糖尿病是一种常见多发的慢性代谢性疾病.doc

大连医科大学2012届本科毕业论文糖尿病是一种常见多发的慢性代谢性疾病，最严重最常见的慢性并发症是糖尿病肾病，据资料表明，糖尿病肾病的发病率在国内占糖尿病的0.9%-36%1。 其早期肾脏病理改变大多是可逆的，但终末期糖尿病肾病的5年生存率小于20%7。因此及早预防及诊治DN至关重要2。以往，对糖尿病肾病早期诊断的常用指标有尿微量白蛋白、血清胱抑素C、血清高敏C反应蛋白、NAG、1-微球蛋白等，这些指标虽有助于DN的诊断，但缺乏特异性和灵敏性。而早期肾小球微穿刺又因为操作复杂，过程痛苦等原因不易被患者接受8。因此，寻找一种灵敏度高，特异性强的诊断指标迫在眉睫。本文测定了31例糖尿病早期肾脏功能受损患者、33例糖尿病非早期肾脏功能受损患者和25例健康人血清抵抗素含量，现将结果报告如下：一、 材料与方法1.1标本来源大连医科大学附属第一医院内分泌病房2型糖尿病患者血清，其中男30例，女34例，年龄2080岁，所有研究对象在取样前均排除大血管病变, 排除患有急慢性感染、心功能不全、肝肾功能不全、原发性肾小球疾病及其他自身免疫性疾病者, 排除使用胰岛素及胰岛素增敏剂者。各组对象的性别、年龄等一般临床特征比较差异无统计学意义（P0.05）。具有可比性。根据AM/Cre将2型糖尿病患者分为2组，AM/Cre在30300之间31例，男22例，女9例。AM/Cre30的患者33例，男13例，女30例。另设健康对照组25例，其中男18例、女7例，均从大连医科大学附属第一医院健康体检人员中筛选，排除糖尿病、高血压病、肾病等其他相关疾病。血样要求:所有实验对象均在空腹12h以上于清晨抽取肘静脉血2ml加于肝素抗凝管中，离心分离，取抗凝血清置于-70C低温冰箱中待测定抵抗素和血清胱抑素C。所有血样均来自大连医科大学附属第一医院检验科。尿样要求：取晨尿10ml，3500r/ml，离心10min，取上清液检测尿微量白蛋白（mALB）。1.2主要试剂1.2.1ELISA试剂盒：北京奇松生物科技有限公司生产，批号为2011002B。13主要仪器设备及耗材（1）瑞士Tecan Sunrise酶标仪：早稻田(北京)生物科技发展有限公司上海办生产。（2）洗板机：早稻田(北京)生物科技发展有限公司上海办生产。(3)高精度加样器及枪头：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul（4）37C恒温箱（5）BN免疫特种蛋白分析仪：上海SIEMENS公司生产。（6）日立7600全自动生化分析仪：北京九强生物技术有限公司生产。1.4试验方法1.4.1ELISA法测血清抵抗素含量从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4C。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。将浓度依次为0 ng/ml，3 ng/ml，6ng/ml，12 ng/ml，24ng/ml，48ng/ml，的标准品50ul分别加入标准孔，将待测血清10ul分别加入待测样品孔， 再加样品稀释液40ul，空白孔不加。除空白孔外，标准品和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100ul，用封板膜封住反应孔，37C恒温箱温浴60分钟。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上排干，如此重复洗板5次。