蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011.doc

蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。污染食品后，在2045，pH4.99.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。当一次摄入食品中细菌数量达到100万g（ml），即可发生食物中毒。特性：生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；培养特性，需氧菌，最适生长温度28 35，最适pH7.07.4，营养要求不高。在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇）， 周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。溶血。不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。实验安排一、稀释菌悬液的制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-110-5的稀释液。取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于321温箱培养1220h。一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。2. 用1ml的吸管吸取样品液1ml，加入第一支玻璃试管中，吹打混匀。3. 再用此吸管吸取该试管中的菌悬液1ml，加入第二支玻璃试管，吹打混匀。依此类推。二、细菌接种：用0.1ml吸管于从最高稀释度管（10-5）开始分别吸取菌悬液0.1ml于甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置321温箱培养2048h。第二部分第二部分一、观察MYP培养基上的菌落在MYP培养基上，呈粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）的菌落可能为蜡样芽胞杆菌。二、菌数测定选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验。根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以其稀释倍数，即得每g（或ml）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如MYP平板的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为4个，乘上稀释倍数（如10-4）的倒数，再乘上1g（或ml）检样数（取的是0.1ml样）则为：254/51/10-410=2106三、普通肉汤及血琼脂培养每组挑取该平板中的5个菌落，将每个菌落分别接种于普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、血琼脂平板上，35培养 1824h。第三部分一、观察普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、血琼脂平板上细菌的生长状况在普通琼脂培养基上生长的菌落较大，直径3mm10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。在普通肉汤中呈混浊生长，常形成菌膜或壁环。二、形态学观察（革兰氏染色）初染液：结晶紫或龙胆紫。媒染液：卢戈(Lugol)碘液。脱色液：95%乙醇。复染液：石炭酸复红稀释液常规制备涂片：涂片 干燥 固定。初染：将结晶紫液覆盖菌膜，染l min，水冲洗。媒染：滴加卢戈氏碘液数滴染l min，水冲洗。两者生成结晶紫-碘复合物。脱色：滴加脱色液乙醇后，频频倾动玻片0.5 min ，见无紫色脱下立即用水冲洗。复染：滴加复染液染l min，水冲洗，待干，镜检。 形态观察：革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。三、生化试验1. 点种酪蛋白琼脂平板。32培养48h。2. 动力和硝酸盐还原试验：取菌落穿刺接种于动力-硝酸盐半固体高层培养基，32培养48h。3. 明胶液化试验：用接种针挑取少许可疑菌落，穿刺接种木糖-明胶培养基，32培养1824h。第四部分第四部分一、观察生化试验结果1. 点种酪蛋白琼脂平板（结果）：在菌落周围有透明圈形成（产生酪蛋白酶），为阳性。2. 动力和硝酸盐还原试验（结果）：如细菌不限于沿穿刺线生长，并伴有混浊，即表示有动力；然后，分别加入对氨基苯磺酸和-萘胺等量混合液0.1ml，如立即或10min内出现红色，即表示