1、胶乳偶联方案的输出.doc

方案一实验方法：一步法共价结合实验步骤：1、 配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；2、 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L；3、 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；4、 将上述蛋白质溶液与胶乳微球混合，混合后在温室培育20分钟；5、 用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10mg/mL（52mol/mL）；6、 取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中；7、 用0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液调整该反应混合液的pH值至6.50.2，在摇床温室培育2小时；8、 将未结合的蛋白质除去，贮藏于缓冲溶液中。方案二实验方法：简单二步法共价结合实验步骤：1、 配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；2、 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L；3、 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；4、 1mL胶乳微球悬浮液，加入20mgEDAC，在室温培育40分钟，在20分钟后第二次加入20mg/mL；5、 用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理；6、 将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/mL；7、 再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37搅拌反应3小时；8、 按1mL反应混合液加入2.5L乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；9、 除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中方案三实验方法：生成NHS-酯的中间体二步法共价结合实验步骤：1、 每ml反应混合物加入下列各物：a 去离子水是最后容积为1.0mL；b 0.1mL的10x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5（一般可用0.5M MES缓冲溶液）；胶乳微球最终浓度为1%（W/V）；c 0.23mL的50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液；d 19.2mg/mL（100mM）的EDAC在去离子水中的溶液2、 在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；3、 用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC；4、 重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）；5、 将结合的蛋白质溶于50-100mM的MES缓冲溶液中，浓度为1mg/mL；6、 立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%（w/v）、0.5mg/mL、25-50mM）；7、 将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌；8、 按1mL反应混合液加入2.5L乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；9、 除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮于适宜的贮存缓冲溶液中。附录试剂：MES缓冲液 500mM 和 50mM；PH6.1；4C 储存（如果发黄或者污染，应倒掉） 。 EDAC 盐酸 1乙基3二甲基氨基丙基二酰亚胺 ；52umol/ml：分析天平称取 10mg EDAC，加入 1ml 去离子水。 （EDAC 对潮气非常敏感，在水中快速水解，EDAC 储存于干燥器中，-5 C 保存。 ） NHS N羟基琥珀酰亚胺 ；50mg/ml 水溶液 蛋白质溶液 蛋白质充分稀释溶解，浓度为 110mg/ml 技术说明 ：1微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变； 单位质量的微球表面积（m2/g） ： A/M = 6/PD 其中 D= 微球粒径（m） P = 微球密度 (聚苯乙烯 1.05g/ml) 例如：0.8m的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.050.8 = 7.14 m2/g 1.6m 的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.051.6 = 3.57 m2/g 0.8L ，10mg 聚苯乙烯微球需加入 125250L 多克隆抗体 1.6L ，10mg 聚苯乙烯微球需加入 62.5125L 多克隆抗体 2虽然疏水性吸附与缓冲液 pH值无关，但反应缓冲液的 pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。在等电点 pH值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用； 3高效搅拌下，将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液，可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度； 4绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。 方案五Sample Protocol for Two-Step Carbodiimide Coupling of Protein to Carboxylated MicrospheresMicrospheres should be protected from prolonged exposure to light throughout this procedure.1.Resuspend the stock uncoupled microspheres according to the instructions described in the Product Information Sheet provided with your microspheres.2.Transfer 5.0 x 106 of the stock microspheres to a USA Scientific microcentrifuge tube.3.Pellet the stock microspheres by microcentrifugation at 8000 x g for 1-2 minutes.4.Remove the supernatant and resuspend the pelleted microspheres in 100 L dH2O by vortex and sonication for approximately 20 seconds.5.Pellet the microspheres by microcentrifugation at 8000 x g for 1-2 minutes.6.Remove the supernatant and resuspend the washed microspheres in 80 L 100 mM Monobasic Sodium Phosphate, pH 6.2 by vortex and sonication for approximately 20 seconds.7.Add 10 L of 50 mg/mL Sulfo-NHS (diluted in dH20) to the microspheres and mix gently by vortex.8.Add 10 L of 50 mg/mL EDC (diluted in dH20) to the microspheres and mix gently by vortex.9.Incubate for 20 minutes at room temperature with gentle mixing by vortex at 10 minute intervals.10.Pellet the activated microspheres by microcentrifugation at 8000 x g for 1-2 minutes.11.Remove the supernatant and resuspend the microspheres in 250 L of 50 mM MES, pH 5.0 by vortex and sonication for approximately 20 seconds. See Technical Note 1.12.Pellet the microspheres by microcentrifugation at 8000 x g for 1-2 minutes.13.Repeat steps 11. and 12. This is a total of two washes with 50 mM MES, pH 5.0.14.Remove the supernatant and resuspend the activated and washed microspheres in 100 L of 50 mM MES, pH 5.0 by vortex and sonication for approximately 20 seconds.15.Add 125, 25, 5 or 1 g protein to the resuspended microspheres. (Note: We recommend titration in the 1 to 125 g range to determine the optimal amount of protein per specific coupling reaction.)16.Bring total volume to 500 L with 50 mM MES, pH 5.0.17.Mix coupling reaction by vortex.18.Incubate for 2 hours with mixing (by rotation) at room temperature.19.Pellet the coupled microspheres by microcentrifugation at 8000 x g for 1-2 minutes.20.Remove the supernatant and resuspend the pelleted microspheres in 500 L of PBS-TBN by vortex and sonication for approximately 20 seconds. See Technical Note 2.21.Incubate for 30 minutes with mixing (by rotation) at room temperature. (Note: Optional perform this step when using the microspheres the same day.)22.Pellet the coupled microspheres by microcentrifugation at 8000 x g for 1-2 minutes.23.Remove the supernatant and resuspend the microspheres in 1 mL of PBS-TBN by vortex and sonication for approximately 20 seconds. See Technical Note 3.24.Pellet the microspheres by microcentrifugation at 8000 x g for 1-2 minutes.25.Repeat steps 23. and 24. This is a total of two washes with 1 mL PBS-TBN.26.Remove the supernatant and resuspend the coupled and washed microspheres in 250-1000 L of PBS-TBN.27.Count the microsphere suspension by hemacytometer.Calculation: Total microspheres = count (1 corner of 4 x 4 section) x (1 x 104) x (dilution factor) x (resuspension volume in mL)28.Store coupled microspheres refrigerated at 2-8C in the dark.Technical Note 1: Coupling can be performed in 100 mM MES, pH 6.0 with similar results. For some proteins, better solubility and better coupling may be achieved at a higher coupling pH or in a different buffer. If your protein does not couple satisfactorily under these recommendations, try PBS, pH 7.4 as an alternate coupling buffer.Technical Note 2: Either PBS-TBN (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4) or PBS-BN (PBS, 1% BSA, 0.05% Azide, pH 7.4) may be used as Blocking/Storage Buffer.Technical Note 3: Either PBS-TBN or PBS, 0.05% Tween-20 may be used as Wash Buffer. 附：蛋白质检测方法实验7 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。25分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.011.0mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会