穿膜肽的入胞效应 英文文献翻译.doc

穿膜肽的入胞效应2012/5/28穿膜肽的入胞效应摘要：穿膜肽(CPP)在关于如何将高分子转运到细胞内的理论及医药应用方面有着可观的潜力。现已归入CPP类别的数百种肽序列，HIV-Tat肽、穿膜体、转运体与八精氨酸代表了已被深入研究的几种变体。为了探究新机理以便提高穿膜效率，膜易位发生过程现在引起了研究者的广泛兴趣。有证据表明，许多被详尽研究过的肽能通过直接穿越质膜的方式转运它们自身，相对较小的转运物，甚至还可能转运大分子结构，其中可能包含细胞内吞作用通道或多通道的协助。这些看法着眼于最近的一些发现，如实验草案和显著影响穿膜能力的例子。其中转运物与入口的连接能够影响入口与细胞的相互作用。越来越多的证据表明小分子如荧光探针和疏水复合物如脂类、短肽被设计成为肽治疗手段是可行的。随着研究信息的获取，我们对于CPP与细胞的相互作用的认识与探索能力不断增强，这将加速其从体外实验转入临床应用的进程。关键词：穿膜肽（CPP），荧光团，光刺激，质膜，肽治疗目录穿膜肽的入胞效应11CPP分类与介绍32充分研究的CPPs53相关参数63.1固定假象63.2有效肽浓度74 CPP的膜效应74.1膜裂解74.2膜修复反应与其他下游效应84.3细胞表面糖与CPP的相互作用95荧光团与其他检测系统95.1荧光团95.2 CPP调解转运中的光刺激115.3 CPP的置换标记116 CPPs-肽治疗载体126.1肽货物效应127疏水性137.1短疏水序列137.2色氨酸137.3脂化138半胱氨酸和二硫化物桥149融合延展1410结论1411致谢1412参考文献141CPP分类与介绍“时间与环境允许的条件下，不要仅仅凭借表面接纳某种观点或徘徊在事物浅层，尤其是对那些与你的专业领域相关的事物，要钻研它深层的奥秘。” Issac Watts文献引证表明，越来越多的研究人员开始尝试利用CPP的穿膜特性向细胞内运输物质。CPP是一个常用来描述具有穿膜运输能力的由小于30个残疾构成的肽序列名词，PTD（蛋白传导域）是一个可代替这一名词的术语，它的应用反映了早期研究的变体是由蛋白质衍生而来的。其中HIV-Tat蛋白就是一个非常重要的例子。它的大量功能都被其传导域调控着，包括内化入细胞、被细胞内吞作用吞入、内逃逸作用、迁移入核与连接RNA作为转录启动子。区区一个少于二十个残基构成的短肽作为转导结构域能完成这些功能的调控，还能与已知的多达250个结合伴侣相连。膜迁移启动序列(MTS)是另一种命名方式，但自从2003年被提出至今，这一术语带来了许多困扰。究竟哪一种定义与相应命名才是最能表述此种多肽序列的呢？这将是接下来很长一段时间的争论点。而本文中我们按大多数研究惯例，在无特殊声明的情况下将其称为CPP。但对于某些特殊的多肽类，如昆虫毒液、蜂毒素及在低pH条件下表现跨膜能力的phlip肽，它们是否能被称为CPP这个问题仍待商榷。此外，抗菌肽也有与CPP类似的物理特性与相似的作用机理。因此，使用CPP作为术语来表述仍存在许多缺陷，而且相较于其它符合CPP定义的抗菌肽与膜活性肽的研究，才被探索20年（到2008年）的CPP起步晚了良久。其中诸多奥秘仍有待进一步发现。表1. 本综述中所提及的所有多肽图1. 表1中某些多肽疏水性与正电荷含量的关系添加货物肽能显著影响CPP的特性。例如在R8(23)上添加一段(klaklak)2序列形成R8-PAD(28)，在增加正电荷含量的同时提高其疏水性，而在Tat(22)上添加一段HA2(26)却在减少正电荷含量的同时提高了疏水性。相反的是在IKK(25)与NFKB(27)中之表现了电荷含量的改变。