrum固定化细胞 】983德国Protaminobacter rubrum 固定化细胞 1984日本Protaminobacter rubrum 固定化酶 1985 德国Promminobacter rubrum 固定化酶 1986日本Protaminobacter rubrum 固定化细胞 1988日本Serratia plymuthica固定化细胞 1989中国Protaminobacter rubrum固定化细胞 1990 中国由表1可知：德、英、日、中等四国在不同时期内用不同方法生产帕拉金糖，所使用的微生物菌种也 不相同。德国Weidenhagen等最先发现的红色精朊杆菌具有蔗糖变位酶，继之英国发现普利茅斯沙雷氏 菌(Serratia plymuthica)的酶N!lN，以后又发现大黄欧文氏菌(Erwinia rhapomici)等。1984年Peter sJCheetham等人报道了产生帕拉金糖的有关微生物操作性能，见表2。表2有关微生物固化细胞的操作性能初始酶活性 半衰期 转化率8菌种(g产物恒湿细胞h) (tl2，h)Erwiniarhapontici NCPPBl57804411507 52Erwiniarhapontici NCPPBl39O39】877 54Erwiniarhapontiei NCPPBl7390351840 52Erwiniarhapontici ATCC29284062 162547Serritia marcescensNCIB8285 0648121 51Serratia plymuthicaATCCl5928 O 61524260 4Protaminobacter rubrum CB57477 0605700 25Erwinia carotovoravaratroseptica(P304)o012975 87ErwiniacBrotovor&varatroseptica(P1975)90042 900 31+a由于稳定性和转化率是互相依存的，二者参数均为引用的b此菌种来自AFRC食品研究所，Norwich。表2显示出，大黄欧文氏菌(Erhapontici)NCPPB 1578，139，1739菌号的稳定性和转化率均较佳， 虽然都是欧文氏菌，但ATCC 29284菌号表现最差。此外，也有文献报道了使用常规诱变法育种，使其操作 性能更适合T-2E业化生产要求。目前，具有蔗糖变位酶能转化蔗糖生产帕拉金糖的微生物菌种除袁1，2 所列出之外还有植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、拉内拉菌属(Lanelu sp)等。其中认为性能 优良的产酶菌种有：大黄欧文氏菌(Erwinia rhaponticiNCPPB 1578)，还有1989年日本所使用的Klebsiella 菌属的不同菌种。认为克雷伯属菌转化帕拉金糖效果高、副产物少(葡萄糖、果糖)可简化纯化工艺，有 利于降低成本等，但也有人认为大黄欧文氏菌NCPPBl578菌种更佳。因为转化率可达99，其中副产物 仅l，此外，中国专利使用的普利茅斯沙雷氏菌ATCC 15928诱变种SG5菌，经安全性研究属无毒菌种。 总之作为工业生产的微生物生菌种，必须不断进行选育，使之更符合工业化生产酶制剂的要求，这项工作是永无止境的长期性工作I“、”】。3蔗糖变位酶的制各1952年冲自拉金糖作为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵副产物曾被提及，继之于195672型：望壁型型竺兰量生旦塾查圣鲞苎全笙圭叁壁 年和1960年进一步证实肠膜明串珠菌从蔗糖合成葡聚糖r Dextran右旋糖酐)时帕拉金糖作为副产 物而形成。