高级生化实验报告二.doc

. . . .实验二 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白一、背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blotting相似，故命名为Northern blotting。George Stark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。1981年，在Neal Burnette所著的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western blotting。此后开发的Eastern blotting是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern blotting。30多年来，Western blotting技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性），目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。pET系统是在大肠杆菌（Escherichia coli）中克隆表达目的基因、产生重组蛋白的经典表达系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶被充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。目的蛋白可用于进一步的SDS-PAGE分析、Western blotting检测或亲和层析分离纯化。二、实验目的利用Western Blotting技术，定性检测苦荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（FtDFR）在E.coli BL(DE3)中的诱导表达。三、实验原理采用PCR技术，在苦荞FtDFR 基因ORF起始密码子前引入Kpn 酶切位点，终止密码后引入Sal酶切位点。PCR产物与pET-30b（+）质粒进行体外重组，获得重组质粒pET-30b- FtDFR，设计其表达产物在N-末端含有6 His标签。重组质粒经鉴定后转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达，分别收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。Western blotting的实验流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，进一步通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定后含有特定抗原的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体发生抗原-抗体反应，并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtDFR蛋白的N-末端的6 His发生抗原-抗体特异反应，利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中应用广泛。四、操作步骤1 样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。1.1 材料与试剂：基因工程菌重组E. coli BL21(DE3)pET-30b(+)-FtDFR；LB固体培养基（Kan 50g/mL）LB 液体培养基（10mL、50mL）Kan（50 mg/mL）IPTG（24 mg/mL）PBS缓冲液：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4,2mM KH2HPO4,pH7.4；5SDS上样缓冲液（pH8.0）：250mM Tris-HCl(pH6.8)，10（W/V）SDS，0.5（W/V）溴酚蓝，50（W/V）甘油，5（W/V）-巯基乙醇；1.2 仪器与设备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、Tip（10 L、200 L、1 mL）、微量加样器（10 L、200 L、1 mL）、离心管（1.5 mL）。1.3 操作步骤：将基因工程菌E. coli BL21(DE3)pET-30b(+)-FtDFR划线于LB 固体培养基（Kan抗性），37培养16 h。挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基（按0.1%加入Kan，10 L）于37 过夜培养，即为种子液。按2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中（按0.1%加入Kan，50 L），于37 培养OD600至0.5（约2.5 h）。加入IPTG至终浓度为1 mmol/L（100 L），置于22-25连续诱导表达8 h，分别取诱导前0 h，诱导后2 h、4 h、6 h和8 h的培养液1 mL于1.5 mL离心管中，置于4备用。诱导完毕后，各样品于12000 rpm离心5 min收集沉淀，用等体积PBS（1 mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。各管分别加入80 L PBS重悬细胞，加入20 L 5 SDS上样缓冲液，混匀后置于沸水浴中10 min，12000 rpm离心3 min后，置于4备用。1.4 注意事项：重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。多次使用时样品应进行分装，保存于-20或-80且避免反复冻融。2 SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAG1）是一种常用的定性分析蛋白质的电泳方法，多用于分离蛋白质或测定蛋白质相对分子质量。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质分子间的非共价键，使白质变性而改变原有的空间构象。在强还原剂（如-巯基乙醇或二硫苏糖醇）存在的情况下，蛋白质分子内的二硫键被打开，蛋白质的空间构象可进一步改变。此时，SDS以其疏水基和蛋白质的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物。据计算，结合到蛋白质分子上的SDS分子数目和蛋白质的氨基酸残基比值一般为1：2。这种复合物由于结合了大量的SDS，所引入的净电荷大大超过了蛋白质原有的净电荷（约10倍），使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小但屏蔽了蛋白质天然电荷差异的负离子复合物，因而各SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度，相同的荷质比，其电泳迁移率主要取决于蛋白质自身的分子质量，而与其所带电荷和形状无关。当蛋白质相对分子质量在11700-200000之间时，电泳迁移率与分子质量的对数呈直线关系，符合以下方程式：lgMW=-bmR+K式中，MW为蛋白质相对分子质量；b为斜率，mR为电泳相对迁移率，K为节距。在一定条件下，K和b均为常数，基于这一关系，通过测定几个标准蛋白质（即相对分子质量已知）的迁移率，可得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，测得它的相对迁移率，即可在标准曲线上求得其相对分子质量。