依序每孔加入底物A、B各50ml， 37C避光孵育15min。依序每孔加终止溶液50l，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。1.5高灵敏度的动态散射免疫比浊原理检测尿微量白蛋白使用SIEMENS公司BN免疫特种蛋白分析仪分析测定，试剂采用上海SIMENS医学诊断产品有限公司液体试剂,质控品、定标品均由西门子公司提供，检测方法：散射免疫比浊法。1.6乳胶颗粒增强免疫比浊法血清胱抑素C测定采用日立7600全自动生化分析仪分析测定，试剂采用北京九强生物技术有限公司双液体试剂，质控品，校准品由该公司提供。检测方法：乳胶颗粒增强免疫比浊法。1.5统计学处理采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料数据以xs 表示，两组比较分析采用t检验； P0.05为差异有统计学意义。阳性率比较用.二、结 果2.1血清抵抗素的检测结果酶标仪分析得出的标准曲线见图1，糖尿病肾功能正常组（M1）与糖尿病肾功能早期损害组（M2）的血清抵抗素含量差异有显著统计学意义（P0.01，见表1）。三组血清抵抗素含量平均值的直观分布图见图2。2.2糖尿病肾病早期诊断指标阳性率比较 离群值？健康者（M3）的血清抵抗素含量为27.16.5，包含95%健康者（M3）的范围视为本次试验血清抵抗素含量的正常值范围。下限是14.36，上限是40.63。各组研究对象的血清抵抗素含量与正常值范围比较，高于上限值为阳性结果。经计算，血清抵抗素阳性率为67.7%。又测得糖尿病肾功能早期损害组尿微量白蛋白阳性率为73.9%，血清胱抑素C阳性率60.9%。因此，肾脏功能早期损害的诊断指标阳性率由高到低依次为：尿微量白蛋白、血清抵抗素、血清胱抑素C。图1:经过酶标仪分析得标准曲线表1：各组抵抗素含量测定结果（n=89,xs）组别例数血清抵抗素（ng/ml）糖尿病肾功能正常组（M1）3334.48.64糖尿病肾脏早期损害组（M2）3143.578.47*健康对照组(M3)2527.16.5注：？与M1组比较，*P0.01图2：各组抵抗素含量测定抵抗素含量测定34.48.6443.578.4727.16.501020304050M1M2M3分组浓度M1：糖尿病肾脏功能正常组M2:糖尿病肾脏早期损害组M3：健康对照组三、讨 论抵抗素是一种由脂肪细胞分泌的多肽类激素，有研究显示抵抗素是一种与肥胖、糖尿病有关的重要激素，其作用是对抗胰岛素，促使血糖水平升高、脂肪细胞增生而导致肥胖。新近研究显示，抵抗素主要表达在单核细胞上，能增加其他致炎因子和粘附因子的表达，是一种炎性细胞因子13-15。有研究显示循环中的抵抗素水平与炎症标记物相关，而低度的炎症反应在慢性肾脏病的进展中起到一定作用。抵抗素可增加内皮素、粘附分子、和他内皮活性物质和炎症介质的表达。这些通过抵抗素诱导的体液性介质可促进全身性血管功能紊乱，进而影响肾小球滤过率和尿蛋白排泄率2-4。糖尿病肾病，是影响糖尿病患者生活质量及寿命且耗资巨大的严重微血管并发症之一。是糖尿病最常见和最早期的并发症，在发达国家已成为终末期肾病的首要原因。在我国糖尿病性肾病已占糖尿病患者总数的15%左右，且以每年8%-10%速率递增16,17。已成为导致慢性肾衰竭的第3位疾病，接受透析治疗的终末期肾病患者15%，是由糖尿病肾病所致。糖尿病肾病的发生与发展和其他慢性并发症一样，是多种因素综合作用所致。多研究表明，在糖尿病肾病的发生、发展中，炎性反应起着重要的作用。有研究表明糖尿病患者血清抵抗素水平与血管内皮功能紊乱相关。