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实验二十三实验二十三 病毒核酸检测常用技术病毒核酸检测常用技术 Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use 近年来随着分子生物学的发展 基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足 的进展 由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定 因此根 据病原微生物的基因特点 应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸 从而可以特异 灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物 在微生物学的研究及感染 性疾病的诊断中 最常使用的微生物核酸检测技术有 PCR RT PCR 核酸杂交等技术 现对病毒核酸 DNA RNA 的分离 PCR RT PCR 核酸杂交等技术的基本原理 操 作方法 应用及影响因素等进行概述 实验实验 1 1 PCRPCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸检测传染性喉气管炎病毒核酸 目的要求 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸 DNA 的分离与 PCR 技术的基本原理 操作方法 影响因素和应用 基本原理 鸡传染性喉气管炎 Infectious laryngotracheitis ILT 是由疱疹病毒科 疱疹病毒亚科的 喉气管炎病毒 Infectious laryngotracheitis Virus ILTV 引起的一种急性上呼吸道传染病 常表 现呼吸困难 产蛋鸡产蛋下降和死亡 是危害养鸡业发展的重要疫病之一 但在临诊上极 易与其它一些呼吸道疾病相混淆 如禽流感 新城疫 传染性支气管炎 支原体感染等 常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验 这些方法虽经典 但费时且敏感性 差 不能检测亚临床感染 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式 聚合酶 链式反应 Polymerase Chain Reaction PCR 是目前比较快速 敏感 特异的检测手段 已被广泛应用在病毒核酸检测方面 本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为 例 对PCR方法进行介绍 PCR 是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法 典型的 PCR 由 1 高温变性模板 2 引物与模板退火 3 引物沿模板延伸三步反应组成一个循环 通过多次循环反应 使目的 DNA 得以迅速扩增 其主要步骤是 将待扩增的模板 DNA 置高温下 通常为 93 94 使其变性解成单链 人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别 与目的基因两侧的两条单链互补结合 两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长 短 耐热的 DNA 聚合酶 Taq 酶 在 72 将单核苷酸从引物的 3 端开始掺入 以目的基 因为模板从 5 3 方向延伸 合成 DNA 的新互补链 如此反复进行 每一次循环所产 生的 DNA 均能成为下一次循环的模板 每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA 特 异区拷贝数扩增一倍 PCR 产物得以 2n的批数形式迅速扩增 经过 25 30 个循环后 理 论上可使基因扩增 109倍以上 实际上一般可达 106 107倍 图 23 1 图图 23 1 PCR 基本原理示意图基本原理示意图 本实验是将被检样品中 ILTV 颗粒经裂解 变性后 分离 ILTV DNA 选择鸡传染性喉 气管炎病毒的 TK 基因保守序列设计引物 由于引物与鸡传染性喉气管炎病毒的 TK 基因 存在着特异的互补性 当加入 DNA 聚合酶后 就会在引物的引导下合成该段基因 