2.1 材料与试剂：分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。30%丙烯酰胺/N, N-亚甲基双丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。TEMED（四甲基乙二胺）。2SDS上样缓冲液（pH8.0）：250mM Tris-HCl(pH6.8)，10（W/V）SDS，0.5（W/V）溴酚蓝，50（W/V）甘油，5（W/V）-巯基乙醇。电极缓冲液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，调整pH后定容至1000 mL。电极缓冲液（3.03gTris，14.41gGly，1.0gSDS，调整pH=8.3定容至1000ml）封底胶：1g琼脂糖溶于100ml电极缓冲液。染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250。脱色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。预染标准分子量蛋白质Marker。2.2 仪器与设备：MV-型小型单垂直板电泳槽及附件、电炉、电泳仪、微量加样器（10L），Tip（10L）。2.3 操作步骤：制胶槽的安装：将成套的两块玻璃板放置于制胶槽背面上的支架固定（凹形玻璃板向外），4个铁夹分别夹在玻璃板左右两侧即可制胶。SDS-PAGE分离范围一般在10-200 kDa，超过这个范围无法进行准确比较。不同的凝胶浓度适用于不同的相对分子质量范围，根据蛋白质相对分子质量选择最适的凝胶浓度，如下表所示。本实验选用12.5%的分离胶对重组FtDFR（约40 kDa）进行分离。试剂分离胶浓缩胶浓度7.5%10%12.5%15%30%4%分离胶缓冲液 mL4.04.02.04.04.0-浓缩胶缓冲液 mL-0.625Acr/Bis mL4.05.33.358.010.70.375H2O mL8.06.72.654.01.31.510% AP mL0.30.30.150.30.30.075TEMED mL0.0080.0080.0080.0080.0080.005制胶：配制12.5%的分离胶，灌入两玻璃板之间，加至凹形玻璃板顶端2cm处，立即覆盖5mm左右水层，静置聚合。当分离胶与水层之间的界面重新出现时表明已胶已聚合。小心倒掉分离胶上水层，配制4%浓缩胶后加入玻璃板中，插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙。电泳槽安装：浓缩胶聚合后，除去4个铁夹，正确安装进入电泳槽（凹形玻璃板向内）并用白色塑料夹将玻璃板固定。点样：分别于内外槽加入适量电极缓冲液，使内槽水位超过凹形板缺口。使用微量加样器分别于制胶孔中加入诱导后的样品4-5L，预染标准分子量蛋白质点10L。电泳：接通电源，待指示剂在分离胶中迁移5cm时，停止电泳。剥胶：小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去（便于识别）。Western Blotting做到此处为止。染色：凝胶加入适量染色液，电炉加热处理15 min染色。脱色：使用蒸馏水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清晰的蛋白条带。2.4 注意事项：上样总体积一般5-10mL左右，胶孔的最大限度可加15mL样品。微量加样器应贴壁吸取样品，避免吸进气泡；将微量加样器Tip头插至加样孔中缓慢加入样品，避免样品溢出。电泳设备应注意检查正负极、是否短路或接触不良、是否漏液、电流电压大小（电流强度会随电泳的进行有所降低）。电极缓冲液、TEMD和AP应新鲜配制。3 转膜与杂交杂交膜的选择是决定Western blotting成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和聚偏氟乙烯膜（PVDF）。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起；在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。PVDF膜灵敏度高、分辨率和蛋白亲和力比NC膜高，非常适合于低分子量蛋白的检测。PVDF膜在使用前必须用纯甲醇浸泡饱和5 sec，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜或PVDF膜。随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45m和0.2m两种规格的NC膜和PVDF膜。大于20kDa的蛋白可用0.45m 的膜，小于20kDa的蛋白用0.2m的膜。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。3.1 材料与试剂：材料：PVDF膜（0.45m，进口分装），Whatman 滤纸（进口分装），搪瓷盘，一次性PE手套，镊子，玻棒，Western blotting DAB显色法试剂盒。试剂：转移缓冲液 pH 8.3（25 mmol/L Tris，0.2 M 甘氨酸，20%甲醇）1000 mL；10TBS缓冲液pH 7.6（24.2 g Tris base，80 g NaCl，用1N HCl调pH=7.6）；脱脂奶粉、BSA或试剂盒自带的蛋白质干粉；洗涤缓冲液（1TBS，0.1% Tween-20）；封闭缓冲液/抗体稀释液（1TBS，0.1% Tween-20，5% w/v脱脂奶粉）。3.2 仪器与设备：转膜电泳仪及其附件，电泳仪、杂交仪，方形培养皿，凝胶成像系统。3.3 操作步骤：3.3.1 转膜将PVDF膜在甲醇溶液中浸泡5sec，使膜表面充分和甲醇接触（可观察到膜变为半透明）。准备转移缓冲液，依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将凝胶和NC膜和滤纸放入转移缓冲液中平衡5min。装配转移三明治（海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵），在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；将夹子打开使一面保持水平（规定为正极）。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。依次加膜、加胶，再在膜上盖3张滤纸并除去气泡。注入转移缓冲液，放入转印三明治，接通冷凝装置，于100V电泳45min（电流约为0.3 A）。电泳结束，观察预染的蛋白质Marker是否转移到膜上。3.3.2 杂交用25 mL洗涤缓冲液洗涤PVDF膜1次，5 min。封闭PVDF膜：加封闭缓冲液、脱脂奶粉（100ml封闭液+5g），37封闭3 h。用量以浸没整张膜为准。 PVDF膜孵育一抗：加入20 mL抗体稀释液，将20L一抗加入培养皿中（已完全覆盖膜为准），37孵育2h左右，（视实验时间，也可以4孵育过夜）用25 mL洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维素膜3 次, 每次5 min。PVDF膜孵育二抗：加入20mL抗体稀释液，将10L二抗加入培养皿中（以完全覆盖膜为准），37 孵育1.5 h。用30 mL洗涤缓冲液振荡洗涤NC膜4 次, 每次5 min。DAB 显色（6mL）：按每2 mL蒸馏水加显色剂A，B，C 各滴，混匀后