Verma等及Kawanami 等在体外实验发现，人抵抗素可促使血管内皮细胞表达细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、分泌单核细胞趋化蛋白-1，促进内皮素-1分泌，提示抵抗素可作用于血管内皮细胞，导致其功能紊乱5,6。糖尿病肾病早期肾脏病理改变大多是可逆的，因此及早预防和诊治是至关重要的。以往，我们常用微量白蛋白、血清胱抑素C、NAG等作为糖尿病肾病早期诊断的常用指标，但是尿微量白蛋白缺乏特异性。血清胱抑素C特异性和灵敏性较差。而NAG在服用某些药物(如氨基糖甙类抗生素、镇痛剂)或合并感染时尿NAG也会增高。目前临床常将MA/Cre作为糖尿病肾脏早期损害的监测指标。虽然其稳定性好，测量不受时间限制，对糖尿病患者肾脏损害有早期诊断价值，但此检测方法一般需要检测连续三天患者的晨尿中微量白蛋白与尿肌酐的含量，既增加了患者的经济负担又使门诊患者不易做到以上要求，使得患者错过了早期诊治的时机，给患者造成了巨大的生理和精神痛苦，加重了社会经济负担。而早期肾小球微穿刺又因为操作复杂、过程痛苦等原因不易被患者接受。因此，寻找一种能够比较灵敏地反映早期肾功能改变的诊断指标迫在眉睫。本实验发现，糖尿病肾早期损害患者血清抵抗素含量明显高于糖尿病肾功能正常患者（P0.01，见表1），这说明随着糖尿病肾功能损害程度的发展，血清抵抗素水平逐渐增高。抵抗素可能作用于血管内皮细胞，导致其功能紊乱并参与2型糖尿病肾病微血管并发症的形成与恶化。因此可尝试通过降低抵抗素水平减轻血管内皮功能紊乱来保护肾组织，从而阻止或延缓糖尿病肾病的发展。微量白蛋白在M2组的阳性率为73.9%，高于血清胱抑素C阳性率和血清抵抗素阳性率。尿微量白蛋白是肾脏早期血管功能受损的标志，其阳性率高，即能预测真正患病的正确率高（结果不稳定）。血清抵抗素在M2组的阳性率为67.7%，其在糖尿病肾功能早期损害患者中预测真正患病的百分数低于尿微量白蛋白但高于血清胱抑素C。虽然血清抵抗素在M2组阳性率低于尿微量白蛋白阳性率，但是血清抵抗素含量测定能克服尿MA特异性低，门诊患者不易多次检测求证等弊端。因此，血清抵抗素和尿微量白蛋白联合检测对糖尿病肾脏早期损害具有积极的诊断价值。文中没有证实因为本次试验人抵抗素ELISA检测试剂盒微孔酶标板96孔配置有限，约三分之二微孔用于检测M1组和M2组血清抵抗素含量，因此健康对照者数量有限，可能会对正常参考值范围有一定影响。今后待补充健康对照者血清抵抗素含量，完善试验结果。四、结 论1.随着肾功能损害程度加深血清抵抗素水平逐渐增高。文中没有证实2.糖尿病肾早期损害患者的血清抵抗素水平明显高于糖尿病肾功能正常者，经统计学分析有显著性差异（P300mg/d、肾小球滤过率下降和血压升高。一旦发生显性肾病，若未予干预，肾小球滤过率在数年内将逐渐下降，下降速度因人而异（2-20ml/min/year）4。Mogensen 将糖尿病肾病的演进分为5个阶段1.第1期以肾小球的高滤过和肥大为特征。2.第2期有肾小球细膜扩张和基膜增厚。3.第3期可检出微量白蛋白尿（20-200ug/min）伴血压从基础水平升高。4.第4期出现临床蛋白尿（200ug/min）和高血压。5.第5期为ESRD.健康人的平均UAER是5ug/min，且很少超过15ug/min,UAER在20-200ug/min(30-300mg/d)时定义为微量白蛋白尿，这与20-200mg/l的水平是一致的1。肾病的最初几年，其特征是持续加重的微量白蛋白尿（UAER为30-300mg/d或20-200ug/min），这时只有通过特殊的检测方法才能检测到。