单链抗体研究进展

抗体工程课程论文单链抗体研究进展姓名： 学号： 指导教师： 时间：2015-2016上半学年单链抗体研究进展姓名摘要：单链抗体作为一种小分子基因工程抗体，在理论和应用方面的研究引起了广泛的关注，其在显像定位诊断、靶向治疗和参与细胞免疫等方面展示出了可观的应用前景。本文对单链抗体的结构及特点、制备技术及其应用的研究进展等进行了综述，以期能够为单链抗体的进一步深入研究和应用提供理论基础。关键词：单链抗体；结构；制备技术；应用Abstract:Micro-molecule antibody prepared by genetic engineering have attracted wide attentions. And it showed considerable application prospects in imaging localization and diagnosis, targeted therapy and cellular immunity. The structure, characteristics and preparation technology of single-chain antibody as well as its applications were reviewed, so as to provide theoretical foundation for further study on single-chain antibody and its applications.Key words: single-chain antibody ； structure ； preparation technology ； application 前言：机体在受到抗原物质刺激后，B 淋巴细胞或记忆B 细胞增殖分化形成浆细胞，产生的免疫球蛋白能与抗原发生特异性结合，识别并清除外来入侵物质。防御系统中抗体不可或缺，是维护机体生理平衡和稳定的重要组成部分之一 1 ，因此,人们对抗体的制备、纯化技术进行了长期的探索。早期使用的传统方法以天然抗原免疫实验动物，产生相应的多克隆抗体。该方法获得的抗体主要用于治疗某些感染性疾病，但因其存在均一性差、交叉反应多、易产生副作用等缺点而限制了其大规模生产应用。1975 年以来，使用杂交瘤技术制备的单克隆抗体与多克隆抗体相比，具有性质均一、特异性强、容易生产等优点，现已在科学研究、临床诊断与治疗等方面发挥着重要作用。但由于制备周期较长，操作难度高，抗体本身稳定性差,在人体内重复应用时会发生人抗鼠抗体反应（ human and anti-mouse antibody ，HAMA ），而大大降低了治疗效果，因此使得其在临床治疗中的应用困难重重。20 世纪 80 年代初，随着基因工程抗体的成功研制，抗体的研究进入了新的发展阶段。此后，人们尝试利用基因工程技术大量生产重组抗体，通过基因工程的方法在基因水平对免疫球蛋白分子进行加工、修饰，开发了大量可用于研究、诊断、治疗的小分子抗体。这些抗体不仅保留了天然抗体的生物学活性和特性，同时也去除了大部分的无关结构，使其更加适合体内诊断和治疗。单链抗体（ single-chain antibodyfragment ，scFV ）以其分子量小、穿透性强、亲和力高等优势,引起人们越来越多的关注和研究。1 scFV 的结构和特点scFV 是将抗体的重链可变区 （ variable region of heavy chain,VH ）和轻链可变区（ variable region of lightchain ,VL）通过 1525 个氨基酸的短肽（ linker ）首尾连接而成的重组蛋白，是亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。与传统抗体相比,scFV 存在如下几方面的优势： 分子质量小； 较好地保留了原抗体的结合位点构型、位置及其对抗原的亲和活力和准确度； 有很好的穿透性，易透过血管壁与靶细胞进行接触、接合，适用于肿瘤的诊断和治疗； 易于进行分子改造，可直接杀伤靶细胞； 可由适当的大肠杆菌进行大批量生产； 可绕过常规抗体制备程序，获得常规方法难以实现的人源性抗体和毒素类抗体 2 。当然，scFV 也存在一些缺点，如分子量小，免疫系统对抗体的清除速度快，难以达到诊断或治疗所需的时间；结构简单,亲和力低,稳定性差等。2 scFV 的制备技术2.1 噬菌体展示技术 近年来，噬菌体成为展示scFV 的重要平台。噬菌体展示技术是借助基因工程，使scFV片段与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合，从而将 scFV 表达于噬菌体表面，便于进一步的鉴定与筛选。