添加货物肽引起的肽特性改变可能对整体吸收情况都产生了巨大影响。表1中描述了几百种能被宽泛称为CPP的多肽序列中的一部分，所有表内涵盖的多肽序列都具备将小至荧光探针、大至微粒的货物运入细胞的能力，介于二者大小之间的还有数以千计的生物活性实体，如多肽、蛋白、核酸等有治疗作用的物质可以被运入细胞，或亚细胞隔间。运输过程中，CPP可与货物以共价方式结合，通过静电力作用发生转运，也可作为结合物，用于病毒、脂质体的应急运输途径。值得注意的是，CPP不仅可以在货物最初摄入细胞时发挥应急运输作用，还能进一步促进其内逃逸。大多情况下被运入细胞的物质的作用靶点位于细胞核系统外，因此运入货物的逃逸能力尤为重要，而CPP恰能发挥其影响物质摄入与促进物质逃逸的双重作用。这种情况下，CPP运载的货物可能直接经由CPP介导的转运跨过质膜而非通过细胞内吞作用，便能在核外系统观察到或发挥作用。最近数量相当可观的综述文献对于CPP运输生物活性货物的应用都作了阐述，越来越多证据表明它们也可作为多领域影像采集工具，尤其在肿瘤学领域。这意味着其可能发展出新用途，不仅如此，CPP运输物资的对象范畴也有望从哺乳动物类扩展至植物、线虫乃至细菌。图2. CPP与细胞的相互作用及其进入细胞的过程CPPs的内化作用已被证明是由包括胞饮作用、其它能引起细胞内标注作用的内吞途径在内的多种机理促进完成的。此作用可能以肽与肌动蛋白的结合引起质膜重排为起始，而此种结合作用可能发生在外来肽与质膜结构间，也可能发生在细胞内部。进入细胞后，CPP的细胞质标识可能是通过胞内逃逸作用或直接迁移完成的。影响CPPs摄入的外在因素有血清蛋白与膜多糖。2充分研究的CPPs在众多已知的CPPs中，只有一部分已被深入而广泛的研究，其中包括HIV-Tat肽、穿膜体、转运体、转运体缩短变体TP10，pVec，MAP与精氨酸残疾的重要单元，如最具成效的R8、R9。这些变体中基础残基非常常见，最为充分研究的一个变体，R8（即八精氨酸），呈明显阳离子型。寡精氨酸最适宜细胞摄入的比度介于7-9个残基之间，此范围外比度的增减会降低摄入效率。精氨酸形成bidendate氢键的能力的重要性已被认识到，而最近对HIV-Tat的研究数据表明使肽与质膜联系最大化的肽环化反应能提高迁移的能力。绝大多数被深入研究过的CPPs都具有显著的阳离子特性，但在非合成的天然体系中，阳离子残基常被疏水残基分隔开。此种间隔在某些情况下可使CPPs倾向于在水溶液中形成两亲性螺旋。疏水性对于穿膜能力有非常重要的影响，事实上确实有一些CPPs有明显疏水性，并十分缺少正电荷。例如PFDYLI肽与卡波济维母细胞生长因子衍生的长序列。出去常见的阳离子CPPs外，一种被称为SAP(E)的CPP在最近的研究中被发现也具备在一系列细胞株中转运荧光探针的能力。虽然部分穿膜肽已经得到了详尽细致的研究，但从其与细胞外围的连接究竟基于糖类还是脂类，到其进入细胞的途径是通过内吞作用还是直接跨质膜，关于穿膜肽细胞动力学的研究在方方面面都存在争议。而另一缺陷则存在于穿膜肽类进入细胞后的研究中，进入细胞后具体发生了什么，细胞又是如何控制到达细胞质乃至细胞核及其它细胞器后的肽的，这一系列胞内过程都还未得到充分研究。首先，许多病原体或病原体蛋白可以先以细胞内吞的方式进入细胞，然后利用核内体的低pH等条件改变构型，进而与内溶酶体膜融合进入胞液。基于这一现象的发现，结合较大货物，如蛋白质的CPP也被广泛的认为符合此机理。但此机理又难以获得确凿证据，因为在胞内逃逸的真实时间测量方面仍存在巨大技术难点。