生物分离技术综述.doc

生物分离技术概述与研究趋势摘要：生物技术是上世纪末及本世纪初发展国民经济的关键技术之一。生物技术的发展，为人类提供了丰富多彩的生物产品。多数生物技术产品的生产过程是由菌体选育菌体培养（发酵）预处理浓缩产物捕集纯化精制等单元组成。习惯上将菌体培养以前的过程称为“上游工程”，与之相应的后续过程则称为“下游工程”或“生物分离工程”。生物技术要走向产业化，上下游必须兼容、协调，以使全过程能优化进行。 关键词：生物分离 下游工程 萃取 膜分离 色谱1、前言 生物技术是上世纪末及本世纪初发展国民经济的关键技术之一。生物技术的发展，为人类提供了丰富多彩的生物产品。多数生物技术产品的生产过程是由菌体选育菌体培养（发酵）预处理浓缩产物捕集纯化精制等单元组成。习惯上将菌体培养以前的过程称为“上游过程”，与之相应的后续过程则称为“下游过程”或“生化分离和纯化过程”。生物技术要走向产业化，上下游必须兼容、协调，以使全过程能优化进行。与上游过程相比，下游处理过程是一个多步骤、高能量低效率的过程。由于历史的原因，生物技术发展初期，绝大多数的投资是在上游过程的开发，而下游处理过程的研究投入要比上游过程少得多，因而使得下游处理过程的研究明显落后，已成为生物技术整体优化的瓶颈，严重地制约了生物技术工业的发展，因此，当务之急是要充实和强化下游处理过程的研究，以期有更多的积累和突破，使下游处理过程尽快达到和适应上游过程的技术水平和要求。2、生物分离与纯化的一般步骤由于人们所需的生物产品不同（如菌体或酶或代谢产物），用途各异，对产品的质量（纯度）要求也可以是多方面的，所以分离与纯化步骤可有不同的组合，提取和精制的方法也是多种多样的。但大多数生物分离与纯化过程常常按生产过程的顺序分为四个类似步骤，见图（1）。其中a、发酵液的预处理与固液分离（或不溶物的去除）：在这一步步骤中，过滤和离心是基本的单元操作。而凝聚和絮凝等技术可加速两相分离。为了减少过滤介质的阻力，采用了错流过滤技术，但这一步对产物浓缩和产物质量的改善作用很小。 如果是胞内产物还须进行细胞的破碎及碎片的分离。 b、初步纯化：这一步骤没有特定的方法，主要是除去与目标产物性质有很大差异的物质，一般会发生显著的浓缩和产物质量的增加。典型的分离方法有吸附、萃取等。c、高度纯化：这类过程，技术对产物有高度的选择性，用于除去有类似化学功能和物理性质的不纯物，典型的方法有层析、电泳等。 d. 成品加工（精制）：产物的最终用途决定了最终的加工方法。结晶常常是关键。大多数产品也必须经过干燥。 其中各阶段都有若干单元操作可以选用，应根据具体情况而定。为了便于技术选择，下面将各种主要的单元操作的主要分离方法作一简要介绍。3、生物分离技术概述 3.1 絮凝 絮凝是利用电荷中和及大分子桥联作用形成更大的粒子的原理。设备有连续式、批式等。特点是使固形物颗粒增大，容易沉降，过滤、离心提高因数分离速度和液体澄清度。但它有条件严格，放大困难，引入的絮凝剂可能干扰之后的分离纯化等缺点。3.2 离心 在离心产生的重力的作用下颗粒沉降速度加快而沉淀。离心设备有很多种，但各有优缺点，我们使用时可被具体情况而定：（1）高速冷冻离心机：适用于粒度小，热不稳定的物质回收，适于实验室应用。但由于容量小，连续操作困难，大规模工业应用性差。（2）碟片式离心机：适用于大规模工业应用，可连续，也可批式操作，操作稳定性较好，易放大，推广。缺点是半连续或批式操作时，出渣清洗烦杂；连续操作固形物水高，总的分离故率低。（3）管式离心机：批式操作，转速高，固形分离效果较好，含水低，易扩大推广，但容量有限，处理量小，拆装频繁，噪声大。（4）倾桥式离心机：连续操作，易放大，易工业应用，操作稳定。但对很小颗粒固形物回收困难，设备投资高。（5）篮式离心机：实为离心力作用下的过滤，适于大颗粒固形物的回收，放大容易，操作较简单、稳定，适于工业应用。缺点是批式操作或半连续操作，转速低，分离效果较差，操作繁重，离心的设备投资高，操作成本高。3.3 过滤 过滤是利用过滤介质的孔隙大小进行分离。设备有板框式过滤机、平板（真空）过滤机、真空旋转过滤机等。特点是设备简单，操作容易，适合大规模工业应用，但分离速度低，分离效果受物料性质变化的影响，劳动强度大。