该基 因片段通过人工扩增后 经含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳 在紫外灯下可显示橙红色 ILTV DNA 条带 根据片段大小来判定标本中鸡传染性喉气管炎病毒的存在 器材准备 1 病毒裂解液 醋酸钠 1 7g EDTA 钠盐 4 65g 20mg ml 蛋白酶 K 2 5ml 100g L SDS 10ml DEPC 三重蒸馏水加至 50ml 2 3mol L 醋酸钠缓冲液 pH 5 2 酚 氯仿 异戊醇混合液 25 24 1 无水乙醇及 70 乙醇 3 2 5mmol dNTPs 含 dATP dCTP dGTP dTTP 各 2 5mM 4 10 PCR Buffer Taq DNA 聚合酶 5 DNA 分子量标准 6 上样缓冲液 2 5g L 溴酚蓝 400g L 蔗糖水溶液 10mg ml 溴乙锭 EB 具致癌性 操作时应戴手套 琼脂糖 7 50 TAE 缓冲液 242g Tris 57 1mL 冰乙酸 100mL 0 5mol L EDTA pH8 0 加三 蒸水定容到 1000mL 使用液为 1 8 ILTV 北京 E2 株 ILTV DNA 可疑组织样品 ILTV DNA 阴性组织样品等 9 引物序列 参考已发表的ILTV的TK基因序列 设计并合成了一对引物 其序列如下 引物P1 5 TTCGAGAACGATGACTCCG 3 引物P2 5 ATAGTCATCTGAACTTCCGC 3 10 仪器 台式高速离心机 PCR 扩增仪 电泳仪 水平式电泳槽 紫外透射反射分 析仪 微量加样器 Eppendorf 管与吸头等 实验步骤 1 病毒核酸的分离 1 取 ILTV DNA 可疑组织样品上清液 200 L 病毒裂解液 20 L 于 Eppendorf 管中 60 水浴 1h 同时设 ILTV 北京 E2 株 ILTV DNA 阴性组织样品对照 2 加酚 氯仿 异戊醇混合液 200 L 上下颠倒混匀 14000rpm 离心 5min 吸上清液 于另一新的 Eppendorf 管中 3 加 1 10 体积的 3 mol L 醋酸钠缓冲液 pH 5 2 及 2 倍体积的无水乙醇 20 过夜 14000rpm 离心 15min 弃上清液 4 加 70 乙醇至 Eppendorf 管 2 3 处 混匀 洗涤沉淀 14000rpm 离心 15min 弃上 清液 室温中使乙醇挥发 2 加样及 PCR 扩增 1 按以下次序将各成分加入 0 5ml 灭菌 Eppendorf 管中 10 PCR buffer 5 l 2 5mM dNTPs 4 l 引物 P1 25pmol L 2 l 引物 P2 25pmol L 2 l Taq DNA 聚合酶 5U l 0 5 l 模板液 病毒核酸的分离液 1 l 加 ddH2O 至 50 l 2 将上述混合液稍加离心 调整好反应程序 立即置 PCR 仪上 执行扩增 一般在 94 预变性 3min 进入循环扩增阶段 94 60s 58 30s 72 60s 循环 30 35 次 最 后在 72 保温 7min 3 电泳检测 1 将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上 放好梳板 使梳板齿下沿 距倒胶槽板 1mm 2 配制合适浓度的琼脂糖凝胶 如配制 1 2 的凝胶 则称取琼脂糖 1 2g 于三角瓶 中 加入 100ml 1 TAE 电泳缓冲液 置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至 100ml 迅速混匀 待冷至 60 左右时 加入 100 L 0 5mg ml 的 EB 液 充分混匀 倒胶至倒胶 槽内 使厚度为 3 5mm 排除气泡后待胶完全凝固 撕去两端胶带 3 将倒胶槽置电泳槽中 加入 1 TAE 电泳缓冲液使其没过胶面 2 3mm 轻轻拔出 梳板 4 加样 取 2 L 上样缓冲液于 Parafilm 膜上 加入 PCR 产物 5 L 混匀后 加入 点样孔中 不要溢出孔外 同时设 DNA 分子量标准 5 电泳 样品在负极端 接通电源 5V cm 恒压电泳 30 60min 即可 6 检测 电泳结束 关闭电泳仪电源 取出倒胶槽 将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在 紫外灯 300nm 下观察 可见桔红色明亮带 根据电泳条带的位置判断结果 