盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白的初步研究.docVIP

盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白2摘要：鸡蛋清原液用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液稀释5倍，4下静置至少6 h，采用30%80%不同饱和度的硫酸铵分离卵白蛋白，采用Bradford法测定盐析后蛋白含量，SDS-PAGE检测其纯度，结果表明，60%饱和度的硫酸铵分离鸡蛋清卵白蛋白效果较好。关键词：盐析法；鸡蛋清；卵白蛋白 鸡蛋中含有丰富的生命必需元素，营养价值较高。随着对鸡蛋生理生化活性研究的不断深入，对鸡蛋的利用逐渐超越简单的初加工阶段，趋向于开发具有较高附加值的生理活性物质1-2。蛋清是一种以水为分散介质，以蛋白质为分散相的典型胶体物质，鸡蛋清中的蛋白质含量约为总量的11%，除不溶性的卵黏蛋白外，均为可溶性蛋白质。卵白蛋白、卵铁传递蛋白和溶菌酶是其中3种主要的生物活性蛋白质。卵白蛋白是蛋清中主要的活性蛋白，约占蛋清蛋白质含量的54%。卵白蛋白具有许多功能特性3，例如，卵白蛋白对胰蛋白酶有强烈抑制作用，能部分抑制枯草杆菌蛋白酶活性4；Fujita用胃蛋白酶水解卵白蛋白，并用RP-HPLC分离出具有血管舒张活性的物质OA358-3655；Davalos和Xu等研究发现，卵白蛋白酶降解物具有强抗氧化活性的多肽6-7。卵白蛋白是生物化学中一种重要的参考蛋白质，包含所有的必需氨基酸，而且比例合理。高度纯化和结晶的卵白蛋白可以作为载体、稳定剂、封阻剂或标准物等，也可作为营养添加剂应用于食品工业。虽然许多学者对卵白蛋白进行了大量研究，但对其生物学特性和功能的了解仍不够全面，本文采用硫酸铵盐析的方法，对鸡蛋清中的卵白蛋白进行了快速初步分离，为其进一步开发利用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料新鲜鸡蛋，购自超市；卵白蛋白标准品，Sigma公司；硫酸铵分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；透析袋，Amersham Bioscicnccs(SF)Corp。1.2 试验方法1.2.1 鸡蛋清原液的制备取新鲜鸡蛋，用双层灭菌纱布过滤得到水样成分，充分搅拌30 min（搅拌剧烈程度以不起泡沫为准）。为了降低鸡蛋清粘度以利于后续试验，取5 mL鸡蛋清用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液（50 mL 0.1M Tris-base溶液与5.7 mL 0.1M HCl溶液混匀后，冷却到室温，加水定容到100 mL）进行5倍稀释，4下静置至少6 h。1.2.2 鸡蛋清卵白蛋白盐析法分离将静置蛋清4、10000 rpm离心10 min，取上清液，缓慢多次加入烘干研磨成粉末的硫酸铵，磁力搅拌，使加入粉末溶解，并参考硫酸铵溶液饱和度计算表，使其饱和度分别达到30%、40%、50%、60%、70%和80%。4静置过夜，于4、12000rpm离心10 min，不同饱和度离心所得沉淀均用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液溶解，并在4、0.05 M的Tris-HCl缓冲液中进行透析。期间更换透析液24次，透析过夜。1.2.3 蛋白质检测蛋清盐析蛋白质含量采用Bradford法测定8-9：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色，蛋白与考马斯亮蓝反应后，溶液在分光光度计波长595 nm处吸光度与蛋白质含量成正比。用BSA蛋白标准液在波长595 nm处测得的吸光值绘制标准曲线（见表1），不同饱和度盐析得到的蛋白样品在595 nm波长测得的吸光值，通过标准曲线得到蛋白含量。采用SDS-PAGE检测盐析后卵白蛋白的纯度。表1 标准曲线配比表处理序号0.01%BSA标准液（L）蒸馏水（L）考马斯亮蓝（L）蛋白质含量（g/mL）10200100002401601000203801201000404120801000605160401000806200010001002 结果与分析2.1 蛋白含量检测 根据不同浓度BSA蛋白标准液在波长595 nm处测得的吸光度（表2）绘制标准曲线（图1）。