黄爱玲等3通过 RT-PCR 技术扩增出轻链和重链片段，并利用噬菌体展示技术构建了兔天然抗体库，为开展兔的免疫系统、抗体结构与性质等方面的进一步研究提供了可靠保障。李楠等人4成功构建人源性阿尔茨海默病（AD）噬菌体单链抗体（scFV）库，为筛选-淀粉样蛋白的人源性抗体奠定了基础。以及刘琼等人5成功从大容量甲状腺髓样癌（MTC）人原噬菌体单链抗体库中筛选出特异的抗MTC单链抗体，并对其生物学特性进行鉴定。2.2 核糖体展示技术 核糖体展示技术具有诸多优点，如亲和力高、展示速度快、简便易行、不受细菌转化效率的影响等，从而缩短了实验周期。核糖体展示技术是一种高效的体外筛选 scFV 的方法，主要过程是使新生scFV与其mRNA 连接形成复合物,富集与抗原具有高亲和性的 mRNA ，再通过 PCR 反转录得到扩增产物。但在此过程中若未对 DNA 聚合酶进行功能校对，则较容易发生基因突变 6。2.3 酵母表面展示技术 酵母表面展示是筛选具有高特异性和亲和力scFV的有力方法,但由于酵母转化效率低，使得实验周期变长，因此限制了筛选抗体的种类和产量。酵母表面展示技术的核心是将重组蛋白连接到酵母的细胞壁上。 例如，蛋白质可以通过与- 凝集素黏附受体融合展示在酵母菌细胞壁上7。该技术充分利用了酵母细胞的内质网,使得重组蛋白在内质网中能够准确折叠。3 scFV 的应用scFV 具有分子质量小、体积小、无 Fc 结构域等优点，使得其在许多领域具有较为广阔的应用前景。3.1 scFV 在肿瘤治疗方面的应用3.1.1 靶向治疗：肿瘤的靶向治疗是 scFv 最直接的应用领域。由于其具有免疫原性低、靶向性好、穿透力强、副作用小等优点，因此在靶向治疗中具有独特优势。如抗体导向酶前药疗法（ antibody-directedenzyme prodrug therapy ，ADEPT ），就是将 scFv 与药物活化酶在体外进行连接，再将无活性或低活性前药静脉注射入人体，与抗体连接的酶在肿瘤细胞处激活前药的活性，避免了脱落的抗原与之结合在肝肾，造成堆积，而使得肿瘤组织内药物大量富集。目前，scFV对肿瘤治疗的研究，已在靶向脂质体、免疫毒素、靶向性病毒载体及scFV融合蛋白等方面取得了一定进展。德国学者 Castoldi 等 8研制出一种特殊的双特异性scFV，能够通过阻碍表皮生长因子受体（ epidermal growth factor receptor ， EGFR ）和 Met 发挥作用，从而抑制肿瘤细胞生长。 CD133 是一种人体内的异常 scFV ，可用于肿瘤的靶向治疗。目前，研究人员已经探明了其表达方式9。免疫毒素则利用 scFv 与毒素连接，进而提高毒素的免疫杀伤力。免疫毒素分子可特异性地识别并杀死靶细胞。 scFV 与毒素偶联后首先通过scFV与靶细胞表面抗原结合，经内化后毒素进入靶细胞引起肿瘤细胞的凋亡10，在保留病毒对肿瘤细胞杀伤力的同时，也提高了病毒载体的靶向性。3.1.2 影像分析：经过放射性同位素标记的 scFV 在进行肿瘤影像学分析时，将针对肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的标记抗体注入体内，确定肿瘤的位置，然后再依靠产生的内照射效应达到放射性免疫治疗的作用11。scFV 的分子量较小，可以快速、高效地渗入肿瘤细胞内部12，使肿瘤定位图像明确、清晰，同时也避免了非特异性损伤，因此其具有高效的特异性和亲和力，以及远高于常规抗体的清除率13。3.1.3 肿瘤治疗的其他方面：双特异性抗体不仅能够识别肿瘤细胞，也能消灭肿瘤细胞。Gomes14等把scFV 基因与编码亲和素的基因连接，使嵌合蛋白形成四聚体复合物，可结合抗原与生物素，因此可利用ELISA 和免疫印迹技术直接检测抗原。 Anti-CHMP5单链可变区抗体片段逆转录病毒能够感染并诱发细胞程序性死亡15，如可消灭 AML 白血病细胞。Patel等16于 2014 年研制出一种重组 scFV ,可通过对抗错误折叠的超氧化物歧化酶消灭腺病毒。3.2 scFV 在抗病原生物领域的研究3.2.1 在抗病毒方面的应用：流感病毒（ influenzavirus ）主要通过空气传播，引起人畜共患呼吸道传染病。每年大规模爆发的季节性流感对人类健康及经济发展产生了巨大的影响17。而流感病毒变异快的特点使得设计、生产具有广泛交叉保护作用的疫苗成为人们研究的重要内容。 伪狂犬病毒是一种疱疹病毒，能通过胎盘、呼吸道和消化道等进行传播，引起哺乳动物和部分禽类发热、精神沉郁甚至死亡。近年来，我国在猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV ）重组疫苗的研究上取得了重大突破。