4 结果判定 在阳性对照孔出现相应扩增带 阴性对照孔无此扩增带时判定结果 若样品扩增带与阳性对照扩增带 约 265bp 处于同一位置 则判定为 ILTV DNA 阳 性 否则判定为阴性 注意事项 1 所有实验结果都有成功或失败 实验的失败可能是应该出结果而没有出 我们把它 称作假阴性 不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性 PCR 实验中最常见的问题就是 假阴性和假阳性问题 1 假阴性 出现假阴性结果最常见的原因有 Taq DNA 聚合酶活力不够 或活性受到 抑制 引物设计不合理 提取的模板质量或数量不过关以及 PCR 系统欠妥当 循环次数不 够 为了防止假阴性的出现在选用 Taq DNA 聚合酶时 要注意用活力高 质量好的酶 同 时在提取 PCR 模板时 应特别注意防止污染抑制酶活性物质 如酚 氯仿 的存在 尽管 Taq DNA 聚合酶对模板纯度要求不高 但也不允许有破坏性有机试剂的污染 保证引物的 3 端与靶基因的互补 PCR 反应的各温度点的设置要合理 2 假阳性 PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性 但令人头痛 的问题是易污染 极其微量的污染即可造成假阳性的产生 所以污染是 PCR 假阳性的主要 根源 污染的原因可能有 样品间交叉污染 样品污染主要有收集样品的容器被污染 或样品放置时 由于密 封不严溢于容器外 或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染 样品核酸模板在提取过程 中 由于移液器污染导致样品间污染 有些微生物样品尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶 胶而扩散 导致彼此间的污染 PCR 试剂的污染 主要是由于在 PCR 试剂配制过程中 由于移液器 容器 双蒸 水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染 PCR 扩增产物污染 这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题 因为 PCR 产物拷 贝量大 远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限 所以极微量的 PCR 产物污染 就可造成假 阳性 还有一种容易忽视 最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面 摩擦时就可形成气溶胶 在操作时比较剧烈地摇动反应管 开盖时 吸样时及污染移液器 的反复吸样都可形成气溶胶而污染 实验室中克隆质粒的污染 在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检 验室 这个问题也比较常见 因为克隆质粒在单位容积内含量相当高 另外在纯化过程中 需用较多的用具及试剂 而且在活细胞内的质粒 由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有 很强的生命力 其污染可能性也很大 为了避免因污染而造成的假阳性 PCR 操作时采取如下措施 合理分隔实验室 将样品的处理 配制 PCR 反应液 PCR 循环扩增及 PCR 产物的 鉴定等步骤分区或分室进行 特别注意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开 最好能划分 标本处理区 PCR 反应液制备区 PCR 循环扩增区 PCR 产物鉴定区 移液器 移液器污染是一个值得注意的问题 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入移液器内或粘上枪头是一个严重的污染源 因而加样或吸取模板核酸时要十分小心 吸 样要慢 吸样时尽量一次性完成 忌多次抽吸 以免交叉污染或产生气溶胶污染 预混和分装 PCR 试剂 所有的 PCR 试剂都应小量分装 如有可能 PCR 反应液应 预先配制好 然后小量分装 20 保存 以减少重复加样次数 避免污染机会 另外 PCR 试剂与反应液应与样品及 PCR 产物分开保存 不应放于同一冰盒或同一冰箱 防止操作人员污染 手套 吸头 小离心管应一次性使用 设立适当的阳性对照和阴性对照 阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准核酸 为宜 并注意交叉污染的可能性 每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有 被扩增核酸的样品作阴性对照 减少 PCR 循环次数 只要 PCR 产物达到检测水平就适可而止 选择质量好的 Eppendorf 管 以避免样本外溢及外来核酸的进入 打开离心管前应 先离心 将管壁及管盖上的液体甩至管底部 开管动作要轻 以防管内液体溅出 2 注意个人防护和环境保护 电泳中用到的 EB Times New Roman 体 可诱发基因 突变 试验中被 EB 污染的物品要有专用收集处 并通过焚烧作无害化处理 3 实验用品应专用 实验前应将实验室用紫外线照射以破坏残留的 DNA 或 RNA 总而言之 PCR 的条件是随系统而异的 并无统一的最佳条件 先选用通用的条件扩 增 然后可以通过稍稍改变各参数 使反应条件得到优化 以取得优良的特异性和产率 实验报告 1 实验结果 1 你所做的 PCR 实验阳性对照是否出现相应扩增带 如果有扩增带 请对你的试验 结果进行描述 如果失败 请分析其原因 2 思考题 1 PCR 技术的基本原理 2 影响 PCR 实验成功的因素有哪些 3 PCR 检测中出现假阳性 可能导致的因素有哪些 4 根据实验过程中的体会 总结如何做好 PCR 实验 关键因素有哪些 实验实验 2 2 RT PCRRT PCR 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸 目的要求 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸 RNA 的分离与 RT PCR 技术的基本原 理 操作方法 影响因素和应用 基本原理 猪繁殖与呼吸综合征 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS 是由猪繁 殖与呼吸综合征病毒 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRRSV 引起的 一种传染病 其临诊特征为各种年龄的猪均可感染 病猪厌食 嗜睡 体温升高 妊娠母猪发 生早产 流产 死胎 弱胎和木乃伊胎 种公猪性功能下降 仔猪和育肥猪呼吸障碍 1987 年该病首次报道于美国 随后迅速蔓延北美 欧洲及亚洲各国 目前已成为一种地方性流行 病 1996年初 我国也报道了本病的发生 由于PRRS与其它引起猪繁殖障碍的疾病存在着 非常类似的临诊症状 根据现场诊断很难做出准确鉴别 实验室诊断方面 如病毒的分离与 鉴定 抗原及抗体的检测等方法或特异性 敏感性差 或操作技术复杂 费时费力等缺点 不 能满足临床需要 PRRSV属动脉炎病毒科成员 有囊膜 基因组为单股正链RNA 大小约 15kb 反转录 聚合酶链式反应 Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction RT PCR 方法具有特异 敏感 快速诊断等优点 因此PRRSV适用RT PCR方 法进行检测 RT PCR 是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法 它是以 RNA 为模板 根据碱基 配对原则 按照 RNA 的核苷酸顺序合成 DNA 这一过程与一般遗传信息流转录的方向相 反 故称为反转录 催化此过程的 DNA 聚合酶叫做反转录酶 reverse transcriptase 基本过 程是以 dNTP 为底物 以 RNA 为模板 按 5 3 方向 合成一条与 RNA 模板互补的 DNA 单链 这条 DNA 单链叫做互补 DNA complementary DNA cDNA 它与 RNA 模板形成 RNA DNA 杂交体 随后又在反转录酶的作用下 水解掉 RNA 链 再以 cDNA 为模板合 成第二条 DNA 链 至此 完成由 RNA 指导的 DNA 合成 图 23 2 然后将 DNA 进行 PCR 扩增 PCR 扩增的基本原理见实验 1 部分 图图 23 223 2 RT PCRRT PCR 基本原理示意图基本原理示意图 器材准备 1 TRIzol LS Reagent RNA 提取试剂 2 氯仿 异丙醇 70 乙醇 3 DEPC 处理水 按 1 1000 的比例将 DEPC 加入三蒸水 室温放置 12h 