1959年南德制糖公司的专利公报首次提出，应用红色精朊杆菌可转化蔗糖制得帕拉金糖结晶。 后来知道还有其他的细菌也能转化蔗糖生成帕拉金糖，英国专利说明书中提出，普利茅斯沙雷氏菌 (Se丌atia plymuthica)酶活较红色精朊杆菌更高，是更适合的菌种以后陆续发现了许多具有蔗糖变位酶的 微生物菌种，同时发表了很多酶制各工艺技术的专利【7”31菌种培养及发酵工艺 由于蔗糖变位酶存在于细胞周质上，故第一步需通过发酵，大量增殖菌体细胞，收集细胞制备固定化酶或固定化细胞。而不同的微生物菌种所用培养基及培养条件不同，所产细胞的酶活也有差别，需研究其较优的培养基及培养条件，现分别叙述如F：311大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontieiNCPPB 1578)培养基为： 蔗糖4、蛋白胨(消化酪蛋白)1，牛肉浸膏O 4。_二角烧瓶放在120转份，振荡器上振荡培养，30下培养70小时，于生长稳定期收获。312红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum CBS 57477)培养基为：蔗糖5，玉米浆2，(NH4)2HP04 O1(wv)，在29C下发酵30小时，1000毫升三角烧瓶装量200 毫升培养液，在菌体细胞达到5x109后，加入活性阳离子絮凝剂用O1M pH70的磷酸盐缓冲液冲洗，并用 离心机分离脱水收获进行固定化，再用戊二醛交联，用01M磷酸盐缓冲液洗涤后，装入控温的柱内用于 生产帕拉金糖15 22、24”I。313普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica ATCCl5928诱变菌SG5) 普利茅斯沙雷氏菌的种子培养基为：蔗糖4，蛋白胨1，牛肉膏04，pH7072，接种后于30(2振荡24小时。发酵培养基为：蔗糖4，玉米浆3、氯化钾02(均为wv)。32蔗糖变位酶的制备方法 蔗糖变位酶属胞内酶，为获得高活性酶，必须采用优化的培养基及发酵条件，促使大量增殖菌体细胞，然后收集细胞制备蔗糖变位酶。现将自1959年以来见于文献报道过的制备方法，概括为34种，现分述如F：321全混反应器连续操作工艺 该1艺为早期生产帕拉金糖的方法，实质上是将产酶微生物细胞用作酶制剂，将细胞增殖与蔗糖转化为帕拉金糖同时进行。将菌体细胞离心加入20-30的蔗糖溶液中雉持20-30,pH70条件下，不断 搅拌，通气，促使反应，反应后黼0分离除去菌体细胞，将上清液经离子交换树脂柱脱盐、浓缩、结晶等步骤 制得帕拉金糖，微生物的细胞可再使用。此法缺点是，离心分离法回收反应液中的菌体细胞困难，时间长、酶活性几乎全部丧失，而且产物易被细胞或其培养基污染，产品纯化较麻烦，故不适合工业化连续生产526 3 J36I。322固定化酶反应器工艺发酵增殖产酶菌体细胞后，用离心机分离收集细胞再进行破碎抽提酶威在细胞培养过程中F对数生长后期，添加一些物质如表面活性剂等，使细胞自溶将酶蛋白分子释放出来收集后再固定酶蛋向分子。 但一般认为，固定化酶处理过程较长酶活损失大，酶蛋白分子失去了细胞的保护作用，手续较繁琐因而目前工业化生产帕拉金糖大都较少采用固定化酶l艺【14”J。323固定化细胞工艺目前德、美、英、日、中等国基本上均使用固定化细胞艺生产帕拉金糖。