植物内生固氮菌的研究进展.doc

植物内生固氮菌的研究进展摘要 植物内生固氮菌是指那些定殖在植物内部与植物宿主联合固氮的固氮菌1，是近年新发现的不同于经典共生固氮和联合固氮的高效固氮体系，它的发现和研究显现了一个新的固氮系统，深化了植物根际联合共生固氮的研究。本文综述了结了植内生固氮细菌的发现，多样性及对其对植物的作用等一些研究进展同时对该研究方向提出一些初步观点和认识，旨在增加人们对根瘤微生态的了解，拓展根瘤菌研究与应用的视野。关键词 植物内生菌 多样性 展望 一 植物内生固氮菌的发现 植物内生固氮菌是指那些定植在植物内部与植物宿主联合固氮的固氮菌。30年前Debereiner2等在研究热带牧草和固氮螺菌形成的固氮系统时，认为固氮螺菌大多聚集在植物根表的粘质层或粘质鞘中，但有的菌株却能突破根表细胞壁，侵入宿主根的皮层组织内，但并不形成共生组织，是介于根际自生固氮和结瘤固氮的过渡类型。Baldani等根据菌体能否定植在植物织内，将固氮菌划分为根际固氮菌和内生固氮菌。内生固氮菌与植物的关系及固氮生境的特点使其成为继联合固氮之后的另一个固氮作用类型。二 植物内生固氦菌的多样性 内生固氦菌通过固氮作用，产生生理活性物质促进宿主对环境的适应，在农业中具有重要的应用潜力 。近年来，在甘蔗、玉米中发现了多种具有固氮功能的内生细菌，近年来，学者们又陆续从棕榈树、咖啡树等经济作物中发现了内生固氮菌引起了学术界的高度关注。植物内生固氮菌具有丰富的生物多样性，许褆松3将其总结近年来文献报道的内生固氮菌见表1 表1 内生固氮菌种类及其在宿主中的部位Table 1 The spices of endophytic diazotroph and the locations in host plant 内生固氮菌Endophytic diazotroph植物Plant植物部位Location兼性内生固氮菌巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)谷类根 、茎、种子51牧 草根 、茎甘蔗根 、茎 、叶棕搁 树根 、茎、果实S生脂固氮螺菌(A.lip oferum)谷类根 、 茎 、种子、木质部5牧草根 、叶 S甘蔗 根 、茎 、叶块茎 植 物块茎、根5棕搁 树根 、茎、果实亚马逊河固氮螺菌(A.am azonense)谷类根 、茎、种子多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyza）小麦根 、茎、叶71成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans小麦根 、 茎 、叶91阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae )水稻 、 玉 米根粪产碱菌(Alcaligenes faecalis水稻根产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)沙竹根、茎肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)玉米茎专性 内生固氮菌塞鲁普蒂卡草螺菌(Herbasprillum seropedicae谷 类根、茎、叶、种子甘 蔗根、 茎 16牧 草根 、茎、叶红 苍白草螺菌(Herbasprillum rubrisubalbicans)甘 蔗根、 茎、叶重氮营养醋杆菌(Acetobacterd iazotorphicu甘 蔗根 、茎、叶咖 啡树根、茎固氮弧菌属(Azoarcus spp.)水稻、卡拉草根、茎基伯克粗尔德氏菌属(Burkholderia spp.)谷 类根、茎、叶棉花、甜玉米根甘 蔗根、茎、叶 由此看来，植物内生固氮菌不只是只存在植物的根际部位，植物茎或其他组织中存在固氮菌菌是一个较为普遍的现象，这是固氮菌的提取，分离来源更加广泛，也为固氮菌在农业上的广泛应用成为可能。