第十章--氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验.ppt

第十章氨基酸 多肽因子和蛋白质类药品检验 第九章抗生素类药物分析与生物检定法 基本要求 掌握氨基酸定性鉴别的方法 熟悉氨基酸特殊杂质及安全性检查 掌握氨基酸含量测定方法 掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法 熟悉多肽因子类药物的检查方法 掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法 掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法 掌握蛋白质含量测定和效价测定方法 了解几种氨基酸 多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程 第九章抗生素类药物分析与生物检定法 基本内容第一节氨基酸类药品检验第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验第三节几种氨基酸 多肽因子和蛋白质药物的质量分析 第一节氨基酸类药品检验 氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱 蛋白质缺损所引起的一系列疾病的重要生化药物 也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂 有着广泛的生化作用和临床疗效 目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大 创制了一些新的生化药物 如甲基酪氨酸治疗嗜铬细胞瘤氧苯丙氨酸用于类癌瘤综合征偶氮丝氨酸治疗白血病乙酰羟脯氨酸用于治疗类风湿关节炎 第一节氨基酸类药品检验 氨基酸为白色晶状体 熔点很高 多在熔融时分解 都能溶解在强酸强碱中 形成的盐多能溶于水 氨基酸在等电点 pI 时溶解度最小 最稳定 中性pI值在5 6 3左右 酸性pI值在2 8 3 2左右 碱性氨基酸的pI值在7 6 10 8左右 第一节氨基酸类药品检验 一 氨基酸的定性鉴别旋光度 熔点 溶解度 纸层析 氨基酸自动化分析 气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据 1 化学鉴别法氨基酸的鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与茚三酮显蓝紫色 采用茚三酮显色法 中国药典 2010年 二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别 如要对某种氨基酸加以鉴别 可借助于一些特定的显色反应 第一节氨基酸类药品检验 1 茚三酮反应茚三酮在酸性溶液中与 氨基酸共热 引起氨基酸氧化脱氢 脱羧反应 最后生成紫色物质 第一节氨基酸类药品检验 2 在室温下氨基酸与亚硝酸反应 生成氮气 在标准条件下测定生成氮气体积 即可计算氨基酸的量 注 生成的氮气只有一半来自氨基酸 第一节氨基酸类药品检验 3 第一节氨基酸类药品检验 4 第一节氨基酸类药品检验 5 第一节氨基酸类药品检验 6 第一节氨基酸类药品检验 7 第一节氨基酸类药品检验 8 乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色 第一节氨基酸类药品检验 9 组氨酸的侧链咪唑基也能与重氮苯磺酸反应形成与Pauly反应相似的化合物 呈棕红色 第一节氨基酸类药品检验 10 借助这些特定的显色反应可以对氨基酸进行鉴别 第一节氨基酸类药品检验 2 光谱鉴别法 1 紫外吸收光谱法在20种天然氨基酸中 只有酪氨酸 色氨酸和苯丙氨酸在紫外区有最大吸收 酪氨酸的 max 275nm 275 1 4x103苯丙氨酸的 max 257nm 257 2 0 x102色氨酸的 max 280nm 280 5 6x103 1 酪氨酸2 色氨酸3 苯丙氨酸 第一节氨基酸类药品检验 这三种氨基酸可以通过紫外吸收光谱加以鉴别 精密称取酪氨酸 色氨酸 苯丙氢酸各适量 用水制成每1mL含20 g 色氨酸 40 g 酪氨酸 200 g 苯丙氨酸 在波长230 300nm测定各氨基酸的吸收光谱 如右图 第一节氨基酸类药品检验 2 红外吸收光谱图氨基酸在红外区都有特性图谱 可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别依据 用红外分光光度法进行氨基酸鉴别时 除另有规定外 通常固体供试品均采用溴化钾片法 在400 667cm 1范围内测定其吸收图谱 所得的吸收图谱各主要吸收峰波长和各吸收峰间的相互强度关系均应与对照的图谱一致 第一节氨基酸类药品检验 3 薄层色谱鉴别法在薄层板上点样 通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸 1 薄层板的制备 第一节氨基酸类药品检验 2 十一种氨基酸混合液 色 蛋 亮 异亮 甘 赖 苏 缬 苯丙 组 精 与对照液的制备 第一节氨基酸类药品检验 3 点样 展开和显色吸取混合液和对照液各3 L 分别点于同一薄层板上 以正丁醇 水 异丁酸 醋酸 50 50 5 7 之上层作展开剂 进行单向三次展开 展开约15cm 每次必须待溶剂挥发尽后 再进行下一次展开 喷以显色剂 吲哚醌1g 溶于100mL无水乙醇和10mL冰醋酸中 置100 干燥5 10min至显色完全为止 第一节氨基酸类药品检验 本层析系统中 由于分离的程度与各种氨基酸显出不同的颜色 可以区别十一种氨基酸 用茚三酮 硝酸钠试剂亦能显出不同颜色的色斑 且灵敏度较高 用E Merck规格微晶纤维素比其他规格的微晶纤维素的分离效果和重现性较好 第一节氨基酸类药品检验 3 点样 展开和显色吸取混合液和对照液各3 L 分别点于同一薄层板上 以正丁醇 水 异丁酸 醋酸 50 50 5 7 之上层作展开剂 进行单向三次展开 展开约15cm 每次必须待溶剂挥发尽后 再进行下一次展开 喷以显色剂 吲哚醌1g 溶于100mL无水乙醇和10mL冰醋酸中 置100 干燥5 10min至显色完全为止 第一节氨基酸类药品检验 二 氨基酸特殊杂质及安全性检查1 特殊杂质检查氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸 用薄层色谱法进行限量检查 将样品配成一定浓度的供试品液 取一定量供试品液稀释后作为对照液 在同一硅胶G薄板上 一般用正丁醇 水 冰醋酸 3 1 1 展开晾干后 喷茚三酮的丙酮溶液显色 规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点 以此限制其他氨基酸的含量 第一节氨基酸类药品检验 氨基酸和有些小分子多肽药物是经过酶解或化学方法裂解大分子蛋白后经层析或超滤等方法得到的小分子物质 因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要 方法 取适宜浓度的样品溶液 加等体积的20 磺基水杨酸溶液 溶液不发生浑浊则判定无蛋白质 第一节氨基酸类药品检验 2 安全性检查影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质 主要为热原的含量 中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查 采用家兔法 将一定剂量的供试品 静脉注入家兔体内 在规定时间内观察家兔体温升高的情况 以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定 第一节氨基酸类药品检验 三 氨基酸含量测定1 茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时 氨基酸被氧化分解生成醛 放出氨和二氧化碳 水合茚三酮则成还原型水合茚三酮 然后还原型茚三酮与氨 另一分子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物 最大吸收值的波长为570nm 第一节氨基酸类药品检验 茚三酮反应为一切 氨基酸所共有 反应灵敏 根据反应所生成的蓝紫色深浅 可以测定氨基酸含量 本法可允许的测定范围是0 5 50 g氨基酸 该法又分为Yemm法 Rosen法和Hydrindantin法 第一节氨基酸类药品检验 1 Yemm法取样品1 0mL 含0 02 0 5 mol L氨基酸 加枸橼酸缓冲液 枸橼酸21g溶于100ml水中 加1 0mol L氢氧化钠溶液200mL 加水至500mL 0 5mL 茚三酮溶液 茚三酮2 5g溶于50mL甲基溶纤剂中 0 2mL 氰化钾溶液 0 01mol L氰化钾溶液5mL与25mL甲基溶纤剂混合 1 0mL 充分混匀 沸水浴加热15min 冷却 加入稀释剂3 5mL 于570nm波长处测定 按标准曲线计算出含氨基酸的量 如所测氨基酸种类不明时 可用亮氨酸作标准曲线 第一节氨基酸类药品检验 2 Rosen法该法是Yemm法的改良 取样品1 0mL 加茚三酮溶液 茚三酮3g溶于100mL甲基溶纤剂中 及氰化钠溶液 氰化钠490mg溶于1L水中 取该溶液20mL 加醋酸缓冲液至1L 各0 5mL 充分混匀 沸水浴加热15min 立即加50 V V 异丙醇 充分搅拌 放冷 比色 计算 3 Hydrindantin法取茚三酮20g及茚烷酮 Hydrindantin 3g溶于750mL甲基溶纤剂及4mol L醋酸缓冲液 醋酸钠272g溶于适量水中 加冰醋酸50mL 加水至500mL 250mL中 混合作为显色指示剂 取样品1 2mL 加等量显色指示剂 以下操作同上法 第一节氨基酸类药品检验 2 三硝基苯磺酸 TNBS 法三硝基苯磺酸 TNBS 是定量测定氨基酸的重要试剂之一 TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应 先形成中间络合物 带有等摩尔 如下式 第一节氨基酸类药品检验 中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的高峰 分别位于355nm和420nm附近 溶液一旦酸化 中间络合物转化成三硝基苯氨基酸 TNP氨基酸 420nm处的吸收值显著下降 而350nm附近的吸收峰则移至340nm处 第一节氨基酸类药品检验 利用TNBS与氨基酸反应的这一特性 可在420nm处 偏碱性溶液中 或在340nm 偏酸性溶液中 对氨基酸进行定量测定 本法允许的测定范围是0 05 0 4 mol氨基酸 第一节氨基酸类药品检验 3 铜复合物紫外吸收法在合适的pH值条件下 2mol 氨基酸与1mol铜离子形成氨基酸 铜复合物 第一节氨基酸类药品检验 此复合物呈蓝色 除了在620nm有吸收峰外 在230nm有最大吸收 其摩尔吸收系数在230nm处为620nm处的100倍左右 因此利用氨基酸 铜复合物的紫外吸收以进行氨基酸的微量测定 本法可允许测定范围是50 500 mol mL的氨基酸 适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定 第一节氨基酸类药品检验 4 甲醛滴定法氨基酸的NH3 基的pK值常在9 0以上 不能用一般指示剂作酸碱滴定测定 但甲醛可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用 促使NH3 上的氢离子释放 第一节氨基酸类药品检验 在pH值中性和常温条件下 甲醛迅速与氨基酸上的氨基 或亚氨基 结合 使下述平衡向右移动 促进氢离子释放 使溶液酸度增加 即可用酚酞作指示剂 以氢氧化钠来滴定 每释放出一个氢离子 就相当有一个氨基氮 从滴定所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量以及氨基酸含量 第一节氨基酸类药品检验 5 非水溶液滴定法中国药典 美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物 除谷氨酸用氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法 其余均根据其结构特性 采用了非水酸碱滴定法 用冰醋酸作溶剂 高氯酸作标准溶液滴定 电位法或指示剂法确定终点 适用于常量氨基酸的含量测定 第一节氨基酸类药品检验 第一节氨基酸类药品检验 1 直接滴定法适用于能溶于冰醋酸的氨基酸 精密称定氨基酸样品约50mg 溶于20ml冰醋酸中 加2滴甲基紫指示剂 用高氯酸标准液滴定 终点为紫色消失 呈现蓝色 计算 即得 用直接法测定的氨基酸有丙氨酸 精氨酸 组氨酸 亮氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 