不过确有证据表明CPP-蛋白变体可进入胞液与细胞核，这一发现基于在细胞装置环境中导入CPP-货物后迁移数小时的读出数据。然而新的争议也随之产生，既然CPP肽可穿透胞内体膜，那么其也可以穿越质膜。但与时间测量相似，在此过程中对于穿出质膜与在胞内释放的肽数量之比测量也存在技术难关，尤其当位于细胞上的肽数量本身就少，而即使已经通过内吞作用进入细胞的肽也可能再逃逸入胞液。其次，内吞作用本身对于CPPs摄入是否起必须作用，若确为必须，何种机理更为常见，CPPs如何逃出核内体（假设其确能逃逸），都是引起争议且难以决断的问题。最后，虽然细胞生物学领域仍在持续不断的揭示发现新的内吞作用途径，但每条途径的特定探针的鉴别、减弱某一单独途径的方法都是进展十分缓慢的过程，这一不足目前对鉴定CPP与其它递送药物的载体作用通路都产生了阻滞。通常情况下，氨基酸序列、作用机理与CPP穿膜能力之间的关系难以被清晰描述，然而文献表明，似乎实验装置环境中的或CPP序列的微笑改变可能对这些CPP实体的细胞动力学性质产生明显影响，这一发现或多或少带来了一些曙光，下文中将就这些产生深刻影响的方面逐一进行阐述。3相关参数3.1固定假象不得不说当荧光蛋白的高效率入胞及入胞后的核内高浓度聚集被发现是与将细胞固定引入研究方法相关时，整个CPP研究领域都被或多或少的地整动了。在此发现之前，学术领域倾重于接受细胞的摄入是一个不消耗能量、不依赖于细胞内吞作用的过程。而应用固定方法后的结果中，细胞内吞作用体现了重要作用，胞质中的肽也是由内吞或穿出胞质膜的方式初始进入细胞内的。这些实验中细胞并没有像原来那样在显微镜检或是流式细胞分析前先被固定，而且在通过流式细胞分析仪时细胞经历了肝素冲洗以及胰蛋白酶分散，来确保进入细胞的肽数量测定更为准确。这一操作对于阳离子型变体更为重要。虽然细胞膜上某些镶嵌肽段可能对胰蛋白酶存在抗性，如D型肽段存在时细胞膜不能被胰蛋白酶裂解，但此项技术仍已凭借突出优点成为了本领域一项规范技术。3.2有效肽浓度本实验可在含有血清的，加入1100M浓度已合成荧光团的CPP肽段的原细胞培养基中进行。当CPP阳离子变体被加入实验环境后，其能非特异性地与距离最近的负电荷如血清蛋白中的白蛋白结合，结合后产生的CPP降低了细胞对其摄入效率，因为实质上其减少了有细胞结合活性的游离肽数量。但对于在受体介导的胞吞作用中被内化或存在于胞饮液相中的蛋白结合的肽段而言，此种结合也是入胞机理的一种。 载体或被运载物二者中任一或二者皆对蛋白酶或核酸酶敏感时，评估其被摄入能力的介质中应剔除血清，以便创造使该转运系统完整地到达细胞表面的机会。事实上CPPs即存在对酶降解不同程度的敏感性，因此在体外实验中常用无血清技术。反之某些CPP将以惊人速度降解，例如MAP与穿膜件在接种入细胞培养基30分钟后即仅存在25%完整的未被降解的活性肽，而二者在CHO细胞的对比实验中被降解的更加迅速，前者半衰期为10min，而后者仅为5min。然而，加入牛血清白蛋白后情况发生了改变，MAP降解减慢，但穿膜体仍在以相同速度被降解。CPP摄入速度与肽浓度有关外，还与肽和细胞的比例相关。4 CPP的膜效应4.1膜裂解现存一种被广泛接受的说法指出，在特定的实验条件下一些CPP可以直接穿透细胞的质膜。CPP介导的毒性，提高质膜的通透性，也学能解释此种现象。在一个利用寡精氨酸进行了详尽研究的实验中，D型肽显示了远超出L型肽的摄入量，但与此同时，实验表明有无碘化丙锭（常用防渗染料）存在于CPP的有效入胞量影响不大。另一个以白血病细胞为研究对象的实验中，2M胞外浓度的肽可以标示出包括 与溶酶体的泡状结构，当浓度上升到10M时则可以均匀标示整个胞质与核。