以上 4 5 反转录反应缓冲液 5 SuperScriptTM 反转录酶 200U L 6 RNA 酶抑制剂 40U L 7 2 5 mM dNTPs 含 dATP dCTP dGTP dTTP 各 2 5 mM 8 10 PCR Buffer Taq DNA 聚合酶 9 DNA 分子量标准 10 上样缓冲液 2 5g L 溴酚蓝 400g L 蔗糖水溶液 10mg ml 溴乙锭 EB 具致癌性 操作时应戴手套 琼脂糖 11 50 TAE 242g Tris 57 1mL 冰乙酸 100mL 0 5mol L EDTA pH8 0 加三蒸水 定容到 1000mL 使用液为 1 12 PRRSV 标准毒株 PRRSV RNA 可疑组织样品 PRRSV RNA 阴性组织样品 等 13 引物 1 反转录引物 可用随机引物 Random Primers 市售 Oligo dT 12 18 市售 或 Random Primers 与 Oligo dT 按 3 1 混合而成的引物 Oligo dT Random primer 或用相对 PRRSV RNA 来说的 PCR 下游单侧特异性引物 2 PCR 引物序列 以高度保守的 ORF7 作为扩增靶区设计并合成一对引物 序 列如下 引物 F 5 ATGCCAAATAACAACGGCAAGC 引物 R 5 TTAATTTGCACCCTGACTG 3 14 仪器 台式高速离心机 PCR 扩增仪 电泳仪 水平式电泳槽 紫外透射反射分 析仪 微量加样器 Eppendorf 管 吸头与水浴箱等 实验步骤 1 病毒核酸 RNA 的分离 病毒核酸 RNA 分离方法很多 实际应用时可灵活考 虑 本实验选择市售商品化 TRIzol LS Reagent RNA 提取试剂完成猪呼吸与繁殖障碍综合 征病毒 PRRSV 基因组 RNA 的分离 操作按 TRIzol LS Reagent RNA 提取试剂使用说明 书进行 步骤如下 1 在 1 5mL 离心管中加入 250 L 的 PRRSV 细胞培养物和 750 L TRIzol LS 盖上 管盖 倒置混匀 室温放置 10min 2 加入 200 L 氯仿 将匀浆剧烈振荡 15sec 室温静置 5min 使核蛋白质复合体彻底 裂解 3 4 12 000 rpm 离心 15min 将上层含 RNA 的水相移入一新管中 为了降低被处于 水相和有机相分界处的 DNA 污染的可能性 不要吸取水相的最下层 4 加入等体积的异丙醇 充分混匀液体 室温放置 10min 5 4 12 000 rpm 离心 15min 弃上清 再用 70 的乙醇洗涤沉淀 然后离心 再用 吸头彻底吸弃上清 在自然条件下干燥沉淀 溶于适量 DEPC 处理的水中 直接用于 RT PCR 或 80 贮存 备用 6 另外 也可选择异硫氰酸胍法完成 PRRSV RNA 的提取 2 病毒 cDNA 第一链的合成 反转录 RT 病毒 cDNA 第一链的合成参照 Invitrogen 公司的 SuperScriptTM 反转录酶使用说明进 行 步骤如下 1 于微量离心管中加入 6 L RNA 2 L 反转录引物 Oligo dT Random primer 混合物 混匀 65 5min 2 冰浴 2min 离心 3 继续加入以下组分 5 反转录反应缓冲液4 L 0 1 m M DTT 2 L 2 5mmol dNTPs 2 L SuperScriptTM 反转录酶1 L 200U L RNA 酶抑制剂 0 5 L 40U L DEPC 水 2 5 L 4 混匀 42 水浴 50min 最后 70 水浴 15min 完成 cDNA 链合成 取出后可以直接进行 PCR 或者放于 20 保存备用 试验中同时设立阳性和阴性对照 3 PCR 扩增 根据扩增目的选择引物 F 与引物 R 按 TaKaRa 公司Ex Taq DNA 聚合酶使用说明进 行 步骤如下 按以下次序将各成分加入 0 5ml 灭菌 Eppendoff 管中 双蒸灭菌水37 5 L 反转录产物4 L 引物 F 25pmol L 0 5 L 引物 R 25pmol L 0 5 L 10 PCR Buffer5 L 2 5mmol dNTPs 2 L Taq 酶0 5 L 5U L 注意首先加入双蒸灭菌水 然后再按照顺序逐一加入上述成分 每一次要加入到液面 下 4 全部加完后 混悬 瞬时离心 使液体都沉降到 Eppendorf 管底 5 在 PCR 扩增仪上执行如下反应程序 94 