苏氨酸等 谷氨酸和门冬氨酸在高氯酸中不溶解 可将样品溶于2mL甲酸中 再加20mL冰醋酸 直接用标准高氯酸溶液滴定 第一节氨基酸类药品检验 2 回滴法适用于不易溶于冰醋酸而能溶于高氯酸的氨基酸 精密称定氨基酸样品约30 40mg 溶于5mL高氯酸标准液中 加2滴甲基紫指示剂 用醋酸钠溶液滴定剩余的酸 颜色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色为终点 计算 即得 用回滴法测定的氨基酸有赖氨酸 丝氨酸 半胱氨酸等 第一节氨基酸类药品检验 6 双波长分光度法双波长分光光度法的理论基础是差吸光度和等吸收波长 它采用测量波长 主波长 p PrimaryWavelength 和参比波长 次波长 s SecondWavelength 两个不同波长同时测定一个样品溶液 可以克服单波长测定的缺点 提高了测定结果的精密度和准确度 待测溶液在 p与 s两个波长处测定的差吸光度 A与试样中待测物质的浓度C成正比 第一节氨基酸类药品检验 复方氨基酸注射液中 采用双波长分光光度法测定氨基酸的含量 可消除共存组分干扰原理 不经分离直接测定 操作简便 准确 色氨酸测定波长280nm 酪氨酸等吸收波长303nm 酪氨酸测定波长240nm 色氨酸等吸收波长292nm 第一节氨基酸类药品检验 7 导数分光光度法在一定条件下 溶液组分的吸光度对波长的微分值与组分浓度仍保持线性关系 利用吸光度导数光谱可以定量测定组分含量 称为导数分光光度法 导数光谱数值测定有三种方法 切线法 峰谷法 峰零法 第一节氨基酸类药品检验 根据紫外吸收光谱选定导数光谱波长范围 应包含被测组分的最大吸收波长 按导数分光光度法测定被测混合组分的一阶 二阶和三阶导数光谱 选取其中能排除干扰组分干扰的导数光谱 在被测组分的最大吸收波长处用切线法 或峰谷法 峰零法 量得的振幅值D与标准品浓度做标准曲线 测定样品在最大吸收波长下的振幅值D 代入回归方程 计算样品浓度 第一节氨基酸类药品检验 用二阶导数光谱法测定复方氨基酸中色氨酸含量 浓度范围在9 45 g ml 1时 呈良好线性 平均回收率100 43 RSD为0 44 第一节氨基酸类药品检验 8 酰胺氮测定法双羧基氨基酸 谷氨酰胺 天 门 冬酰胺 的侧链上含有酰胺基 酰胺基上的氮比较容易释放 在较温和或短时间的水解条件下 即可释放完全 RCONH2 2H2ORCOOH NH4OH氨被释放出来 经过弥散 吸收于中央室含有指示剂的酸溶液中 反应完全后 直接在中央室用标定过的盐酸滴定 即可标出酰胺氮的含量 间接可求出氨基酸的含量 第一节氨基酸类药品检验 9 酸碱滴定法赖氨酸 lysine 片中赖氨酸的测定取本品20片 精密称定 研细 精密称取适量 约相当于赖氨酸0 15g 置烧杯中 加水25mL 滴加氢氧化钠滴定液 0 1mol L 用酸度计调节至pH值为7 0 加入预先调节至pH值9 0的甲醛溶液15mL 搅匀 再用氢氧化钠滴定液 0 1mol L 滴定至pH值为9 0 并持续30s 按加入甲醛液后所耗用氢氧化钠滴定液 0 1mol L 体积计算 每毫升氢氧化钠滴定液 0 1mol L 相当于9 132mg的C6H14N2O2 HCl 第一节氨基酸类药品检验 10 HPLC对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定 目前较多地采用了高效液相色谱法 HPLC 因大多数氨基酸没有紫外吸收 不能用紫外检测器测定 为改善被测物的检测特性 提高检测灵敏度 需进行化学衍生化 衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法 柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生 柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLC分离 第一节氨基酸类药品检验 衍生可改善被测物的检测特性 且可改变分离选择特性 经衍生化的氨基酸可用紫外或荧光检测器检测 据文献报道 用邻苯二甲醛柱前衍生和荧光检测的反相高效液相色谱法测定复方氨基酸注射剂中氨基酸含量 检测限为pg水平 用异硫氰酸苯酯柱前衍生紫外检测反相HPLC定量测定植物中氨基酸含量 检测限8 11 13 3pmol L 用亚硝酸衍生化 紫外检测的反相HPLC定量测定人体内的乙酰半胱氨酸 检测限为170nmol 用N 芘基马来酰亚胺修饰N 乙酰半胱氨酸 用荧光检测的反相HPLC测定 定量限为32nmol 第一节氨基酸类药品检验 11 其他仪器分析方法其他一些仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定 如杜鸣等在荧光计上附加互相垂直的偏振片消除溶剂散射光的影响和苯丙氨酸的干扰 用偏振荧光光度法同时测定氨基酸注射液及动植物浸出液中酪氨酸和色氨酸的含量 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质 具多种生理功能 是一大类非常重要的生化药物 蛋白质是呈两性解离的电解质 其离子基因除末端氨基和末端羧基外 还有侧链上的酸性或碱性基团 各种蛋白质分子有各自的等电点 在等电点时蛋白质的溶解度最小 稳定性差 易从溶液中沉淀析出 蛋白质对水亲和力很大 在可水溶液中形成亲水胶体 蛋白质分子构象受热 超声波 紫外光照射等物理因素和酸 碱 重金属 有机溶剂等因素的影响而变化 蛋白质变性后失去生物活性和结晶能力 同时黏度 溶解度 沉降系数和扩散系数也会发生变化 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 多肽因子类药物指分子量不算太大的 在体内含量极微 但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质 其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素 白细胞介素 胸腺肽 转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素 重组白细胞介素 重组乙肝疫苗等 天然来源的多肽因子药物 如胸腺肽 转移因子等 其分析方法与蛋白质类药物的分析方法基本相同 以基因工程重组技术生产的多肽因子类药物分析方法与蛋白质类药物的分析方法差异较大 