（图3）然而也有例外，如下图中显示的，此类肽的标示作用存在种群差异性，对于某些细胞而言，当肽浓度高达10M时胞质与泡状结构标示仍均能完成。在此高肽浓度时碘化丙锭不能进入细胞。忽略基质中血清影响的情况下可通过进一步提高肽浓度验证粘着细胞株的此现象。图3.精氨酸-Alexa488的胞吞与直接迁移 持续1小时暴露于2M R8-Alexa488后，急性骨髓白血病KGla细胞表现出胞吞作用摄入肽的典型特征-点状结构。浓度上升后仍可见胞吞摄入的证据，但远不如胞质标示-非依赖胞吞作用的碎片入胞特征明显。DIC-直接干扰对比显微镜；比例尺-10M。 膜裂解作用还有以下几点支撑证据。其一，Tat与R9在粘连的Hela细胞中表现了不同的标识作用，10M时泡状标识占主导地位，20M时胞质标志则十分明显。而穿膜体则在浓度达到20M是仍大幅度限于泡状标志。此点差异表明变体的阳离子性越明显，迁移跨越质膜的能力就越强，因为胞吞或伴随之发生的内逃逸都无法在相对较短的时间内（30min）产生如此明显的胞质标志。其二，对于R9而言，如此高浓度的肽可能引起局部膜裂解或损坏而不是整个细胞的泄露，而这一局部的伤口，或成核区，会成为“肽流”稍后流漫到整个胞质的大门。这些现象都不能代表所有细胞系中CPP的入胞特性，进一步研究有待开展，但已可以表明虽不像著名的膜裂解剂如肥大脱粒肽那么强效，特定浓度与环境下的CPP确实具备一定的膜裂解能力。CPP的反逆形式或/和CPP运载物在鉴定摄入或胞内锁定的特异性的尝试中已被广泛研究。最近一些包括穿膜体在内的反逆CPP的显著细胞毒性被发现甚至强于母肽，使寻找CPP介导效应中的适宜控制序列的研究露出了一些曙光，详情将于本文6.1部分讨论。而这一细胞毒性的调控作用是通过何种机制完成的一直是细胞与非细胞体系及分子建模研究领域的热点。4.2膜修复反应与其他下游效应CPP具备直接穿膜迁移的能力是在早期对R7、Tat与穿膜体的研究中被证实的。如果肽段是由质膜孔中穿入的，那么细胞接种CPP后介导胞质中的修复囊泡产生膜修复效应一事即可以得到合理解释。此种机制是被胞内高钙浓度激发的，其在产生膜修复作用的同时还可能产生其它种种有待分析研究的效应，如促进TNF受体内化、抑制蛋白的活性等。基因组与蛋白组研究有望揭示更多CPP效应的利弊特性。不同细胞系变体对于CPP介导的细胞毒性反应不同，研究表明不粘连的细胞系更为敏感，整个不粘连细胞的表面暴露于肽段的几率是相同的。这一发现也解释了为何CPP在较低浓度时即可以穿入该细胞系质膜。此外，不粘连细胞在冰上试验中显示出了允许CPP以非内吞作用内化标志胞液的能力。这种不耗能的摄入方式在其它细胞系中也有发现。4.3细胞表面糖与CPP的相互作用除与血清蛋白结合外，CPP的截存也可被带负电的碳水化合物，如位于膜上的HSPGs介导。在Tat接种的无乳化转移活性也不能合成粘多糖的仓鼠卵巢(CHO)细胞及其变体(CHO pgsB-618)研究发现，这些负电基团围困住了阳离子型的CPP变体，因而减少了流失到脂质小叶中的肽段数量。与之相反的是，HSPG合成缺陷型细胞被发现阳离子型CPP内化能力减弱。事实上，整个HIV-Tat蛋白都无法进入。然而因为现有条件无法全面阐述pgsB-618细胞或其普遍替代品CHO pgsA-745的胞吞特性及膜合成机理，无法排除这些方面的不同会产生比膜表面糖更显著影响的可能性。细胞摄入CPP需要HSPG暗示了其也许可能与CPP结合进而促进内化，膜表面糖在其它CPP，如蝎子毒液中的一种由三个二硫化物桥构成其三级结构的超长肽序列Maurocalcine的摄入中也起重要作用。