3.4 膜分离 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径的大小而达到物质分离的目的。故可按分离粒子或分子大小给以分类，共有六种膜分离过程，其中以压力为推动力的有四种：具体分类见图（2）。各种膜分离过程的定义：（1）透析：在渗析中既有溶剂产生流动，又有溶质产生流动的过程。（2）电渗析：一种以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作。（3）微过滤：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，供不溶物浓缩过滤的操作。（4）反渗透：又称逆渗透，一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作。（5）超滤：一种以压力差为推动力，按照粒径选择分离溶液中所含的微粒和大分子的膜分离操作。（6）纳米过滤：一种以压力差为推动力，介于超滤和反渗透之间，从溶液中分离出300-1000小分子量物质的膜分离过程。 上述过程中渗透与透析在工业上的应用很少，电渗透是以电位差为推动力，除用于海水淡化，苦咸水淡化及水处理除盐工艺以外，还广泛用于化工生产的提纯，分离，合成以及综合利用，废水处理等方面。关于微滤、超滤、纳米过滤和反渗透这四种过程互有联系，但并无根本上的区别，实际上四种膜可用相同的方法制得，它们的分离范围从图（2）可见，相互间有一定程度的重叠，它们各自的优缺点如下：（1）微孔过滤：主要用于分离细胞，操作简便，效果好，可无菌操作，适用性好，易放大，但较易污染，分离效果与操作技巧关系密切，需精心保养，清洗，不适合精确分离。（2）超滤：用于粗分离，脱盐浓缩更换缓冲系统，可无菌、批式或连续操作，适用性好，易放大，但膜易污染，分离效果与物料处理及性质密切相关，需精心保养、清洗。（3）反渗透：主要用于无盐，无热源的水的制备和水分子物质浓缩，需要高压操作，对设备要求高，其它同上。（4）电渗析：平板式设备，使用广泛，可连续进行带电荷的物质分离，也可用于纯水制备，但电渗过程产生热量，对生物活性有影响，其他膜分离过程这里就不再赘述了。膜分离科学研究与应用很多2002年的如：(1)陶瓷膜分离技术及其在食品工业中的应用/朱科学,周惠明(无锡江南大学食品学院,214036)/食品科技,2002(5):P810.综述了陶瓷膜分离技术的发展过程及其主要优缺点,并分类介绍了陶瓷膜分离技术在食品工业中的应用,最后对其发展趋势进行了展望.(2)连续微滤技术在反渗透预处理系统中的应用研究/谢长血(国家电力公司电力建设研究所)/电力设计水处理技术,2002,77(特刊):P2731,26.在大同第二发电厂的零排放项目中,采用Aquapure连续微滤技术代替常规的澄清过滤技术作为反渗透的预处理,并通过工业性试验验证了工艺的可行性.详细介绍了连续微滤技术本身以及它在反渗透预处理的应用情况,将连续微滤技术与传统的澄清过滤技术在技术经济方面比较进行论述.(3)一种新型的微滤膜技术/沙中魁,王同春(国家电力公司电力建设研究所)/电力设计水处理技术,2002,77(特刊):3637.介绍一种基本不需要预处理的连续微滤设备Aquapure微滤膜技术,同时描述了Aquapure微滤膜技术参数,并且与常规的澄清、过滤工艺进行了对比.(4)微滤设备在循环水排污水回收中应用试验研究/沙中魁,杨占琴(国家电力公司电力建设研究所)/电力设计水处理技术,2002,77(特刊):4045.由于循环水排污水中的含盐量很高,并有一定的悬浮物,为使其回收再利用必须过滤及脱盐处理,以除去悬浮物、降低含盐量.反渗透技术已成为我国许多领域中最可靠的脱盐技术.反渗透系统无需酸碱,不产生酸碱废水,运行成本较低,为此,循环水排污水回收过程中的除盐宜采用反渗透处理方案.并在大同二电厂进行了现场试验.(5)钨酸钠离子膜电解槽的研究/谭翎燕,赵蕾(郑州大学化工学院,450002)/河南化工,2002(5):1517.分析比较了几种钨酸钠离子膜电解槽的优缺点,并通过具体实验对比了不同极距、不同搅拌形式及有无填料对电能消耗的影响.