固定化细胞酶的稳定性 较游离细胞高达350倍蔗糖变位酶为胞内酶，蔗糖是小分子物质扩散限制，J r蔗糖在25C时扩散系数为45x106cm2)，因而含酶细胞被包埋固定化后，蔗糖分子容易穿过渗凝胶jL隙目透细胞内与变位酶接触 发生催化反惠而且吸糖的产物帕托金糖也是，J、分子物质也容易从细胞n渗透出来嗣此采用固定细胞坚型盟璺燮鳖塑燮坐燮 法，简单方便，酶活损灾小，是较适宜工业化生产酶制剂的方法。固定化细胞叉分为：非生长型与再生型活 细胞的固定化方法。所谓非生长型系指，固定化细胞在反应器内连续进行催化过程中，不再补加营养源 使剧定化的活细胞生长增殖，提高酶活；反之，再生型的则是在反应器内固定化的活细胞，经连续催化作用 后补充营养源，并通以空气，以期促进同定化的活细胞生长增殖达到提高酶活目的。再生型活细胞固定法， 在活化过程中、导致凝胶机械强度大为降低。从工业化连续生产考虑，用固定化细胞再生的丁=艺并非理想措施8”1 5 22。30 j。酶制剂的工业生产，因使用的产酶微生物菌种不同，所用非生长型固定化细胞工艺技术也有很大差异 以下介绍三种不同产酶微生物菌种制备固定化细胞的工艺方法： 第一，美国专利公报(No4359，531)的固定化细胞方法：使用大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici NCPPB1578)，培养基为蔗糖4，蛋白胨1，牛肉抽提物04，培养时间70小时，在稳定期前收获细胞，于30。C下使用150009离心10分钟，细胞得率为1(wwc)。固定化细胞技术为，海藻酸钠用量5，0IMCaCI， 于30下搅拌1小时。然后，将固定化细胞装入具有夹层的o 5x30cm柱中，流速为空柱体积的0 01(v=001ecvh)，使蔗糖转化为帕拉金耱和其他糖达到平衡，酶活为03259产物幢湿细胞邝。100克蔗 糖可回收88克帕拉金糖结晶。第二，美国另一专利公报(No4，390，627)固定化蔗糖变位酶的方法：使用的是红色精朊杆菌 (Protaminobacter rubrum CB574，77)固定化整个细胞，固定方法是使用单宁(Tannic acid)吸附，加入聚乙烯 亚胺(PEl】絮凝，再加入表卤醇多胺聚合物和戊二醛于培养液中，得到反应产物，过滤或离心收集湿菌滤 饼，于55F干燥即得固定化细胞酶制剂。第三，英国应用专利(No2，082，59D：该专利是改进的固定化细胞的方法，将具有变位酶的微生物细 胞包埋于海藻酸钙中后，苒用聚乙烯亚胺和戊二醛处理。可得到酶活高而又稳定性好的固定化细胞。该 专利使用普利茅斯沙雷氏菌(SerratiaplymuthicaNOB 8285)，第四，中国发明专利(ZL891006842)：该专利使用的微生物菌种为Serratia plymuthica ATCC 15928诱变种SG5，发酵培养基为：蔗糖4，玉米浆3，KCl 0_2(均为wv)，pH6570，温度30C，搅拌速度1 50rpm，通气量l：05vvm，在发酵过程中适时地进行补料，发酵周期8一16小时，于对数生长期将结束时， 将高岭土或硅藻土作为吸附剂及固定化细胞的支撑剂加入发酵液中，然后离心分离吸附于高岭士或硅藻 土上的细胞，再用海藻酸钙包埋固定化，最后用戊二醛交联处理，固定化细胞装入柱内。第五，文献报道中的其他固定化方法：蔗糖变位酶也曾用其他材料和方法进行过研制，例如，用 DEAE-纤维素吸附欧文氏菌细胞，将29细胞与10ml很稠的DEAE-纤维素混合，再用TrisHcl缓冲液调 节pH70即可。其次，也有将2克菌体细胞同2克骨炭，悬浮于lO毫升去离子水中，接着加入150毫克单宁酸和130毫克戊二醛的22ml丙酮液处理30分钟从而使欧文氏菌细胞固定于骨炭上，作为酶制剂应用。