证据表明特定实验条件下，某些CPP可以借助与膜糖结合介导膜波动与巨胞饮。HIV-Tat嵌合体进入预计可发挥作用的核区后，可通过两个loxP位点的重排效应介导GFP效应。在CHO细胞与pgsA-745变体中该嵌合体也可以发挥相同效应，表明膜糖可能为穿膜作用的非必须结构，是否需要其参与是由肽浓度决定的。胞外肽浓度为1M时，对照组细胞与粘多糖(GAGs)和唾液酸表达缺陷型细胞的摄入量无差异。当肽浓度达到10M时，GAGs缺陷型细胞肽摄入减少，但唾液酸缺陷型胞内肽量却略有增加。三种最为充分研究的CPP、R8、HIV-Tat、穿膜体还是显示出了对于膜表面受体SDC4（多配体聚糖4抗体）的亲和力。慢性骨髓性白血病细胞中多配体聚糖过量合成，流失细胞计数表明这些细胞中该三种肽摄入增多。带负电荷的蛋白聚糖肝素可以干扰MPG与其核苷酸货物DNA之间的静电作用。因此，细胞表面糖对CPP结合与摄入、货物运载方面都起到了多种多样的作用。5荧光团与其他检测系统5.1荧光团大多数CPP细胞摄入的研究都借助了肽与荧光团的共价连接，部分广泛应用的荧光团已于图4中列出。如图所示，Alexa染色剂是一种应用日益广泛的肽标识试剂，其适用变体的检测范围包含紫外到远红外以及红外790nm区域。除了相同的Alexa前缀外，这些荧光团的结构与物理性质方面存在一定差异。例如，Alexa568含有与德州红样的六元环，Alixa647含有两个被长烯烃链分隔开的吲哚环，疏水性显著下降。荧光团在人工合成的膜中，体内外细胞实验中被用来研究膜动力学，其可能促进也可能抑制CPP的摄入，图4示明了他们的分离系数（Log P，利用未电离化合物算得到不依赖于pH的疏水性）与扩散系数（Log D 7.4，利用化合物电离程度算得到pH为7.4时的pH依赖性疏水性）。两组测量值都是荧光团与肽结合的重要参数。此外，荧光团之间的激肽寿命、光漂白敏感度、受外周水溶液影响的pH敏感度都有所不同。pH敏感度对于需在胞吞作用分区中定量测定荧光的内吞作用研究。pH低于4.5的溶酶体研究中尤为重要。FITC的量子场被溶酶体pH抑制了高达70%。将荧光团连于CPP上的连接桥也可能带来附加效应，比如能将肽上的氨基与荧光团连接琥珀酰亚胺酯，将肽上胱氨酸与荧光团以较长桥连接的顺丁烯二酰亚胺。后者形成的荧光团比前者疏水性强，但是否有其他效应存在仍待研究。图4：荧光团及其CPP附加物的结构与疏水性研究（A）初始荧光团及连接顺丁烯二酰亚胺（M）、琥珀酰亚胺酯（SE）、异硫氰酸酯（ITC）官能团后的结构与疏水性；（B）三种官能团的结构及其未指明肽的标识反应；（C）文中其他CPP修饰的结构及疏水性；Log P、Log D 7.4的计算由Maruin（5.8.0 2012 版）Chem Axon 完成。荧光探针的影响在接种了穿膜序列Dmt-D-R-F-K的人结肠癌Caco-2的细胞中被评估。实验中端基赖氨酸被基于相对较小的氨基酸的荧光探针DNS或ATN所取代。与其它CPP的主流研究相比，DNS与ATN的选择显得非同寻常，二者在亚细胞中的分布有所不同。DNS引起了线粒体肿胀乃至细胞死亡一项最近的实验中研究了在合成的R6序列中插入荧光探针与GUVs作用的效应。肽本身在特定的肽/脂比例下可以允许GUV内的膜不可渗染料的快速逃逸，因而具有膜干扰作用。然而在特定的实验条件下，在R6中加入FITC或利用单个色氨酸残基延长序列（R6W）改变了肽膜作用。染料在不破坏膜的作用下通过形成小孔缓慢释放。在不同环境中，这些小孔也可能允许连接了此类CPP的短肽序列通过，但较大货物如整个的蛋白质仍被排除在外，如4.1中所提及的R8及Tat-Alexa488，显示了直接穿越细胞膜的能力，但对于其是通过小孔的形成还是其它直接迁移的方式穿过质膜这一问题仍有争议，核区的必要性也未可知。