BALDANI等又将内生固氮菌划分为专性内生固氮军和兼性内生固氮军。前者是指那些不能再土壤中生存，仅在植物根内和地上部内定殖的内生固氮军；后者指那些既能在根内又能在根表定殖，在土壤中也能生存的内生固氮菌。1 兼性内生固氦菌11 固氮螺菌属(Azospirillum spp)。此菌是禾本科植物典型的根际菌，它们与几种温带禾本科作物共生。其中4个种：生脂固氮螺菌(A1ipoferum )、巴西固氮螺菌(Abrasilense)、亚马逊河固氮螺菌(AOlTtllzollense)和Airakense均为兼性内生固氮菌。AolTtaT,onense能利用葡萄糖、蔗糖作碳源，其生长的pH值范围较大；AbrosiIense和Airakense分别以苹果酸、蔗糖作碳源。A.amazonense和Abrasilense都能产生IAA4。许多固氮螺菌能将亚硝酸盐还原为N20和N25。Khalntllas等报道，来源不同的Azospirillum sp在趋化行为上表现出菌株特异性。从小麦、水稻等C3植物根部分离的菌株对草酸的趋化性最强，多为Abrasilense。12 成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。能定植在小麦幼苗根、茎、叶等组织的表面和内部，ELISA检测出的数量为(106107)：个g鲜组织6。阴沟肠杆菌是一种产酸产气的厌氧固氮细菌，利用蔗糖为碳源，有较高的固氮能力，它与粪产碱菌混合培养时，固氮量急增7。13 粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。此菌首次从我国广东省水稻根分离出来，并广泛分布于我国水稻土中。它只利用有机酸如苹果酸、乳酸等生长，是一种化能自养细菌6。其固氮的pH值为7O，最佳温度为30 8。罗明和卢云9曾报道其DNA中G+C含量为62.95% - 63.93% 8，是一种化能自养细菌。它含有吸氢酶，其生长和固氮的最佳温度、pH和PO2值分别为30s摄氏度,7.0和1.6X103Pa粪产碱菌对水稻根分泌物中的有机酸组分显示出较强的趋化性，对某些氨基酸组分虽能较好地利用碳源或氮源，却无趋化性10。其固氮的同化途径与固氮螺菌相同，在N2生长下为谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶同化途径；在 NH4培养下为谷氨酸脱氢酶同化途径11。2 专性内生固氮菌21 重氮营养醋杆菌(Acewbacter diazotrophicua)。此菌是Debereiner从甘蔗根和茎中分离得到的一种耐酸固氮菌。该菌是严格的专性内生菌，主要与富含糖分并以茎节或块根作为繁殖材料的植物共生，但有人也从墨西哥的咖啡树中分离出了几个与醋酸杆菌特性相似的菌株12。在甘蔗的根、茎、叶组织中，其含量很高，但在甘蔗田的行间土壤及杂草组织中均未分离出。这与其仅利用糖类而不能利用一般氨基酸、有机酸的生理特性有关。Caruso等研究发现用lacZ融合子标记的重氮醋杆菌在灭菌土壤中可存活10 d以上，但在自然土壤中却不能存活。该菌的生态分布也存在着一定的特性，目前仅在巴西澳大利亚等地发现。而且该菌有很强的产酸和耐酸能力，在pH值25以下仍可生长和固氮，最佳pH值为5513。重氮营养醋杆菌另一个独特的生理特性是其有泌铵能力，这种特性有利于固定氮素向植物细胞的转运14。该菌不具有硝酸还原酶，其固氮酶活性较高，能在10 mmolN03-下固氮，NH4+仅部分抑制其固氮活性，此特性在农业生产上具有重要意义，可增施少量氮肥补充生物固氮的不足15.该菌的固氮酶活性较高，可为甘蔗提供60%的氮素。研究 已 证 实A.di azotrophicu:的nif基因位于染色体上，nifH DK和nifA基因已测序。