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 一 多肽因子类药物的定性鉴别基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用SDS PAGE法和免疫印迹法 1 SDS PAGE法用SDS PAGE鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对照品 通过电泳结果的对比 确定所测样品是否与标准品有相同的迁移率 从而鉴别该品 缺点 必须有标准品 凝胶中多肽需保留生物活性 或能够复性 或电泳前可将检测配基与待测多肽共价交联 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 蛋白质免疫印迹电泳法 转移电泳 westernblot 原理 借助聚丙烯酰胺凝胶技术 将生物活性物质高效分离 分离后的样品可以原位 定量驱动或吸印在另一种固相载体 通常用醋酸纤维素薄膜 简称NC膜 上 能保持原有的生物活性 可以进行各种生物检测 免疫识别 扫描 积分和保存 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 1 基本操作分3个部分 聚丙烯酰胺凝胶电泳 转移电泳 即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上 检测或鉴定薄膜上的多肽条带 聚丙烯酰胺凝胶电泳先将待分离样品进行凝胶电泳分离 凝胶可用琼脂糖凝胶 也可用聚丙烯酰胺凝胶 可以是均一的 也可用梯度凝胶 凝胶缓冲体系中可含有各种变性剂 如SDS LDS 尿素等 可进行单向或双向电泳 也可用等电聚焦电泳 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 转移电泳将湿醋酸纤维素 NC 薄膜紧贴凝胶 凝胶与薄膜之间不能有气泡 否则在气泡所在部位的条带将不能转移 在NC膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤纸 也不能有气泡 再在两边贴上海绵 最后用塑料网框架夹紧 插入电泳槽 根据凝胶中样品所带电荷的性质 决定有NC膜的一边是靠近正极还是靠近负极一侧 电泳条件取决于凝胶类型 转移装置和蛋白质本身性质等 一般采用低电压和低电流 2mA cm2以内 缓冲液中一般含有20 的甲醇或乙醇 其作用主要是保持凝胶的几何形状 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 检测或鉴定NC膜借助非共价键吸附蛋白质 经转移后蛋白质条带就固定在NC膜上 完全保留凝胶中的蛋白谱 可直接用考马斯亮蓝 氨基黑10B等染色 如果利用蛋白质生物活性 或用蛋白质生物探针来检测 就要先用1 3 的牛血清蛋白或血红蛋白 或非离子去垢剂 0 3 吐温 20 等处理NC纸 以封闭NC纸上未吸附蛋白质区域 使其不再能吸附蛋白质 使用非离子去垢剂比较经济 但有可能把NC纸上的某些蛋白质洗掉 同时还要将NC纸反复洗涤以去除变性剂 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 使蛋白质恢复到天然态或生物活性 然后再与检测探针保温 如用ConA 伴刀豆球蛋白A 检测糖蛋白 用抗体检测其特异性的抗原 用激素检测其特异受体 用底物检测特异的酶等 如探针本身具有放射性 如125I标志ConA 或连有酶 如酶标抗体 或荧光探针 那么反应后应彻底洗涤 可立即进行放射自显影 或与底物来反应 或紫外灯下观察荧光 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 二 多肽因子类药物的检查1 分子量检查常用还原型SDS PAGE法检查分子量 用量约1 g 也可采用凝胶过滤法 例如Sephadecx系列 G 75 100 waters1 60 125 250 BackmanTSK2000SW 3000SW 4000SW 凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子量 而SDS PAGE是测定蛋白质亚基的分子量 同时用这二种方法测定同一蛋白质的分子量 可以方便地判断样品蛋白质是否是寡聚蛋白质 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 肽图分析肽图分析是指用酶解或化学降解蛋白质后 对生成的肽段进行分离 分析的技术 1 蛋白质的裂解方法 酶解法应用蛋白酶裂解蛋白质 利用各种蛋白酶对蛋白质分子肽键作用的特异性 如胰蛋白酶作用于碱性氨基酸 精氨酸和赖氨酸 的羧基端 酶解有时不完全 在此情况下 可加一些变性剂 4mol尿素 或用还原剂DTT还原 再用烷化剂 碘代乙酸 烷化成羧甲基半胱氨酸 它能很好地和方便地进行氨基酸定量分析 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 化学裂解法最常用的是溴化氰裂解法 溴化氰作用于Met羧基端和其次一个氨基酸形成的肽键 如 干扰素含4个Met 经溴化氰作用后生成5个肽段 其他化学裂解法还有BNPs 3 甲基吲哚 N 氰代琥珀酸亚胺等作用于Try x键 2 硝基 5 硫氰基苯甲酸作用于x Cys键 羟胺作用于Asp Glu键 稀酸 吡唑醋酸 作用于Asp Pro键 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 肽图分析最早称为Fingerprinting 指纹术 用在镰形细胞贫血症研究中 将HbA 血红蛋白A 和HbS 血红蛋白S 的分别用胰蛋白酶酶解 然后将它们分别进行电泳 再转动90 进行纸层析 Ingram用此法观察到HbA和HbS之间有一个肽斑点上的差别 进一步的肽顺序分析指出这仅是 珠蛋白链第6位上一个氨基酸残基的差别 HbA中为Glu 谷氨酸 HbS中为Val 缬氨酸 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 肽图分析最常用的方法有SDS PAGE电泳法 高效液相色谱法 HPLC 和毛细管电泳法 CE HPLC主要是用反相柱 根据肽段的长短和疏水性来分离 如果亲水性太强 则难于在柱上滞留而达不到分离效果 如果肽的疏水性很强 又难于洗脱下来 而CE法则可避免这些缺点 