荧光标记的苯基丙氨酸被用来研究D-FR8F及D-FITC-GABA-FR8F标记的肽的摄入。其中FITC凭借其疏水特性提高了肽摄入。阳离子型的CPP可以与特点的荧光团产生协同作用。连接了四甲基硅烷的CPP能破坏细胞所有膜结构，而不是像其它CPP只能破坏内体膜结构。有趣的是此效应只发生在富含精氨酸的CPP中（HIV-Tat及R9），连接相同荧光团的R9就无此效应。这可能是因为单态氧能在保证整体细胞不被破坏的前提下产生微妙的干扰。精氨酸是否作为一项附加因素介导了此项膜弯曲有待探讨。精氨酸的胍基与带负电荷的磷酸头部的结合引起了弯曲，而赖氨酸的氨基无法产生此效应。5.2 CPP调解转运中的光刺激连接到荧光素等光敏剂上的发光CPP，在共聚焦显微镜下可被观察到促使荧光团从囊泡结构向胞液的重分布。这一发现为用同一方法研究所有内逃逸的妄想敲响了警钟，但同时也为CPP的荧光探针与光效应应用于治疗疾病带来了希望。例如若丹明（红色荧光染料）标记的Tat-GFP，其被证明可以通过PCI（光化学同化）进程后提高胞质内CPP含量。若丹明接受的光刺激产生了氧类物质，它可以破坏囊泡结构，释放Tat-GFP如胞。另一项研究中，某种含有Tat-Alexa546的结构受光刺激后可以将siRNA转运入细胞。5.3 CPP的置换标记放射性同位素标记的肽也可以用来监控细胞摄入，其可以减少荧光探针的使用，但与此同时肽在亚细胞中的定位却变得更加困难。，一项基于生物素标记肽的亲和纯化技术应运而生，随之出现的还有抗生物素蛋白依赖的分离技术、质谱分析技术。生物素标记技术中，肽被一段N端延伸序列生物素-Gly-Gly-Gly-Gly-标记，这使链霉亲和株在实验厚分离成为可能，也使之后的离子化质谱分析校准肽中氘化型得以进行。此过程得到的数据域荧光团标记方法中得到的大相径庭。生物素本身即为疏水性基团，其疏水性介于Alexa488与TAMRA之间，其受体与转运体也已被发现并应用于药物运输，因此此种CPP修饰方法可能自身便存在一些缺陷。寻找符合CPP修饰标准的方法仍然是一道难关。事实上因为CPP研究的热点是其转运货物的能力，关于标记探针的信息中，只有不将重心放在个体数据上，而是关注CPP与细胞作用的一致性才是具备一定研究价值的。6 CPPs-肽治疗载体肽类作为细胞内靶标有十分巨大的潜力，其设计依赖于蛋白间相互作用，而因其具有高亲和力、高选择性，进入细胞后便可介导相应生物反应。但问题在于，绝大部分蛋白在无合适载体情况下无法作用于胞内靶点。CPP的出现带来了希望，但实际操作并不一帆风顺。具备CPP转运潜力的模型多达成百上千个，但其临床应用进展缓慢，这也许是因为CPP难以被驯服到只作用于体内特定（癌）细胞的程度。一些CPP嵌合体，比如KAI-9803(-V1-1)可以PKC为靶点。减轻疼痛，XG-102(DJNKI-1)可对抗失聪与中风，已进入临床研究阶段。随着越来越多的蛋白被划入研究范围，对其研究水平也提升至它们与其它蛋白的特异作用，其作为治疗癌症的良药潜力无限。而肽类正是依靠模仿这些蛋白相互作用来调节细胞行为的不二选择。6.1肽货物效应胞内荧光团可影响CPP代谢，其它连接在CPP上的肽序列也可能产生影响。这一效应在PKI序列中尤为明显，抑制蛋白激酶A的PKI被连接到穿膜体、转运体、寡精氨酸(R11)与HIV-Tat上，以便研究其对于一系列癌细胞的作用。连接到靶序列后，R11的CPP入胞能力减弱，但转运体情况却相反。此研究同时表明未运载货的CPP连接入细胞后毒性尚不明确。