其它基因如ntrBC, nifB, nifV, nifE也在其中检测出16遗传多样性分析表明，该菌具有限制性的遗传多样性。不同来源的重氮醋酸杆菌各菌株间的多样性较少，这与其专性内生的生态特性相吻合17。22 草螺菌属(Herbaspirillum spp)。包括塞鲁普蒂卡草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)、红苍白草螺菌(Herbaspirillumrubrisubalbicans)和最近从C4纤维植物中分离出的1个新种Herbaspirillum frisingense18，近年来还不断有新种发现。草螺菌嗜有机酸，可在高糖培养基上生长和固氮，但不利用蔗糖。塞鲁普蒂卡草螺菌在土壤中不易存活，在灭菌的土壤中生长却不受影响19。23 固氮弧菌(Azoarcua spp)。此菌是从贫瘠的盐碱地上生长的植物卡拉草(Leptochlor fusca)中分离出的优势固氮菌，包括需氧固氮弧菌(Aindigens)、Acommunis和几个与这2种固氮菌无高同源性但称为固氮弧菌的种。该属细菌是严格的需氧代谢型，微需氧固氮，且在含有机酸的盐渍土上生长较好，不能利用单糖和双糖，还能利用少数氨基酸。这几个种现已被鉴定为蛋白细菌的-亚群。Humk等设计了固氮弧菌属的特异性引物，用PCR扩增及16SRNA序列分析检测、鉴定该属在植物组织中的存在。24 伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia spp)。Tran Van从越南水稻根际分离出一种新的固氮菌，根据其DNA与DNA，DNA与rRNA的高度同源性和接近Burkholderia的表型特征被命名为Bvietnamiensis。另一个被命名为Bbrasilensis的内生固氮菌常可在甘蔗和水稻组织内发现20，B1adioli、Bsolanacearum可从甜玉米和棉花的根中分离出。香蕉、菠萝树中也被证实有Burkhol deria属的固氮菌存在21。Bcepacia、Bcaryophilli、B 和Bvietnamiensis能利用D-棉子糖22。Brasilensls能利用甘露糖和D-棉子糖，但不能利用内消旋赤藓糖醇和 NH4+。该属中的Bcepacia是人体胆囊纤维化病的重要致病菌，但同时它还可用于高效治理被三氯乙烯污染的地下水，还能促进植物生长，对某些植物病原菌有抑制作用。这也是人们发现的人和植物共患的第一个病原菌。但是目前对该属中的其它内生菌与植物间的相互作用还知之甚少。三 内生固氮菌固氮功能在植物体内的表达 生物固氮是极耗能的过程，和植物共生的固氮微生物能否高效固氮与植物的营养供应密切相关。内生固氮菌不同于根际联合固氮菌，植物给予后者的 仅是少量的根分泌物或死组织。就甘蔗、玉米 和高粱这样的高效光合的C4植物而言，其光合产物的利用率很低，完全有能力为内生固氮菌固氮提供碳源。不同的内生菌因营养需求和其间的相互作用占据不同的生态位，而植物不同组织很和细胞的微环境决定着细菌的生理活动。目前关于此方面的研究甚少， 安千里和李久蒂在1999年曾有报道，植物细胞内、细胞间隙、木质部导管等部位有内生菌的定殖。1 植物细胞内 细菌将导致宿主细胞死亡或被宿主细胞消化，。二者和谐共存的很少。据报道，粪类碱菌可以生活在水稻愈伤组织细胞内，15N试验表明固粪类碱菌和水稻愈伤组织在无氮培养基上形成的共生体可以固氮23。 固氮菌进入植物细胞内若没有膜包裹，植物细胞胞质内相当高含量的化合态氮，将阻迎固氮酶的表达。若植物细胞濒死，胞液膜崩解，胞内溶质和渗透压的变化也不利于细菌固氮24。但最近发现载有nifH：gfp融合子的固氮弧菌，在水稻表皮细胞内也能表达固氮酶基因25。2 细胞间隙 这是固氮菌在植物体内定殖最多的部位，Sprent和James24假设，内生菌课利用宿主分泌底物带细胞间隙的糖蛋白或宿主防御反应作为底物进行代谢。