4蔗糖变位酶的稳定性蔗糖变位酶即0,-葡糖基转移酶(n-glucosyltransferase)活性高，用海藻酸钙固定化细胞，在适当操作条 件下相当稳定。当然，酶的稳定性与菌种、固定化方法、操作条件等因素均有密切关系，现分述如下：41不同固定化方法对酶稳定性的影响 蔗糖变位酶用不同固定方法其稳定性表现不同，可见表3。742002中国酶制剂生产与应用技术交流大会论文集 表3不同方法固定化大黄欧文氏菌细胞的酶活与稳定性比较+酶活性 半衰期 转化率固定化技术 (g产物惶湿细胞，时)(时)()海藻酸钙 0 3258500 99DEAE纤维素0583400 87聚丙烯酰胺0 13570 50 戊二醛凝集细胞0153 40235 角叉胶槐豆胶0 263 37 5 38 骨嶷00】2525 琼脂034 27 27 黄原胶槐豆胶0j08395注意：在胶原蛋白或醋酸纤维中固定化不能保存酶活性，但在壳聚糖中固化时可保存较多的酶活性，但 这种吲定化酶制剂的机械强度较差，而且细胞不能持久地固定化。因为稳定性和转化率为相互依赖，上面 参教均系引用的。IL4I从表3可罾出1吏用不同固定化方法和材料所制备的固定化细胞酶活相差甚大。用海藻酸钙固定化 大蠢欧文氏菌NCPPB1578细胞较其他微生物菌种或菌株都好。固定化细胞酶活性为o 3259产物g湿 细胞时，半衰崩长达8500小时，相当于354天，转化率高达99，几乎底物蔗糖100转化为帕拉金 糖其中仅有约1的其他副产物。而用DEAE-纤维素固定化的虽然酶活为O 5839产物g湿细胞时， 但节衰州仅有400小时，半衰期为海藻酸钙固定化的49，转化率仅87。用聚丙烯酰胺固定化的， 酶活仅0 j39产物恒湿细胞时，酶活仅为海藻酸钙固化的40，半衰期为570小时，转化率只有50 等。由此，可知固定化技术对酶制剂的酶活影响甚大”“”J。42酶反应的最适温度：蔗糖变位酶转化是适温度，游离细胞为30。C，固定化细胞为35，一般在固定化细胞反应器内维 持庄2530。C温度为佳例如大黄欧文氏菌在适宜的30C温度操作F，其半衰期可长达8，500小时，若 温度达50时仅有363小时，半衰期即降低95【I 。l：0“。8。苎6。f引。f20253035404b温旺【。C)fIil藕葡F二ii丽图2酶反应最适温度43酶的热稳定性 用001N磷酸盐缓冲液分别将蔗糖变位酶固定化细胞和游离细胞悬浮于其中，在不同温度下处理30或60分钟，然后分别测定酶活，见图5和6，从图5,6可知，围定化细胞的热稳定性比游离细胞为 高。在40C处理30分钟后，游离细胞酶活仅存42；”0壤壁型鲨里刿燮型燮燮塑而固定化细胞酶活尚有78。但当在50下处理30分钟后，无论是固定化细胞还是游离细胞的酶活均下降80p2Z。说明蔗糖变位酶的热稳定性差【10】。I?0l 20100100i80誓蚰40二80-塞却藿60n 靛罂40耋2003040 50 60处理湿度(时问30)-0-游离细胞-0-固化细胞图3热处理温度对酶活的影响图4 热处理时间对酶活的影响44底物浓度对酶活的影响 蔗糖变位酶转化底物蔗糖浓度可从125缶O(WV)，所做测定表明：不同底物浓度对固定化的蔗糖变位酶有重要影响。蔗糖浓度高影响酶活，当浓度超过大约40(WV)时表现出有抑制作用。但是，当蔗糖浓度使用较高时，固定化细胞稳定性(如半衰期)反而明显地提高，固定化细胞稳定性的提 高与蔗糖浓度增加可以弥补酶活降低的损失。故固定化细胞的酶反应柱常使用高浓度的蔗糖进行转化，45金属离子对酶活的影响许多金属离子对某些酶活具有明显的促进或抑制作用。陈江海报道了9种金属离子及螯合剂对蔗糖变位酶的影响。