(6)旋转管式膜分离技术的应用与研究进展/杨柳,陈文梅,褚良银,刘泉,汤潍蔚(四川大学生物医学工程中心,610065)/过滤与分离,2002,12(2):15.介绍了旋转管式膜分离器在工业生产中的应用,论述了膜分离性能和机理以及膜器环隙间流场的国外研究现状和进展,并指出了今后进一步研究的方向。3.5 萃取 在生物合成工业上，萃取也是一个重要的提取方法和分离混合物的单元操作，这是为萃取法具有：（1）传质速度快、生产周期短、便于连续操作，容易实现自动控制；（2）分离效率高，生产能力大等一系列优点，所以，应用得相当普遍。不仅对抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物常采用有机溶剂萃取法进行提取，而且近年来又开发了不使酶等蛋白质失活的双水相萃取法，已成功地应用了提取甲酸脱氢酶，-葡糖苷酶等，但因为聚乙二酵、葡聚糖等价格较贵，所以，还未广泛使用，下面对几种萃取方法稍加介绍：（1）有机溶剂萃取法：依靠有水和有机溶剂中的分配系数差异进行分离的萃取法。适用于有机化合物及结合有脂质或非极性侧链的蛋白质，反胶团系统较适于生物活性物质萃取，但萃取条件严格，安全性低，活性收率低。淮北煤炭师范学院化学系的邓凡政，石影，马丽华对3+、3+、2+、2+的非有机溶剂萃取分离进行了研究，水溶性高聚物的水溶液在无机盐存在下能分成两相，并提出了用此现象分离金属离子的某些条件。利用高聚物水溶液的非有机溶剂萃取分离与传统的有机溶剂萃取分离相比，具有不挥发、无毒、安全、分离速度快、操作简便等特点，为萃取分离法开拓了新的应用前景。（2）双水相萃取法：依靠分离物在不相容性的高分子水溶液形成的两相中的分配系数不同而分离，它的特点是：连续或批式萃取，设备简单，萃取容易，操作稳定，极易放大，适合大规模应用，将离子交换基团，亲和配基，疏水基团结合到高分子载体上形成的萃取剂可改进分配系数及萃取专一性。但成本较高，纯化倍数较低，适合粗分离。等8利用新型的50-5100/羟丙基淀粉()温度诱导双水相体系从菠菜中提取上述两种蜕皮甾族化合物。等9报道了用6000-24-2的双水相体系对黄芩苷和黄芩素进行萃取实验,由于黄芩苷和黄芩素都有一定的憎水性,被主要分配在富含的上相,且分配系数随结线长度增加近似表现为-的线形关系,两种物质的值最大可达30和35,分配系数随温度升高而降低,且黄芩苷的降幅比黄芩素大。李伟等10考察了黄芩苷在伴有温度诱导效应的/双水相系统中的分配行为,并实验分析了添加盐对黄芩苷分配状态的影响。上述两法的设备有：搅拌混合或柱混合离心分离机，离心萃取机，逆流萃取仪等。（3）超临界萃取：它是利用某些流体在高于其临界压力和临界温度时具有很高的扩散系数和很低的粘度，但具有与流体相似的密度的性质，对一些流体或固体物质进行萃取的方法。它的特点是：萃取能力大、速度大，且可通过控制操作压力和温度，使其对某些物质具有选择性，正开始应用于生物工程中。缺点是设备条件要求高，规模较小。超临界萃取技术的原理及特点超临界萃取技术(supercriticsl fluidextraction,SFE),是近二三十年发展起来的一种新型分离技术。超临界流体具有许多与普通流体相异的特性,如其密度接近于液体的密度,这就使得其对液体、固体物质的溶解能力与液体溶剂相当;其粘度却接近于普通气体,自扩散系数比液体大100倍,从而其运动速度和溶解过程的传质速率比液体溶剂提高很多。超临界流体还具有很强的可压缩性,在临界点附近,温度和压力的微小变化会引起超临界流体密度的较大变化,由此可调节其对物质的溶解能力。由于物质在超临界流体中的溶解度随其密度增大而增大,所以萃取完成后稍微提高体系温度或降低压力,以减小超临界流体的密度,就可以使其与待分离物质分离。所选的超临界流体介质与被萃取物的性质越相似,对它的溶解能力就越强。因此,正确选择不同的超临界流体作萃取剂,可以对多组分体系进行选择性萃取,从而达到分离的目的。SFE有许多传统分离技术不可比拟的优点,诸如过程易于调节、达到平衡的时间短、萃取效率高、产品与溶剂易于分离、无有机溶剂残留、对热敏性物质不易破坏等,因此,在众多领域有着广阔的应用前景。