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 3 等电点测定等电点是蛋白质的物理化学常数 它表示蛋白质的带电性质 一般采用凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点 4 紫外吸收不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收 对于某种蛋白质或多肽来说 它的最大吸收波长是固定的 紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 5 纯度基因工程产品蛋白质纯度是一项重要指标 但它也是一项相对的指标 需根据实际要求而定 蛋白质纯度一般是指是否含有其他杂蛋白 而不包括盐 缓冲液离子 SDS等小分子在内 目前较常用的是HPLC法 包括凝胶过滤 各种反相HPLC 离子色谱 疏水色谱等 非还原SDS PAGE凝胶电泳法 毛细管电泳法 CE 等电聚焦电泳 此外也应用一些化学方法 观察末端是否均一 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 至少应用两种以上的方法 而且是两种不同分离机理的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠 常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的 而在离子色谱中却分辨为二个组分 反之亦然 又如一种样品用凝胶过滤法和SDS PAGE电泳证明是纯的 但这仍不充分 因为这两者机理相同 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 6 N 端氨基酸序列测定测定蛋白质或多肽的氨基酸序列是鉴别蛋白质的重要指标 50年代初 Edman采用异硫氰苯酯 PhenylisothioCyanate 简称PITC Edman试剂 首先建立了测定蛋白质的氨基酸序列的方法 1968年 Edman研制成功自动顺序仪 Secluencer 近年来 又有高度自动化 微量化的精确灵敏的气液顺序仪问世 在各种测定蛋白质氨基酸序列方法中 Edman降解法仍是最为准确 可靠的方法 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 1 原理Edman试剂的化学反应 从蛋白质的多肽链的N 端进行降解 一次只去掉一个氨基酸残基 经过反复循环反应 能依次得到一系列苯氨基硫甲酰氨基酸 PTH 氨基酸 分析鉴定PTH 氨基酸就可得到从肽N 端开始的氨基酸序列 主要反应分为三步 偶合蛋白质多肽链N 端氨基酸与PITC在无氧条件下 在pH8 9的缓冲液中进行偶合 生成苯基硫代氨甲酰基肽衍生物 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 裂解苯基硫代氨甲酰基肽的衍生物与无水三氟醋酸反应 释放出N 端的氨基酸 产生苯胺噻唑啉酮 anilinothiazolinone ATZ 衍生物和减少一个残基的多肽链 转位生成的ATZ衍生物极不稳定 必须迅速转化成苯基乙内酰硫脲 氨基酸 Phenylthiohydantion 简称PTH 后 进行鉴定 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 样品的处理 首先必须将蛋白质样品进行解聚成一条多肽长链分子 如果测定的样品分子中含有二硫键 必须将二硫键用氧化还原法拆开 得到含半胱氨酸的肽链还必须加以保护 避免二硫键重新聚合 含亚基的蛋白质分子 需将亚基拆开 纯化 分别测量 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 蛋白质多肽链的N 端必须是游离基团 有些蛋白质N 端被乙酰基 CH3CO 封闭 如乙酰细胞色素C 乙酰烟草花叶病毒等 有的蛋白质N 端为环谷氨酸 pyroglutamicacid 如兔IgG的重链 许多活性多肽等 都不能直接用Edman法降解 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 影响偶合反应的因素必须严格控制pH在8 9 过碱会导致PITC与一级胺 二级胺反应 从而影响PTH 氨基酸鉴定 偏酸将导致偶合反应不完全 严格控制在无氧条件下进行 氧化将导致二硫磺酸副产物的生成 及色氨酸被氧化而使反应终止 用高纯度缓冲液 各种试剂也必须经过再纯化 杂质中含醛会造成氨基被反应 以及形成Sehiff碱使蛋白质多肽链产生不纯的联结肽 而造成肽链氨基酸序列测定中断 控制反应时间及温度 延长反应时间和提高温度 都将导致副反应增加而影响测定 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 3 检测过去常用薄层层析法进行鉴定检查 但该法操作非常复杂 时间长 灵敏度和精确度都很差 近年来 大部分实验均采用高效液相法鉴定PTH 氨基酸 它既可定性又可定量 是目前最精确的方法 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 7 外源DNA含量测定基因工程产品在生产过程中 可能会因操作不当将DNA片段代入样品中 所以必须对样品进行外源残留DNA含量测定 一般规定残余DNA含量每个剂量小于100pg 通常用改进的Southern杂交法 又称为斑点杂交 Dotblot 即直接将被测样品点于醋酸纤维素膜上使之成为斑点 然后与探针DNA进行杂交 最后与标准DNA同样操作的结果对比 以确定残余外原DNA的含量 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 标记DNA常用放射性核素标记 利用放射自显影技术进行定量测定 近年来 试剂盒为实验带来了更大的方便 例如 BOEHTINGERMANNHEIM公司出品的地高辛标记的DNA标记检测试剂盒 它是通过无放射标记的地高辛与标记的DNA结合经杂交而形成的有颜色或荧光的检测物质 地高辛与dUTP经强碱作用形成新的复合物DIG 11 UDP标记物 该标记物与膜上的被检测DNA杂交显色而被测定 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 残余DNA的测定方法 1 样品 DNA标准品 