研究表明，KCI，NaCI，CaCl2，EDTA2Na在表中浓度下对酶活没有明显抑制作用。而zn”，Bf+， Mg“，Fe”，Mn4-*，cu“等离子对蔗糖变位酶呈现出抑制作用。另据日本公开特许公报报道：游离酶 在大于40C温度下，酶活性急速下降，反而Cu与Zn-“-离子可以迅速抑制下降反应，可能因处理条件 有异，Cu”，Zn“离子对酶活影响也不同。此外，ca”，Mn”，MgH及铜铝矿对酶活无影响“、27I。46酶的米氏常数Km值蔗糖变位酶的米氏常数Km值，不同文献报道有所不同，据程裕报道，游离细胞Km值为o025： 固定化细胞Km值为O0769。固定化细胞为游离细胞Km值的3倍，表明固定化细胞与底物蔗糖的亲和 力比游离细胞小，可能是海藻酸钙包埋细胞后，由于产生空间效应，酶蛋白的活动中心较难与底物分子 接触，降低了酶活。因而达到最大反应速度一半所需要底物的浓度就高，才能保持反应体系有较多的底 物分子，使酶反应速度迅速达到最大。这表明固定化酶对底物亲和力小。又Peter sJCheetham报道， 蔗糖变位酶Km值为035M。刘树楷等提道，固定化和原细胞内酶的米氏常数Km值分别是014和012M， 可见固定化处理并不影响酶的米氏常数Km值，通过对应用固定化酶的间歇式反应过程的观察，可推知 产物的抑制常数(Inhibition constant)是03M。故该抑制常数比Km值大，因此表明酶对蔗糖的亲和力在 某种程度上要比对产物的亲和力大，因此反应混合物中蔗糖浓度要低些II“”“。76!：!璺壁塑型圭圭量皇墨垫查奎堕垄全垒查叁篓i坠：5蔗糖变位酶的应用近年来功能性食品添加剂，阅现代生物技术的进步而崛起。蔗糖原本是千百年来人类传统的天然甜 昧剂也是体能来源之一。后冈发现多吃会导致肥胖，对高血压、糖尿病患者不利，尤为严重地是食用蔗糖 后，如不注意口廿守H生会诱发龋齿。故替代蔗糖而义无蔗糖弊病的新犁功能性天然或合成的甜味剂，引 起铷界学者的)、泛研究。目前在众多可取代蔗糖的新型功能性甜昧荆中，帕拉金糖及其衍生物占有重要 地位。日本于1993年在批准的69种功能性的食品(FOSHU中即有帕拉金糖及其衍生物。】957年，德国南德制糖公司首先制出异麦芽酮糖的结晶，并以当地地名Palatin命名为Pafatinose中 泽名帕拉金糖。帕拉金糖除具有蔗糖的纯正甜味和优良加工工艺性能外，更重要地是：它是一种不致龋 齿的天然甜味剂具有特殊生理代谢功能。它的衍生物低聚帕拉金糖(Palatinose oligosacchafide)2柏拉 金糖醇(Palatinitol或Palatinit)或称异麦芽酮糖醇(somaltitol或Isomalt)除不致龋齿外，还有双歧因子和 低热i等生理功能但必须以帕拉金糖为原料方能制得。帕拉金糖为蔗糖的同分异构体，含ltool结晶水，分子量为360 32，熔点123124，比旋度n20D 972。 的旋糖吸湿性甚低，溶解度及粘度均较蔗糖低，在常温下分别为其50及90，极耐酸解，具有还原性， 对赞林氏溶液还原力为葡萄糖的52，对热的稳定性较蔗糖差在140C时变褐温度高时可发生分解和聚 合反应等但作为食品甜昧剂取代蔗糖，完全可满足工艺要求。114,”“1I州z金糖、低聚帕拉金糖和帕拉金糖醇的特殊生理代谢功能：(1)1i致龋齿：不致龋齿性是帕拉金糖及其衍生物的重要生理功能，日本高添大岛等人对此进行了深入 妍究陔糖不仅不为口腔中致龋齿菌变形链球菌(Streptococcus mutans)利用产酸，而且也不被其葡糖基转 移酶(Giucos?ltransferase又称GTase)形成引发龋齿的不溶性葡聚糖(Glucan)，这种葡聚糖粘性很强，可附着 r齿面一I-形成齿垢。