3min 94 30 sec 50 45 sec 72 1min 30 个循环 最后72 延伸10min 结束 可根据扩增目的基因的不同 选择不同的循 环参数 4 电泳检测 1 将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上 放好梳板 使梳板齿下沿 距倒胶槽板 1mm 2 配制合适浓度的琼脂糖凝胶 如配制 1 2 的凝胶 则称取琼脂糖 1 2g 于三角瓶 中 加入 100ml 1 TAE 电泳缓冲液 置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至 100ml 迅速混匀 待冷至 60 左右时 加入 100 L 0 5mg ml 的 EB 液 充分混匀 倒胶至倒胶 槽内 使厚度为 3 5mm 排除气泡后待胶完全凝固 撕去两端胶带 3 将倒胶槽置电泳槽中 加入 1 TAE 电泳缓冲液使没过胶面 2 3mm 轻轻拔出梳 板 4 加样 取 2 L 上样缓冲液于 Parafilm 膜上 加入 PCR 产物 5 L 混匀后 加入 点样孔中 不要溢出孔外 同时设 DNA 分子量标准 5 电泳 样品在负极端 接通电源 5V cm 恒压电泳 30 60min 即可 6 检测 电泳结束 关闭电泳仪电源 取出倒胶槽 将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在 紫外灯 300nm 下观察 可见桔红色明亮带 根据电泳条带的位置判断结果 5 结果判定 在阳性对照孔出现相应扩增带 阴性对照孔无此扩增带时判定结果 若样品扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置 则判定为 PRRSV RNA 阳性 否则 判定为阴性 注意事项 1 分离高质量的病毒 RNA 是 RT PCR 成败的关键 由于 RNA 酶无处不在 且可耐受 多种处理 例如煮沸 而不失活 因此 RNA 在分离过程中极易受其污染而降解 为了获 取完整的 RNA 应创造一个无 RNA 酶的环境 整个操作过程应戴一次性手套并勤换 所 有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温 240 烘烤以达到消除 RNA 酶的目 的 注意采用灭菌的一次性塑料制品 且不得重复使用 非一次性的玻璃和塑料用品须在 使用前应用 0 05 焦碳酸二乙酯 DEPC 室温处理过夜 然后高压灭菌去除 DEPC 以确 保无 RNA 酶 所有溶液 Tris 除外 均须加入 0 05 DEPC 浸泡过夜后高压灭菌 2 病毒 cDNA 第一链的合成 反转录 步骤 1 2 中 将 RNA 溶液置 65 中温 育 然后冷却再加样目的是破坏 RNA 的二级结构 尤其是 mRNA Poly A 尾处的二级结 构 使 Poly A 尾充分暴露 从而提高 Poly A RNA 的回收率 此步骤不能省略 3 RT PCR 过程中的 PCR 步骤中最常见的问题参见实验 1 注意事项内容 实验报告 1 实验结果 1 你所做的 RT PCR 实验阳性对照是否出现相应扩增带 如果有扩增带 请对你的试 验结果进行描述 如果失败 请分析其原因 2 思考题 1 RT PCR 技术的基本原理 2 影响 RT PCR 实验成功的因素有哪些 3 RT PCR 检测中出现假阳性 可能导致的因素有哪些 4 根据实验过程的体会 总结如何做好 RT PCR 实验 关键因素有哪些 实验实验 3 3 核酸杂交技术检测病毒核酸核酸杂交技术检测病毒核酸 目的要求 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸杂交技术的基本原理 操作方法 影响因 素和应用 基本原理 鸡马立克氏病 Marek s Disease MD 是由马立克氏病病毒 Marek s Disease Virus MDV 引起的鸡的一种传染性肿瘤病 它同时还能引起感染鸡的免疫抑制 从而导致 对多种疫苗免疫效应降低 应用特异 敏感的方法对该病作出早期诊断是控制其流行的一 项重要措施 实验室诊断MD的方法很多 到目前为止有琼脂扩散试验 免疫荧光抗体试验 酶联免疫吸附试验等 但这些方法存在敏感性低及易出现非特异性反应等缺点 近年来业已 建立的一些分子生物学方法 如核酸探针技术 以其特异 快速 敏感 适合检测和早期诊 断等特点 已在MDV检测及MD的诊断上得到应用 