一般采用发酵用的工程菌DNA稀释 10ng mL 1ng mL 100pg mL 1pg mL 将待测样品用蛋白酶K 37 消化4h 2 DNA变性将样品置沸水浴中加热2min 然后迅速置冰水中冷却 3 点样将经变性处理的样品点于干燥的醋酸纤维素膜上 1 L 点 紫外灯下照射5min 4 预杂交将膜置于塑料袋内 加入10mL标准杂交液 封口 68 孵育过夜 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 5 杂交塑料袋内加入标的探针DNA50 L 68 孵育6h 6 洗膜 孵育 封闭 漂洗 7 在10mL检测平衡液中平衡膜5min 8 在10mL新鲜配制的显色液中 孵育至膜显色完全为止 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 8 残余IgG含量测定有些基因工程蛋白质在工业生产中用单克隆抗体亲和层析法进行纯化 而在层析过程中 可能会有少量单克隆抗体被洗脱下来而混在纯化液中 这些单克隆抗体为异体大分子蛋白 如果混入样品 会给患者使用造成强烈过敏反应 因此必须进行单克隆抗体检查 一般规定应小于100ng 支 免疫球蛋白 IgG 的测定方法有多种 用于定性分析的有SDS PAGE 等电聚焦电泳和免疫学方法 用于定量分析的有蛋白定量 抗原定量 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 测定基因工程干扰素中的残余IgG的方法 1 将羊抗鼠IgG用包被液稀释至10 g mL 每孔加100 L 37 保温2h或4 过夜 2 每孔加100 L封闭液封闭 37 保温30min 3 将标准IgG稀释成100ng mL 50ng mL 25ng mL 12 5ng mL 6 25ng mL 3 125ng mL 1 563ng mL的溶液 每孔加100 L 4 样品每孔加100 L 37 保温2h 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 5 将HRP 羊抗鼠IgG以1 800稀释后 每孔100 L 37 保温30min 6 将4mg邻苯二胺溶于10mL底物缓冲液中 加30 过氧化氢15 L 摇匀 每孔100 L 37 保温30min 7 每孔加2mol L硫酸溶液50 L 终止反应 8 用酶标仪测OD492值 计算残余IgG含量 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 三 多肽因子类药物生物效价的测定生物制剂或生化制剂因受外界因素影响 温度 湿度 时间 生产过程的各环节等 而易导致其生物活性降低或全部丧失而失去药理作用 所以除要测定其含量外 还要测定其生物学活性以确定其是否具有体内或体外作用 1 免疫学测定法主要是采用ELISA定量测定样品的量 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 细胞病变抑制法该法主要用于干扰素的效价测定 一般采用CPE 细胞致病效应 抑制为基础的抑制微量测定法 1 材料准备 测定细胞人羊膜细胞Wish株 攻击病毒选用水泡性口腔炎病毒 VSV 作为攻击病毒 使用前先在选定测定细胞上滴定其CCID50 以感染24h后引起测定细胞出现 cpe的病毒稀释度为1个CCID50 该病毒的滴度为稀释度的倒数乘10 单位为CCID50 mL 完全培养液MEM培养液添加10 牛血清 测定培养液MEM培养液添加7 牛血清 攻毒培养液MEM培养液添加3 牛血清 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 操作 铺板弃去Wish细胞培养瓶中培养液 用PBS洗2次后消化和收集细胞 用完全培养液配成约25万 35万个细胞 mL的细胞悬液 接种于96孔培养板上 每孔100 L 37 5 CO2 培养4 6h 制备标准溶液取1支标准品用测定培养液稀释至1000U mL 制备样品溶液将待测样品用测定培养液稀释至1000U mL 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 另取96孔细胞培养板一块 每孔加入150 L测定培养液 在A6 A7各孔中每孔加入50 L标准溶液 在A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11各孔中每孔加入50 L各待检样品 每个待检样品做2个复孔 自A行取50至H行作4倍稀释 每孔留150 L余液 加样取 项的细胞培养板 将 项制备的溶液移入该细胞培养板中 每孔100 L 37 5 CO2 培养18 24h 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 制备病毒液攻击剂量为100TCID50 取保存的VSV用攻毒培养液稀释至工作浓度 功毒取制备好的细胞培养板 弃去上清 加入病毒液 每孔100 L 37 5 CO2 培养24h 镜检标准溶液的50 病变点在D或E行 染色 脱色 以630nm为参比波长 在570nm波长处测定吸收度 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 3 结果计算采用计算机程序或直线回归计算法进行计算处理 分别计算各试验样品的半效稀释倍数 即从样品溶液至相当于标准品50 最大效应点的稀释倍数 并按下式计算 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 3 3H TdR掺入同位素法原理 通过比较待测样品与标准品之间对检测细胞促增殖能力的强弱来确定待测样品的活性 在测试液中加入由3H标定的胸腺嘧啶 3H TdR 为细胞增殖过程中DNA合成的必备物质 3H TdR掺入量就代表了细胞增殖能力的强弱 3H TdR用同位素液闪计数仪来测定 该方法具有敏感性高 特异性强 稳定性好等优点 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 1 CTLL 2细胞短期培养3H TdR掺入法取传代第2 3d 生长旺盛的CTLL 2细胞 用RPMI1640培养液将细胞洗两次后 用含10 小牛血清 5 10 5mol L2 巯基乙醇的RPMI1640培养液配成1 105 mL细胞悬液 用96孔细胞培养板 每孔中加入100 