同时，帕拉金糖还可以抑制口腔微生物利用蔗糖产生不溶性葡聚糖，因而帕拉金糖是 目讨强不致龋齿、低甜度的优良天然甜味剂。(2)、消化吸收：帕拉金糖不被口腔、胃液中酸、酶所水解，在人体小肠内为蔗糖酶一异麦芽塘酶的复合 酶作fj分解为葡萄糖及果糖，进入糖代谢途径。低聚帕拉金糖及帕拉金糖醇则不被胃、肠和酶降解，消 化吸收度极低，但能为肠道有益微生物敢歧杆菌利用，抑制有害菌群，具有双歧因子的作用。帕拉金糖被摄 入后，血糖值上升非常缓慢并保持在一定水平，不刺激胰岛素产生并保持其稳定。因而为糖尿病人的良好 甜味刹。帕拉金糖醇不仅低甜度、低热卡、多食也不会产生腹胀、腹泻，故FAOWHO食品添加剂联合 委员会通过决定：对帕拉金糖醇ADI值不作特别规定6-94。421。然而帕拉金糖仅微量存在自然界的蔗汁及蜂蜜中，曾用化学方法改变蔗糖结构，生产成本甚高。直到80年代初，随着生物技术的进展，德、英、美、日等国利用发酵及酶工程技术才实现了低成本、低能耗， f、t州蔗糖变位酶将蔗糖转化为帕拉金糖的目标，使帕拉金糖及其衔生物实现了工业化生产，成为新型功能 性甜味剂的重要品种19 J。其简略生产技术及工艺流程如下：发酵生产红色精朊杆菌细胞I14梅藻酸固定化o 25molCaCl2J水洗涤粒状酶JHCiIl固定化细胞一2聚乙烯亚胺Jl+05成二醛固定化细胞一水洗涤图5制备蔗糖变位酶的固定化细胞流程简图蔗糖溶掖发酵生产细胞lT填充床式酶反应柱离心收集细胞l l树脂离交固化细胞ll真空浓缩固化酶或固化细胞l加晶种助晶l结晶 l 离心1l0帕拉金糖糖蜜帕拉金糖结晶I 1低聚帕拉金糖2蜊氢化L帕拉金糖醇低聚帕拉金糖一二JL一帕拉金糖醇圈6帕拉金糖生产工艺流程简图用蔗糖变位酶转化蔗糖生产帕拉金糖有关固定化细胞(酶)及其操作方法的专利很多，但均大同小 异，通用的操作方法为：将固定化细胞置于填充柱内，流加或反复循环进行酶促反应，所有操作方法均以能 达到提高产率并保持酶活稳定性为目的。流出液中约85的蔗糖转变成帕拉金糖和少量副产物，流出 液组分及其糖蜜的规格标准见下表4、5p、9“2”。20021中国酶制剂生产与应用技术交流大会论文集 表4酶柱流出液糖组分分析糖分占总糖量 帕拉金糖 85 7果糖 2 2葡萄糖 1 8蔗糖 1 11-0-ct-D-葡糖基D果糖 8 7 异麦芽糖 0 4 松三糖 02表5帕拉金糖结晶及帕拉金糖糖蜜规格标准 啊拉金糖结晶 巾白拉金糖糖蜜水份 O 2以下 水份291昭拉金糖(含结晶水)99 O以上 固形物 711灰分0 01以下 糖类(圆形物05)以上色价50以F灰分 O 03以F粗嗖：6。二8曰7 00以上 色价(AI) 150以下pH5 0l 0糖的绢成果糖 148 葡萄糖 13O 砂糖 35 帕拉金糖 24110-ctD一葡糖基一D一果糖39 4 异麦芽糖 5： 异松二糖 5 2帕拉金糖在低水分和低pH值条件IcDH热发生缩合反应生成低聚帕拉金糖，这种低聚糖由24个帕 拉金糖兮子脱水缩合而成，其分子结构示意图见图12。 唾液和胰液的淀粉酶都不能消化低聚帕拉金糖 (包括帕拉金糖二聚体、三聚体和四聚体等帕拉金糖的缩合产物)人工胃液只能稍微消化。用小鼠肠 内酶的制刹(丙酮粉剂)，可消化低聚帕拉金糖，并生成葡萄糖和低聚糖类的混合物(27个糖)。显然， 矗小肠【q帕拉金糖几乎全部被消化，但约60的帕拉金糖的二聚体和三聚体，以及约90的四聚体均 术做消化而留r，为耿歧杆菌等有益微生物所利用，具有双歧因子，能促进肠道有益微生物菌群生长，抑制 有害微生物的繁殖，从而提高人体免疫功能。