郭广君等18利用scFV 技术构建了猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株。曾伟伟等19建立了scFV文库，获得了针对呼肠弧病毒VP4的scFV，为进一步研究该病毒与细胞的相互作用提供了有力支持。刘金凤等人20利用抗猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)单链抗体基因(ScFv)建立 CSFV 病原快速检测方法，成功构建了 CSFV-ScFv 基因。3.2.2 在抗细菌方面的应用：近年来，scFV 在抗植物、动物致病性细菌方面的研究与应用也获得了较大的进步。殷幼平等 21利用scFV 技术对柑橘溃疡病进行快速免疫诊断,为制备病害治疗性抗体提供了有效的方案。王报贵等 22 利用基因工程的方法成功地获得了抗肠炎沙门菌的scFV。3.2.3 在抗寄生虫方面的应用：通过生物工程技术进行批量生产进一步人源化的 scFV ，并将其应用到疟疾的诊断和治疗方面，是近年来 scFV 在抗寄生虫方面的研究热点，如何卓等 23 成功地构建了日本血吸虫未成熟卵的scFV 库。3.3 自身免疫疾病研究 风湿、艾滋病等自身免疫疾病的产生机理也与自身抗体的合成有关。 非正常的机体会自发产生高亲和力的自身抗体，同时在ADCC作用或激活补体系统等机制的影响下产生病变。scFV 在 HIV 的治疗方面具有巨大的潜力24。Yang和 Wang25利用基因工程技术，在体外大量制备了b12-scFV，并将其应用于艾滋病的被动免疫防治；杨雄等26合成并克隆了 HIV-1 可溶性单链抗体 b12-scFV，并在大肠杆菌中诱导表达,为设计新型、有效的HIV-1 疫苗奠定了基础。3.4 scFV 在食品安全方面的应用3.4.1 在毒素检测方面的应用： 在食品工业生产中，黄曲霉、寄生曲霉等产生黄曲霉毒素的真菌检测涉及食品的安全性，一旦出现问题就会威胁到消费者的健康。因此，开发准确检测黄曲霉等真菌的方法至关重要。廖玉才27等利用噬菌体展示技术，从抗体库中提取出对黄曲霉具有特异识别性的scFV，并将其与碱性磷酸酶连接进行真菌的检测。 该方法在保证检测结果准确的同时，又能保持连续几代批次的高保真性，在保持抗体活性及检测成本等方面具有极大的优势。3.4.2 在农、兽药残留检测方面的应用：农产品中药物残留的检测对公共卫生安全具有重要意义。采用基因重组抗体技术，可获得用于兽药多残留快速免疫分析的广谱性抗体，使兽药残留检测分析技术更加高效、快捷28。寇立泉 29 构建了有机磷杀虫剂抗体库，建立了检测食品中有机磷的快速、有效方法。5 展望scFV 由于具有分子质量小、体积小、无 Fc 结构域等性质而使其在许多方面的表现优于多抗。 然而，scFV 仍存在许多缺点，如： 在 Fc 结构域的介导下，scFV无法发挥诱导功能； 某些类型的抗体片段 VH和 VL 以非共价键结合， 由于连接肽呈疏水性而使其有聚合倾向，有可能形成聚合物，因此稳定性比多抗差；Fab 的表观亲和力较低； 限于目前的合成方法，无法获得稳定性高、功能性强、易纯化且便于生产的双特异性抗体； 尽管免疫毒素采用毒素的衍生物，在一定程度上削弱了非特异结合，但对正常细胞仍存在着剂量依赖性的特异或非特异性损害。 半衰期短的免疫毒素会对血管内皮细胞造成较明显的损伤，出现血管渗漏综合征（ vascular leak syndrome ），这在很大程度上限制了其在临床的应用。如何能使其安全性和稳定性得到长足的进步与发展， 是亟待解决的问题，因此，对于 scFV 的进一步研究就显得尤为重要。参考文献1. 霍萍萍，张聪敏，赵宝华.单链抗体制备技术及应用的研究进展 J .细胞与分子免疫学杂志，2011，27（ 10 ）：1154-1156.2. 王净.人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建、筛选与初步鉴定 D . 西安：第四军医大学,2012.3. 黄爱玲，冯荣虎，吕暾等.天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 J .生物技术，2012，22（ 1 ）：31-34.4. 李楠，王建平.人源性阿尔茨海默病噬菌体单链抗体的构建J.2015.5. 刘琼，庞华，奚级梅，李文波，许璐.甲状腺髓样癌人源噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定.J.重庆医科大学.2015.6. 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