肾小球内压力增高是肾病初期的主要病理改变。微量白蛋白尿是糖尿病肾病早期诊断的敏感指标。微量白蛋白尿预示了2型糖尿病患者肾病的发展。在对糖尿病患者4年的研究中，持续微量白蛋白尿出现后，白蛋白排泄率以15%-40%的速度持续增加3。2型糖尿病肾病患者中，有很高比例的患者在诊断为糖尿病同时，就已经存在微量或显著蛋白尿，这主要是因为在做出诊断之前，患糖尿病往往已经有数年的病史了1。二、抵抗素的研究现状脂肪细胞可分泌瘦素、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、脂联素等物质，调节机体的能量代谢，在胰岛素抵抗发生过程中发挥重要作用。肥胖与2型糖尿病高度相关，但是联系肥胖和糖尿病的确切分子机制仍不十分分明了。Mogensen在研究抗糖尿病药物噻唑烷二酮类药物时，发现脂肪细胞可分泌一种肽类激素分子抵抗素，引起了人们的广泛注意。它是一种富含半胱氨酸的蛋白质，定位于染色体19p13.3，属于抵抗素样分子家族（RELMs）4。 1 RELMa家族 RELMs家族（人和大鼠）都富含Cys。是由105-114个氨基酸组成的蛋白质，包括RELM-/FIZZ1和RELM-/FIZZ3、抵抗素、FIZZ3。RELM-以单体形式分泌，其mRNA可在脂肪组织、舌、肺脏、乳腺等组织检测到，在炎症反应过程中也有表达4，但不在3T3-L1脂肪细胞中表达；RELM-是一种肠源性的分泌激素，在小鼠的胃肠道特别是结肠含量丰富，在增生的上皮细胞基因表达最多，尤其在发生肿瘤是明显的增高；抵抗素(Resistin)是由白色脂肪组织特异性分泌的一种促胰岛素抵抗的信号分子，约由114个氨基酸组成，分子量约为125 KD5。 2临床研究 抵抗素在肥胖非糖尿病患者腹部大网膜脂肪组织的含量与腹部皮下相似，均明显高于大腿脂肪组织。腹部脂肪组织抵抗素的表达上升，可能与腹型肥胖增加患T2DM的危险有关4。虽然有学者对于抵抗素是联系肥胖和2型糖尿病的危险因子提出质疑，但是不同的试验室测定方法可能造成抵抗素水平的差异，并且在不同部位脂肪以及种族之间，抵抗素对于胰岛素敏感性的影响有一定的差异。因此有关抵抗素的生物学特性、调节因素以及它在IR 形成过程中的机制将成为今后研究的热点，它的发现对于肥胖症和糖尿病的防治具有重要意义。三、2型糖尿病肾病与血浆抵抗素的关系抵抗素是一种由脂肪细胞分泌的多肽类激素,是 RSTN 基因编码的产物。抵抗素能拮抗胰岛素，促使血糖升高并导致脂肪细胞增生6。近年来人们认为DM存在严重的系统性炎性反应，进而抵抗素可能通过损害或抑制月细胞的胰岛素分泌功能，导致血糖升高2。新近研究显示人类的抵抗素主要表达在单核细胞上，是一种炎性细胞因子。抵抗素能诱导炎性液体介质如细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、单核细胞趋化蛋白-1等分泌，因此它与血管疾病相关的内皮功能受损关系可能更为密切。糖尿病肾病是指在糖代谢异常多年后，以血管损害为主的肾小球病变。多种因素综合作用导致早期糖尿病肾病发生15。据资料显示，炎性反应在DN的发生、发展中起着举足轻重的作用。现已证实内皮功能紊乱参与了2型糖尿病微血管病变的发生。因此抵抗素可能参与了2 型糖尿病的形成、与血糖控制不良程度相关并进一步参与糖尿病肾病微血管并发症的发展与恶化7。体外实验还发现，在单核细胞分化为巨噬细胞表型时，抵抗素的mRNA水平较分化前增加了4倍，这同样证实了抵抗素与单核巨噬细胞的功能有重要相关性的结论12。