核酸杂交技术是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的方法 其原理主要是 利用四种脱氧核苷酸中碱基配对原则 G C A T 核酸变性和复性理论 图 23 3 图图 23 323 3 核酸分子杂交原理示意图核酸分子杂交原理示意图 病毒核酸杂交基本原理是将和已知病毒核酸特定区域碱基互补的 DNA 或 RNA 克隆片 段 用非放射性物质 如生物素 地高辛 或放射性物质 如 32P 标记 制备成核酸分子探 针 在适当条件下 核酸探针与临床样品中的病毒核酸形成双链结构而被保留 然后通过 放射自显影或免疫技术检测标记的核酸片段 若被检样品与探针形成杂交双链 则显示阳 性结果 如样品中无与探针互补的序列 则不发生分子杂交 结果为阴性 常用的杂交方 法有 DNA 斑点杂交 原位杂交 Southern 杂交和 Northern 杂交 下面以地高辛 Dig 标记的单链 DNA 探针试剂盒检测 MDV 核酸为例 对常用的 DNA 斑点杂交法进行介绍 将 MDV DNA 样品滴于硝酸纤维素膜上 MDV DNA 经处理变性 双螺旋 DNA 变为单链 DNA 吸附在固相滤膜上 再加分子质量较小的地高辛标记的单链 DNA 即核酸探针 在一定条件下按互补碱基顺序配对的特点进行结合 形成 DNA DNA 的双链杂交分子 然后用偶联有酶的抗地高辛抗体结合物作为酶标记 再分别用显色 底物使杂交部位显色以达到检测目的 其反应过程见图 23 4 图图 23 423 4 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应地高辛标记的探针检测酶联免疫反应 器材准备 1 Dig MDV DNA 探针 参照 Dig DNA 探针标记试剂盒说明进行制备 2 预杂交液 pH7 0 8 6 Ficoll 0 8ml 2 0g L BSA 0 8ml 20g L PVP 0 8ml 20 SSC 2ml 1 mg m1 小牛胸腺 DNA 0 4ml 双蒸水 2 8ml 0 5mol L HCl 0 4ml 3 漂洗液 1 20 SSC NaCl 175 32g 枸橼酸钠 2H2O 88 2g 加双蒸水至 1000ml 2 4 SSC 1 0g L SDS 20 SSC 100ml 100 0g L SDS 5ml 双蒸水 395ml 3 参照 2 法配制 4 SSC 5 0g L SDS 0 1 SSC 1 0g L SDS 4 3mol L NaCl 0 5mol L Tris NaCl 175 32g Tris 60 5g 双蒸水 395ml 4 MDV 中国疫苗株 814 株或中国标准株 Jing 1 株 MDV DNA 可疑组织样品与 MDV DNA 阴性组织样品等 5 器材 负压抽滤点样器 硝酸纤维素膜 塑料袋 烤箱 水浴箱 冰箱 塑料封接 机 实验步骤 1 病毒 DNA 分离 MDV 核酸分离方法参照实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核 酸部分 1 病毒核酸的分离 进行 2 探针标记 MDV pp38 基因片段 DNA 特异寡核苷酸探针标记 参照 Dig DNA 探针 试剂盒说明书进行 3 点样 将上述适度稀释的病毒核酸 DNA 80 l 阳性对照 80 l 阴性对照 80 l 点样于硝酸纤维素膜 NC 膜 或尼龙膜上 负压抽滤 4 变性 用 0 5 mol L NaOH 变性点样膜 10min 再抽干水分按下述顺序洗膜 1 0 5 mol L HCl 漂洗 1 次 每次 10min 2 3 mol L NaCl 0 5 mol L Tris pH7 5 漂洗 1 次 每次 15min 3 1 mol L Tris 0 5 mol L NaCl pH7 5 漂洗 1 次 每次 20min 4 0 5 mol L Tris 0 5 mol L NaCl pH7 5 漂洗 1 次 每次 20min 5 0 2mol L Tris EDTA 0 002mol L pH7 5 漂洗 1 次 每次 5min 6 2 SSC 漂洗 1 次 每次 5min 7 80 5min 氯仿浸泡 5min 再 80 烘干 2h 5 预杂交 将滤膜和预杂交液 起放塑料袋内密封 65 水浴 5h 6 杂交 1 将地高辛标记的 MDV pp38 基因探针放沸水中煮沸 10 min 再置冰中速冷变性 2 在塑料袋内留有适量