而固氮菌表面束缚夫人纤维素酶或果胶酶可能不仅参与入侵过程，它们降解多糖的产物很肯能成为固氮菌的能源。成团长杆菌可以凝聚于小麦根皮层细胞间隙中，菌体内无聚-羟基丁酸等贮藏物质，代谢活跃，且进行着细胞分裂。最近发现在甘蔗叶肉细胞间隙中聚集的红苍白草螺菌表达了固氮酶27。固氮醋酸杆菌可以从甘蔗茎薄壁细胞间隙分离到28。甘蔗韧皮部内的同化物向茎卸出事经质外途径，茎薄壁细胞间隙充了溶液，其中蔗糖浓度为12%，ph为5.528,接近于固氮醋酸杆菌的最适分离培养基（蔗糖浓度为10%，ph为5.529）。半固体无氮培养基是分离固氮醋酸杆菌的关键，微环境氧分压时期固氮的限制因素。在甘蔗体内，固氮醋酸杆菌生活的固氮活性表现出较强的耐氧能力，所以甘蔗茎薄壁细胞间隙的低氧分压不会成为固氮醋酸杆菌固氮酶表达的障碍。湿地植物皮层细胞间隙的氧浓度曾推测至少为2%31,通气组织是湿地植物向根输送氧气的通道。需求固氮弧菌能在6.5%的氧浓度下固氮32。与对氧更敏感的固氮螺菌相比。最近，利用nifH：gus和nifH：gfp融合结合免疫组织化学研究，都表明BH72的固氮酶在水稻幼苗根的通气组织内可以表达33。3 木质部导管 固氮菌可在禾木科C3植物（甘蔗、玉米、高粱、Kallar草等）和C3植物（水稻、小麦等）的木质部定殖。木质部导管不仅是细菌由根系到茎叶的通道，也为内生菌和宿主交换代谢产物提供了便利。导管溶液中微凉的有机酸、糖类和氨基酸可以成为其中内生菌的碳氮源34。内生菌如何进入导管还不清楚，或许内生菌入侵会导致木质部薄壁细胞的溶质渗漏如导管，导管中的内生固氮菌可能由此获得部分能源，当内源内生固氮菌通过宿主营养繁殖而传播时，这样的情况肯能不会发生34。Welbaum等35的研究表明，甘蔗木质部的自由空间不含蔗糖。已发现甘蔗导管内大量定殖的固氮醋酸杆菌通过粘液与导管的螺纹次生加厚处紧密相连25，固氮醋酸杆菌固氮所需的碳源可能通过纹孔从邻近的薄壁细胞得到。导管中微量的化合态氮不足以硬质内生固氮菌酶的表达。在导管内的固氮醋酸杆菌为粘液所包裹25，这些粘液可能含有限制氧扩散的胞外多糖。在巴西抗条斑病甘蔗的叶片中，红苍白草螺菌在导管内成簇为膜所包裹，这可能也形成了固氮的微环境。最近，用红苍白草螺菌接种高粱叶片，免疫组织化学结果显示，接种后5d叶片导管内城簇被摸包裹的红苍白草螺菌表达了固氮酶37。四 结语 植物内生固氮的发现和研究揭示了一个新的固氮系统。内生固氮菌的生境特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又是一个潜能巨大、尚待开发的固氮微生物资源。内生固氮细菌虽不形成类似根瘤的稳定的共生结构，但它们与植物形成较紧密的联系。在植物组织内，占据着植物体内有利于营养供应和微环境适宜的生态位，因而较根外环境更有利于形成高效固氮体系，充分发挥固氮效能。内生固氮菌还可通过分泌植物生长激素等多种生理活性物质，与病原菌竟争营养和空间，从多方面促进植物生长，在农业生产实践中具有广阔的应用前景。但目前已有的内生固氮菌的基础性研究还很薄弱，仍然存在很多问题比如说不知道巴西甘蔗生长所需的氮素主要源于哪种固氮菌，特别是植物一细菌内生固氮体系建立过程中的植物和微生物相互作用的机理、模式，固氮基因在植物体内表达的限制因子等都需要进一步探索。五 参考文献1 BALDANI J，OLTVARES F，HEMERLY，et a1Nitrogen-fixing endophytes：recentAdvances int he association with graminaceons plants grown in the tropicsMNetherlands：Kluwer Academic Pubhshers1997：2032062 Dobereiner J,Day JM. 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