但由于CO2是一对称分子,偶极距为0,极化率只有25.610-26,且极性随压力增大无明显增加,故用单一的CO2作萃取剂时只表现出对低极性、亲脂性化合物较强的溶解能力,大多数极性较强的组分则难溶于超临界状态下的CO2之中,于是研究者们又提出了在超临界CO2中加入极性溶剂的混合超临界流体萃取技术,即第二类CO2-SFE技术。MoraesMD等10用10%CH3OH-CO2超临界体系萃取西番莲科植物中的黄酮类化合物,并与传统溶剂提取法进行了比较。LopezavilaV等用15%C2H5OH- CO2超临界体系进行了胡椒属植物中内酯类化合物的萃取研究。（7）（4）反胶束萃取法：反胶束或逆胶束是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集物。反胶物溶液是透明的，热力学稳定的系统，若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，可使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。影响反胶束萃取蛋白质的主要因素有：水相pH值，离子强度，表面活性剂类型，表面活性剂浓度，离子种类等。其萃取蛋白质的应用主要有：分离蛋白质混合物，浓缩-淀粉酶，从发酵液中提取胞外酶、直接提取胞内酶，用于蛋白质重性等，可见，反胶束萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径。如Rahaman等采用浓度为0.25mol/的AOT/异辛烷反胶束溶液,研究了从全发酵液中提取和提纯碱性蛋白酶的方法.通过优化过程参数,净化因子可高达6.三级错流操作时,酶的提取率为50%,利用这一技术可使纯化和浓缩一步完成.oklen等通过实验控制值和kcl浓度,成功地实现了核糖酸酸酶、细胞色素和溶菌酶的分离,分离前后的HPLC图谱表明反胶束萃取分离酶是非常有效的.VanTRiet实现了 淀粉酶的连续萃取和反萃操作,可使 淀粉酶浓缩8倍.初步显示了这一技术在工业上有着巨大的应用前景.STChou等用AOT/异辛烷从鸡蛋中提取溶菌酶,鸡蛋蛋白用0 05mol/含0 1 mol /LKCl的磷酸缓冲液(pH9 2)稀释10倍,水相与同体积的含0 05mol/LAOT的异辛浣液混合,在10下保持50min,萃取后,含溶菌酶的反胶束体系再与等体积的含1mol的0 05mol磷酸缓冲液(pH11 8)混合,30下45 min.提取出的蛋白活性为天然状态的90%,酶活力达7 3104/mg,较绝.(11)（5）凝胶萃取法：凝胶是化学键交联的高聚物溶胀体，就其化学组成而言，通常可分成三大类：（1）疏水性有机凝胶；（2）亲水性有机凝胶；（3）非溶胀性无机凝胶。其中亲水性有机凝胶具有两大特性：（一）凝胶的胀缩特性，即具有交联网络的聚合物凝胶，能吸收比自身重量大数十倍及至数百倍的溶剂而溶胀。对于一种溶液，凝胶按各组分的分子大小选择性地吸收，小分子物质和无机盐能进入凝胶，而大分子物质则被排斥，因此可将凝胶作为固态萃取剂，用于对溶液中大分子物质的浓缩和净化。（二）相变特性。即在某一物化条件下，吸水凝胶可突然收缩而释放出所吸收的水或其他溶剂，使其体积发生急剧的，大幅度的变化。这一性质不仅使凝胶在萃取操作中便于再重复使用，而且可能导致的多种潜在用途。由于凝胶萃取具有能耗小，萃取剂易再生，设备与操作简单，对物料分子不存在机械剪切或热力破坏等优点，故适用于从稀溶液中提取有机物或生物制品，如淀粉脱水，发酵液中的抗生素的提取以及遗传工程菌中蛋白质的提取等，还可能在一定程度上替代膜分离和凝胶层析等过程。如中国科学院化工冶金研究所利用酸敏型(12)和电敏型聚丙烯酰胺类凝胶(13)浓缩了淀粉酶和葡聚糖，就取得了良好的效果。3.6 色谱法 色谱分离是一种高效的分离技术，其优点为分离效率高，设备简单，操作方便、条件温和，能适应各种不同要求的分离。其缺点为处理量少，不能连续操作。但据有最近报道，国外能用计算机来控制每次循环中的加料，展层、检定等操作，下面简要谈谈各种色谱法的原理及优缺点。