帕拉金糖fi：雷尼镍催化剂(Raney镍)催化作用下盟度为120-150C，压力为48Mpa，通以氢气，帕t金糖氢化生成异麦芽酮糖醇(1somaliitol或lsomalt)，俗称帕拉金糖醇(Palatinitol或Palatinit)，即ii-D吡喃葡糖基一I、6一山梨糖醇(GPS)和一D一吡喃葡糖基一11一甘露糖醇(GPM)混合物，其结构见图7。蠼： 型垡型堂堂燮巡燮6Oa-O毗一一O一曩曩1OaD-甘一一 6o-aD一毗一硇奠誓一D一山瓤一 I帕控盒l 11GP二水化台鞠11 6GPSlCHt0HCH-OH CHt0HCHt0H C兰O C-11l?“r“HO-C-HIHOcHHc-oH_P“-cOHIHjc。oH8-C-OHjcoHlHjc一。HIHOCH， CH， L。一：H，图7异麦芽酮糖氢化生产异麦芽酮糖醇巾真拉金糖醇是1-0一aD一水甘露糖醇(1，1一GPM)和6-0一*D，山梨糖醇(1,6。GPS J同分异构体的混台 物-GPM带1：=j 2摩尔结晶水，而GPS以无水结晶形式忻出。为无气味、白色、晶状、吸湿性很低的糖醇 熔i勾】45150对热稳定性好，甜度纯正，为蔗糖的4560，对酸、碱稳定，各种微生物(如细菌、酵母和霉菌等)都很难利“j该糖醇，具非致龋齿性能，同时为低热告可作为肥胖、糖尿病人及老年人群的良女f的甜味荆。鉴丁-帕拉金糖、低聚帕拉金糖及帕拉金糖醇等的优良特性及其功能性已广泛用于食品加工业如糖 裂、糕点、果酱、果冻、饮料、冰淇淋等甜食中取代蔗糖等制成不致龋齿、低热卡、低甜度的各式食品。 相信不久即将成为21世纪的人类餐桌上新型功能性甜昧剂I”4”。作者简介：贺鹰抟，曾任J东省微生物研究所副所长、所学术委员会主任，。东省微生物学会理事长、 中国微生物学会理事及工业微生物专业委员会副主任、委员等职。现任广东省微生物研究所研究员、硕1：生导师。美籍华人生物科学学会会员。从事工农业微生物研究50年，早期进行根瘤菌、非共生固氯 曲、拮抗性放线菌分布、新抗筛选、热带作物加工业废水综合利用等研究。近20年进行高核酸酵母选 育硬制取酵母抽提物：应用固定化细胞生产异麦芽酮糖(帕拉金糖)及其氢化工艺等研究。研究成果二 项剁入国家火炉计划，先后获省部级科技进步奖6项，申请发明专利三项，发表过研究报告论文50余 篇，1956年被评为全国先进工作者，受到毛泽东主席等党帛I国家领导人接见，1992年获国务院特殊津 贴，退休后退聘继续从事研究开发工作。主要参考文献I高添一郎食品工业，1983，4，25322清水淳一日本特许公报，1983，10，7pp3林懿宁泽国外科技，1990，1，46484 00shima et a1InfectAnd Immun，Jan，1983，39(1)，43-495 Topiaoglou ef al Carie Res，1984，18，47516浜田茂幸 食品工业，1983，4，16-247，LorenzS el al，Zeitschrififur dieZuckerindustrie，1964，11，6256278臧向莹等中国专利，zL 891006842，19892，8pp9臧向莹广州食品工业科技(食品添加剂专辑)，1992，2，1317802。02，中国酶制剂生产与应用技术交流大会论文集Il：翟擎竺。O 程裕中国生物工程学会第二次代表大会论文摘要，1997，91Lautero，OJ，EP 77，971，1983，3，4，7pp，2Kutzbach Cet a1，EP 49，801，1982，4，21，8pp，3US4，390，627 1983，10，13，14pp4Peter SJCheethamet a