在另外一项研究中，一个从Nur-77中的Bcl-2作用部分衍生出的9残基序列被连接到了DR8上，这使得Bcl-2从防止细胞凋亡的守护者变成一个细胞杀手。丧失活性的对照肽可由将D-NuBCP-9-r8货物首尾两残基变为丙氨酸获得。然而后续实验中发现货物N端苯基丙氨酸缺失对于肽的初始内化有显著影响，并能促进不依赖于Bcl-2的细胞死亡。（KLAKLAK）2也被称为细胞凋亡域，最初被用做革兰氏阴阳性菌的杀菌肽,MIC为6M其在浓度高达大于500M时对哺乳动物细胞无毒性但后期被证明与肿瘤导引肽结合时可介导细胞死亡。其原理可能是介导线粒体损伤，但其到达靶细胞胞质的机理尚不可知。该序列曾被连接至一系列CPP如PTD-5、穿膜体、R6W3和R7/R8上以提高入胞能力，但其在微摩尔浓度即显示细胞毒性，在暴露于R8-（KLAKLAK）2后立即分析细胞，发现此肽在10min内即可引起严重的质膜重排，因而使得碘化丙锭更易透入膜。R8和（KLAKLAK）2单独实验时无毒性，有趣的是CPP和PAD之间的糖基化肽可以显著减弱CPP转运货物的能力，并介导细胞死亡。大量商业化CPP嵌合体现被用于标靶，其中两例（见表一）被用于阻断NFKB通路，此货物序列显而易见的将会影响CPP载体的穿膜能力，因而需要严格控制检测此种与其他CPP嵌合体来分析其特异性，而单独使用CPP或货物序列均无法实现检测。货物的突变也许可以解释无细胞分析中的键合，但序列中微小的改动也能对胞内作用产生深刻影响。也许可以使用其异构体，但用这些异构体获得的数据需谨慎对待。通过表达修饰和靶标蛋白质或通路的活性修饰，对照环境可以在细胞水平上被更好的设置。7疏水性7.1短疏水序列大量研究表明，在CPP的N-端或C-端插入疏水性残基，如苯基丙氨酸，可以提高其与膜作用能力，如插入F残基的D-NuBCP-9-r8在6.1中有详细介绍。同阶段研究表明在R9的C端加入FF可以显著影响其转运能力。在N端插入加速穿膜序列（FFLIPKG）的R8形成PasR8（表1）可提高Alexa488摄入，值得注意的是，胞质与核内突出标记显示了PasR8可能是直接穿过质膜入胞的。 提高穿膜能力是否需要全部7个残基的参与尚待考察。PVEC的N端含有一个极端疏水基（LLILL），其中任一残基突变成为丙氨酸都会显著影响其被细胞摄入的能力，第一个亮氨酸突变成丙氨酸时作用最为明显。单一或多个疏水基团的插入对其他CPP是否也存在提高穿膜能力的作用仍在探索中。7.2色氨酸 质膜中亲脂内层夹在疏水、带负电的磷酸层中间，其为肽类和其他小分子与细胞膜的相互作用提供了一个复杂的化学表面。色氨酸因其在膜上重要作用和在跨膜蛋白跨膜区域边缘的普遍存在被深入研究。许多CPP含有色氨酸或酪氨酸残基，特别是两亲性肽如TP10，其螺旋每端至少含有一个色氨酸残基。（见表一和图一）色氨酸在（KAAKKAA）3肽螺旋中的位置对其细胞毒性有明显作用。色氨酸位于亲水性赖氨酸与疏水性丙氨酸接触面上，使肽链呈螺旋形时毒性最强，对于CPP Pep-1（见表一）而言，色氨酸被用来组成与高分子相互作用的疏水域。螺旋构型中，色氨酸位于螺旋一侧，并被嵌入膜内，这导致肽链垂直于膜排列并形成了可能被用于迁移的小孔。在另一种肽，CADY（见表一）中，也形成了色氨酸仅位于一侧的螺旋，此种肽可以将siRNA运入细胞。研究表明色氨酸在该肽中起多重作用，包括与膜的相互作用、应急穿膜迁移、与siRNA末端产生静电作用及减少核酸降解等。非两亲性肽R7中，C端连接色氨酸在37C与4C时可以提高摄入并降低毒性，R6中连入单个色氨酸则会显著影响与GUVs作用方式。7.3脂化脂质尾