四、抵抗素对糖尿病肾病早期诊断的价值探讨对临床的意义以往，对糖尿病肾病早期诊断的常用诊断指标:1尿微量白蛋白(mAlb)；尿中微量蛋白有助于早期DN的诊断，但缺乏特异性7。 2血清胱抑素C；可作为肾小球滤过功能指标，其优点是不受炎症反应、性别、肌肉含量以及年龄变化等的影响，但特异性和灵敏性较差8。3血清高敏c反应蛋白；通过影响内皮功能使微血管病变，加速动脉硬化进展，因此血清高敏C反应蛋白作为一种炎症指标在早期糖尿病肾病患者诊断中具有重要参考价值，其缺点是特异性和灵敏性不高10。4N一乙酰一B一氨基葡萄糖苷酶（NAG）；在肾脏近端肾小管上皮细胞中含量特别丰厚，在肾小管损伤时由肾小管上皮细胞释出，是反映肾小管损害的指标之一，其缺点是服用某些药物(如氨基糖甙类抗生素、镇痛剂)或合并感染时尿NAG也会增高11。5MA/Cre；其优点是结果稳定性较好，测定不受时间限制，对糖尿病患者肾脏损害有早期诊断价值，但此检测方法一般需要检测连续三天患者的晨尿中微量白蛋白与尿肌酐的含量，既增加了患者的经济负担又使门诊患者不易做到以上要求，可能造成漏诊而延误病情12。以上各指标都有其优缺点，对糖尿病肾病的诊断不是很理想，而早期肾小球微穿刺又因为操作复杂、过程痛苦等原因不易被患者所接受13。现行临床应用较多的微量白蛋白与尿肌酐的含量比既费时又费力，这往往使得患者错过了早期诊治的时机，给患者造成了巨大的生理和精神痛苦，加重了社会经济负担。14因此，寻找一种灵敏高特异性强的诊断方法迫在眉睫。通过本研究可以进一步探讨抵抗素在糖尿病肾病早期诊断中的价值，从而为临床提供更科学更精确更快捷的实验室指标。因此，我们对抵抗素在糖尿病肾病早期诊断中的作用进行研究为找到糖尿病肾病早期诊断的最佳诊断依据迈出至关重要的一步。五、抵抗素测定在糖尿病肾病早期诊断中的价值展望尽管现阶段大量临床和实验证据都证明抵抗素对糖尿病肾病早期肾脏微血管受损的炎症反应有十分重要的调控作用，但是人们对这种作用的分子机制的了解甚少，抵抗素对糖尿病肾病肾脏微血管的炎性反应受体还未找到，使其研究受到很大限制。抵抗素在炎症反应中的具体作用，它与各种炎症因子相互作用的原理，其作用的实现途径等，这些问题还需要进一步的探讨研究。综述参考文献1.李保春，许静，袁伟杰.2型糖尿病性肾病.上海：第二军医大学出版社,2003.1-32.田延凤，马世瞻，孙文秀.早期糖尿病肾病患者血清抵抗素与血糖及血脂代谢的相关性分析疑难病杂志，2011，6（10）451-453.3.吴学飞，巢国祥，杨立坤.微量清蛋白的测定及临床意义.临床和实验医学杂志，2008,7（12）：7.4.周少玲，史虹莉.抵抗素的研究现状.国外医学内分泌学分册,2003,23(3):06-208.5.郑宪玲，催凤勤。檀增桓，孙存序，赵运果，张瑞清，王颖霞.初诊2型糖尿病患者血清抵抗素水平与胰岛素敏感性及血糖含量的相关性研究.中国全科医学，2006,9（21）：19770-1772.6.赵丽岩.2型糖尿病肾病与血浆抵抗素及胰岛素抵抗的关系.职业与健康，2010,26（2）:227-228.7.王涛，陈晓琴.尿微量蛋白检测在2型糖尿病肾病早期诊断中的价值.实用医技杂志，2011,18（3）：281-282.8.翟红艳，龙艳，苏珂.血清胱抑素C在糖尿病肾病早期诊断方面的研究进展.中国临床新医学，2011,4（6）：585-586.9.赵虎刚，糖尿病肾病早期诊断指标和治疗探析.甘肃中医2011,24（1）：1-3.10.Mcternan 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