由表2可知，30%硫酸铵饱和度盐析能沉淀较多的杂蛋白，经60%饱和度硫酸铵盐析后蛋白质的SDS-PAGE电泳条带与卵白蛋白标准品一致，70%和80%饱和度硫酸铵盐析能沉淀较多的目的蛋白，但杂蛋白较多，需要进一步纯化。图2 蛋白质含量标准曲线请提供本图的Excel文件表2 样品中蛋白质含量硫酸铵饱和度（%）蛋白量含量（g）回收率（%）302818.89.3640447214.865017215.7160542418.02701331044.22804468.814.85总蛋白30110- - -2.2 卵白蛋白的分离SDS-PAGE检测盐析后卵白蛋白的纯度，由图1可见，30%硫酸铵饱和度进行盐析，能从蛋清中沉淀出较多的杂蛋白，经60%饱和度硫酸铵盐析后蛋白质的电泳条带与卵白蛋白标准品一致，70%和80%饱和度硫酸铵盐析能沉淀较多的目的蛋白。图1 不同饱和度硫酸铵盐析形成的蛋白质SDS-PAGE电泳（1-卵白蛋白标准品；2-卵转铁蛋白标准品；3-溶菌酶标准品；4、5、6、7、8、9-分别为30%、40%、50%、60%、70%和80%盐析稀释10x蛋白样品；M-蛋白Marker）3 小结与讨论盐析是蛋白质粗分离常用的方法，具有处理量大、成本低、操作简便、对蛋白质生物活性有稳定作用等优点。在促进蛋白质沉淀时，所用硫酸铵的浓度要比氯化钠或氯化钾浓度低，因此，常选用硫酸铵盐对蛋清进行盐析8。硫酸铵先行制备成硫酸铵溶液，可以较好的与鸡蛋清稀释液充分混匀，不易引起局部硫酸铵浓度过高而使蛋白沉淀。由于本试验盐析硫酸铵所要达到的饱和度较高，硫酸铵溶液使得溶液体积增加过大，不便后续离心，因此，选用硫酸铵粉末进行盐析试验。另外，分级硫酸铵盐析所得蛋白中各种蛋白pI值不同，透析时要根据蛋白透析情况对透析用的Tris-HCl缓冲液的pH值进行调节。鸡蛋清中的卵白蛋白具有良好的加工性能及生物学特性，广泛应用于食品加工业及相关科学研究。本文以鸡蛋清为原料，使用Tris-HCl缓冲液进行稀释，降低鸡蛋清粘度，增加可溶性蛋白质的溶出和提取率，以利于后续试验。采用60%硫酸铵进行盐析的方法获得卵白蛋白的粗提物，回收率达到18.02%，SDS-PAGE显示卵白蛋白为主要条带，可有效分离鸡蛋中卵白蛋白，操作过程简单、快捷、成本低。综合考虑卵白蛋白纯度和提取率，可采用60%饱和度的硫酸铵盐析分离卵白蛋白。 参考文献1Stadelman W鸡蛋的新用途J国外畜牧科技，1999,26(6): 41-422吴 定，路挂红蛋壳和蛋清的综合利用J农牧产品开发，1996(5): 33-353 Mine Y,Noutomi T,Haga N. Emulsifying and structural properties of ovalbumin J. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1991,39: 443-446.4方林求，薛 静鸡卵清蛋白对蛋白酶抑制作用的研究J中国生化药物杂志，1995,16(6): 262-2655 Fujita H,Usui H,Kurahashi K,et al. Isolation and characterization of ovokinin,a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovalbuminJ. Peptides,1995,16(5): 785-790.6 Davalos A,Miguel M,Bartolome B,et al. Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysisJ. Journal of Food Protection,2004,67(9): 1939-1944.7 Mingsheng Xu,Xinchen Shangguan,Wenjun Wang,et al. Antioxidative activity of hen egg ovalbumin hydrolysatesJ. Asia Pac J Clic Nutr,2007,16(1): 178-182.8宋宏新,李敏康.现代生物化学实验技术教程M.西安:陕西人民出版社,2002.9汪家政，范 明蛋白质技术手册