L不同稀释度的待测样品 同时设置培养液对照和各种浓度的标准品对照 再向各孔中加入100 L的CTLL 2细胞 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 置37 5 CO2孵箱中培养18h或24h 然后每孔中加入50 L的18 5kBq3H TdR 继续培养4 6h 用多头细胞收集仪收集细胞 用液闪计数仪检测细胞的3H TdR掺入值 通过比较待测样品与标准品使细胞掺入3H TdR量的多少计算样品的活性 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 鼠脾细胞增殖检测法无菌取C57BL 6小鼠脾脏制成单细胞悬液 以 0 5 1 0 107 mL细胞浓度悬浮于含有5 小牛血清 5 10 5mol L2 巯基乙醇 2 5 g mLConA的RPMI1640培养液中培养48 72h 离心 1500r min 10min 弃去上清后加入0 05mol L 甲基甘露糖苷 置40 温育45min 然后用Hanks液将细胞洗两次 用含10 小牛血清 5 10 5mol L2 巯基乙醇 0 1mol L 甲基甘露糖苷的RPMI1640培养液配制成2 106 mL细胞悬液 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 用96孔细胞培养板 每孔加入100 L不同稀释度的待测样品 同时设置培养液对照和各种浓度的标准品对照 再向各孔中加入100 L的细胞悬液 置37 5 CO2孵箱中培养18h 然后每孔中加入50 L的18 5kBq3H TdR 继续培养4 6h 用多头细胞收集仪收集细胞 用液闪计数仪检测细胞的3H TdR掺入值 通过比较待测样品与标准品使细胞掺入3H TdR量的多少计算样品的活性 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 3 Ando氏微量测定法取肝素抗凝全血 经Ficoll Hypaque密度梯度离心 取单个核细胞 用含10 小牛血清的RPMI1640培养液配成5 105 ml细胞悬液 置37 5 CO2孵箱中培养10天后 用Hanks液将细胞洗两次 用含10 小牛血清的RPMI1640培养液配成2 105 mL细胞悬液 用96孔细胞培养板 每孔加入100 L不同稀释度的待测样品 同时设置培养液对照和各种浓度的标准品对照 再向各孔中加入100 L的细胞悬液 置37 5 CO2孵箱中培养4d 然后每孔中加入74kBq3H TdR 继续培养4h后 收集细胞 用液闪计数仪检测细胞的3H TdR掺入值 计算样品的活性 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 4 微量酶检测法 MTT 法该法通过比较待测样品刺激检测细胞增殖能力的强弱来确定样品的活性 细胞增殖反映能量代谢活跃 可产生大量的能量 供合成多种大分子物质和细胞分裂所需 细胞能量代谢的水平与细胞合成DNA水平基本平行 因此 测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞的增殖情况 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 四甲基偶氮唑盐 3 4 5 dimethyhhiazol 2 y1 2 5 di phenyhetrazoliumbromide MTT 是一种淡黄色的可溶性化合物 活细胞特别是增殖期的细胞可通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状Formazan沉积于细胞内或细胞周围 而且Formazan的量与细胞的增殖程度呈正比 Formazan经异丙醇作用后可溶解显色 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 Mosman等 1983 根据上述原理首创了MTT比色分析法用于检测能够刺激细胞增殖的生物样品的活性 1 主要试剂MTT溶液将MTT按5mg mL浓度溶解于PBS中 过滤除菌后 置4 下避光保存 酸化异丙醇含0 04mol L盐酸的异丙醇 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 2 方法用含10 小牛血清的RPMI1640培养液将检测细胞 例如CTLL 2或ConA活化的小鼠脾细胞 配成5 105 mL细胞悬液 向96孔细胞培养板的每孔加入100 L上述细胞悬液 再取100 L不同稀释度的待测样品和各种浓度的标准品对照品分别加入各孔中 每个稀释度3个复孔 并同时设置培养液对照孔 置37 5 CO2孵箱中培养48h 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 离心 1500r min 5min 从各孔中轻轻吸取100 L上清液 弃去 各孔再加入10 LMTT溶液 置37 5 CO2孵箱中孵育4 6h 各孔中加入100 L酸化异丙醇 并充分混合 静置数分钟 让形成的Formazan充分溶解 在酶标仪上选择检测波长590nm 参考波长630nm测定OD值 将待测上清的OD值与标准品OD值比较 即得待测样品的活性 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 3 MTT法的优点与3H TdR掺入法相比 MTT法操作简便 测定时间大大缩短 特别是一次性测定大量样品时 而且避免了使用放射性同位素和购置昂贵的设备 所需试剂仅是MTT和酸化异丙醇 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 4 应注意的问题 酸化异丙醇后要在1h内进行测定 如1h内无法测定 可将未加酸化异丙醇的细胞培养板暂放在4 中保存 测定前将细胞培养板取出 在室温放置数分钟后再加入酸化的异丙醇进行测定 在每孔中含有100 50000个检测细胞时 细胞数与所测的OD值呈正相关 因为酚红可以干扰OD值的测定 所以 MTT法最好选用无酚红的RPMI1640培养液 但这种培养液目前在我国难以购买 可以设置RPMI1640培养液对照孔以排除酚红的影响 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 5 改良MTT法为了能更加简便 