（1）离子交换色谱：利用被分离的各组分的电荷性质及数量不同，与离子交换剂的吸附和交换能力的不同而达到分离的目的，其过程适于带电荷的大、中、小及生物活性或非生物活性物质分离纯化，纯化效率较高，应用广泛，可用于实验室和工业生产，可柱式操作也可搅拌式操作。缺点：操作较复杂，测试消耗较大，成本高，有稀释作用，放大困难，离子交换剂需再生后方可再用；（2）吸附色谱：依靠范德华力，极性氢键等作用将分离物质吸附于吸附剂上然后改变条件洗脱，达到纯化目的。特点是吸附剂种类繁多，可选择范围和应用范围广，吸附和解吸条件温和，不需复杂的再生，可柱式式搅拌式操作。但选择性低，柱式操作放大困难；（3）亲和色谱：依据目的物与专性配基的相互作用进行分离。优点；选择性极高，纯化倍数和效率高，生物活性收率高，可从较复杂的混合物直接分离目的产物。缺点：成本高，配基亲和稳定性差，使用寿命有限，亲和材料制备复杂，放大困难；（4）疏水色谱：依靠疏水相互作用进行分离。应用广，选择性较好，使用稳定性好，但成本较高，放大困难，需严格控制条件，保证活性收率；（5）凝胶色谱：依据分子大小进行分离。其适合生物大分子的分离纯化，分离条件温和，活性收率较高，选择性和分辨高，应用广，可工业应用，但放大较困难，稀释度高，操作不易掌握；（6）反相色谱：以有机溶剂为固定相，含水的溶剂为流动相所进行的层析分离技术，特点：反相层析可用来分离非相性、极性和离子化合物，分离效果好、速度快、方法的后处理比较方便。缺点：造成蛋白质构象的变化和失活采用乙腈、甲醇等价格高且有一定毒性的试剂，使其应用受到限制。 各种色谱分离方法应用很广，其中真空液相层析(简称VLC)是近年来在国外化学实验室中迅速发展起来的一种新的层析技术。它是利用柱后减压,使洗脱液迅速通过固定相,从而很好地分离样品。真空液相层析具有快速、简易、高效、价廉等优点,目前已成功地用于萜类、木脂素、生物碱等生物活性天然产物的分离14,15。真空液相层析的特点真空液相层析每收集一个流分均需将柱子抽干,相当于综合了制备薄层色谱(PTLC)和真空抽滤技术。由于固定相颗粒细小,表面积较大,分离速度快,一般几小时即可完成。由于减少了涡流与扩散现象,分离效果较好。真空液相层析不同于常压柱层析和快速柱层析,后者洗脱剂是连续的,在操作过程中不能间断,而且快速柱层析采用柱前加压,比较而言真空液相层析所用设备极其简单、便宜,操作方便。同时,真空液相层析处理样品量可大可小。几十克的样品仍能以较快的速度完成。3.7 树脂法树脂是一种惰性的高分子聚合物，具有三维网状结构，不溶于酸、碱、有机溶剂，对氧、热和化学试剂稳定，机械强度高。它在生化物质的提取、浓缩、纯化、分离、脱盐、转化、中和及脱色操作单元上有着广泛的应用，具有高效、设备简单、操作方便、易于自动化、减少三废有利于保护环境等优点。 根据使用树脂的分离纯化操作可分为交换法和容器法两种。其原理都是利用树脂与产物结合，让产物保留在树脂上与杂质分开，再由树脂上洗脱产物以及让杂质与树脂结合直接流出产物。两种方法示意如图（三）。所用的树脂包括两大类：一类称为吸附树脂，另一类为离子交换树脂。其中，吸附树脂的作用机理是以吸附为特征的，而离子交换树脂的作用机理是以树脂上离子性功能团与溶液中离子间作用力（库仑力）为主的。吸附树脂的应用范围较广，可用于抗生素、维生素、酶等生化物质的分离纯化。而离子交换树脂用途更广，如L-赖氨酸的提取等，也可用于处理各种废液如含酚废液等，效果显著。（10）3.8 其他分离方法 其他分离方法如，一般的物理、化学方法，如破碎、干燥等。就干燥来说又有真空干燥、真空冷冻干燥、流化床干燥、喷雾干燥等过程就不再赘述了。4、生物分离技术研究趋势高效集成化从发展趋势来看，生物分离技术研究的目的是要缩短整个下游工程的流程和提高单项操作的效率，以前的那种零敲碎打的做法，既费时、费力，效果又不明显，跟不上发展的步伐。现在对整个生物分离过程的研究要有一个质的转变，并认为可以从两个方面着手，其一，继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术；其二，进行各种分离技术的高效集成化。目前出现的新型单元分离技术，如亲和法、双水相分配技术、逆胶束法