快速地一次测定大量样品 Tada等 1986 对MTT法在以下几方面进行了改良 将加MTT前的培养时间从48h缩短为24h 用10 SDS 0 01mol LHCl代替酸化异丙醇溶解Formazan结晶 避免了人工混匀和异丙醇引起的小牛血清沉淀现象 省掉离心 弃上清的过程 可在溶解Formazan结晶后5天内测定OD590值而变异值很小 而常规MTT法需在1h内比色测定 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 5 红细胞生成素 EPO 体外活性测定法 ELISA测定法 3H TdR掺入法体外测定EPO具有简便 可靠 敏感的特点 可在24h内完成 检测灵敏度可达0 002U mL ELISA试剂盒测定法 1 检测所用试剂盒为QUANTIKINEIVDEPOELISAR DSastemIncUSA 2 将样品初步稀释至活性为20 200mU mL 采用3步稀释法 稀释后在微量震荡器上将样品混匀 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 3 按照试剂盒说明书进行操作 在微孔板上每孔加100 LEPO稀释溶液 在上述微孔中分别加入100 L不同浓度的标准品及稀释后的样品 用薄膜封闭微孔 将微孔板置于室温孵育2h 吸去微孔中的液体 每孔加200 L结合液 用薄膜封闭微孔 将微孔板置于室温孵育2h 吸去微孔中的液体 每孔加300 L清洗液清洗4次 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 每孔加200 L基底溶液 substrateSolution 必须在配制后15min内使用 注意不要加出气泡 将微孔板置于室温孵育25min 每孔加100 LSubstrateStopSolution终止反应 将微孔板置于酶标仪上 在450nm波长处测OD值 最后 根据标准品的浓度和OD值求标准曲线方程 计算样品的浓度即体外活性 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 6 EPO体内生物学活性测定法 网织红细胞计数法 本法以给药小鼠后 取血涂片计数网织红细胞和红细胞数 并计算两者的比值并经过统计学处理来计算样品的体内活性 1 选择6 7周 体重18 20g雌性小鼠 随机分组 每组6只 2 标准品和样品各设3个剂量组 每个剂量组用2只鼠 分别做好标志 3 将EPO标准品和待测样品分别用生理盐水稀释成30U mL 稀释过程中加100 L白蛋白做保护剂 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 4 连续三天给小鼠皮下注射EPO 剂量分别为2U 只 4U 只 8U 只 5 于第四天由每只小鼠眼眶采血 分别做涂料片 滴2 3滴鲜血于涂有煌焦油兰 1 乙醇染液 的载玻片上 混匀 染色数分钟后推片 6 血涂片进一步用瑞氏色素 1 600甲醇染液 复染数分钟 7 用pH6 8磷酸盐缓冲液冲洗干净 自然晾干 8 在显微镜油镜下计数网织红细胞数和红细胞数 并计算两者的比值 9 将上述所得数据进行统计学处理 计算EPO体内活性 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 四 蛋白质类药物的鉴别和检查1 蛋白质类药物的鉴别蛋白质类药物可根据其各自的物理 化学性质 生理作用等采用不同的方法进行鉴别 1 茚三酮反应组成蛋白质的氨基酸都能与茚三酮反应生成紫色化合物 因此蛋白质也有此反应 这是蛋白质鉴别的最常用方法 2 福林酚反应或双缩脲反应这两种常用来测定蛋白质的含量 但有时也用于蛋白质的鉴别 3 紫外吸收由于组成蛋白质的氨基酸中 酪氨酸 色氨酸 苯丙氨酸在紫外区的光吸收特性 因此可利用此种特性鉴别蛋白质 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 五 蛋白质含量测定和效价测定1 蛋白质含量测定蛋白质的定量可用化学方法如凯氏定氮法 双缩脲法 福林酚法 紫外光吸收法来测定 也可用染色法 如氨基黑 考马斯亮蓝测定 此外还可用荧光激发 氯胺T 放射性核素计数等灵敏度较高方法 上述方法中凯氏定氮法 福林酚法 紫外光吸收法最为常用 它们操作简单 设备便宜 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 1 凯氏定氮法凯氏定氮法常用来测定有机物的含氮量 原理 A 含氮有机物的消化当含氮有机物与硫酸共热时 分解出氮 二氧化碳 水 氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵 分解反应进行得很慢 可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进反应 其中硫酸铜为催化剂 硫酸钾或硫酸钠可提高沸点 过氧化氢也能加速反应 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 B 铵离子的生成消化完了以后 在凯氏定氮瓶中加入强碱 氢氧化钠溶液 消化液 使硫酸铵分解 放出氨 用水蒸汽蒸馏法 将氨蒸入过量的硼酸溶液中 氨与溶液中的氢离子结合 生成铵离子 使溶液中氢离子浓度降低 C 测定用强酸滴定 直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止 所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 操作方法常用的凯氏定氮法分为常量法和半微量法两种 A 常量法取被测样品适量 含氮量约25 30mg 精密称定 样品如为固体或半固体 可用滤纸称取 并连同滤纸置于燥的500mL凯氏烧瓶中 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 依次加入硫酸钾 或无水硫酸钠 10g和硫酸铜粉末0 5g 再沿瓶壁缓缓加硫酸20mL 在凯氏烧瓶口放一小漏斗并使烧瓶成45 斜置 用直火缓缓加热 使溶液的温度保持在沸点以下 等泡沸停止 强热至沸腾 待溶液成澄明的绿色后 继续加热30min 放冷 第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验 沿瓶壁缓缓加水250mL 振摇混合 放冷后加40 氢氧化钠溶液75mL