第十一章-动物基因工程.ppt

1 第十一章动物基因工程 2 第一节基因工程概述 理论上的三大发现DNA为遗传物质 Avery的肺炎双球菌转化实验DNA双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制遗传密码与中心法则 3 技术上的三大发明1 限制性内切酶和连接酶 DNA的 手术刀 与 缝纫机 2 载体 运送遗传物质的工具 如质粒 病毒等3 逆转录酶 从mRNA到DNA 使真核基因制备成为可能 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3 基因工程的内容目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离 13 基因操作中的工具酶手术刀 限制性核酸内切酶 核酸外切酶缝纫机 连接酶复印机 DNA聚合酶 逆转录酶 第二节基因操作中的工具酶 14 一 限制性内切酶的概述 一 概念限制性核酸内切酶简称限制性内切酶 是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶 主要存在于细菌 霉菌中 至今已分离到1000种以上 搞清识别序列的有300种以上 15 二 限制性内切酶命名规则限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取 即由其属名的第一个字母 大写 与种名的第一 二两个字母 小写 组成酶的基本命名 若酶的产生菌由株系之分 则有4个或4个以上拉丁字母组成 其第四个字母之后表示株系 如EcoRI来源于Echerichia coliRY13BamHI来源于B amyloliquefaciens 16 HindII Haemophilus 属名 Influenzae 种名 d 株系 罗马数字 限制性内切酶命名举例 17 三 限制性内切酶分类 18 19 四 II型限制性内切酶的特性 1 II型限制酶的识别特异性 回文识别序列II型限制酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构 或称回文序列 PalindromicSequence 20 2 识别特定的核苷酸序列 其长度一般为4 8个核苷酸且呈二重对称 3 具有特定的酶切位点 即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割 由此产生特定的酶切末端 21 识别序列 位点 双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列被识别的碱基序列通常具有双轴对称性 即回文序列 PalindromicSequence EcoRI的识别序列 22 二 DNA聚合酶 一 DNA聚合酶 DNAPolymerase 的基本特性能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3 OH末端催化核苷酸的聚合作用 而不发生引物从膜版上的解离作用 DNA OHDNA pdN n nPPidATP dTTP dCTP dGTP Mg2 DNA聚合酶 23 大肠杆菌DNA聚合酶 1 E coliDNA聚合酶 的活性 5 3 DNA聚合酶活性 5 3 外切核酸酶活性 3 5 外切酶活性 24 2 E coliDNA聚合酶 的用途 利用E coliDNA聚合酶 的5 3 外切核酸酶活性 可用切口平移法 nicktranslation 标记DNA 所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应 用于cDNA克隆中的第二链 即单纯的DNA聚合活性 但由于具有5 3 外切活性 现在已不再使用 而改用Klenow酶和反转录酶 详见后面 对3 突出端的DNA作末端标记 交换或置换反应 但是此反应用T4或T7DNA聚合酶效果会更好 25 二 KlenowDNA聚合酶 无5 3 外切活性有聚合活性有3 5 外切活性由于没有5 3 外切活性 使用范围进一步扩大 26 KlenowDNA聚合酶用途 补平3 凹端DNA 抹平DNA3 凸端 通过置换反应对DNA进行末端标记 在cDNA克隆中合成第二链 随机引物标记 应用于Sanger双脱氧链末端终止法的DNA测序 应用于PCR反应 现在已经被TaqDNA聚合酶等取代 在体外诱变中 用于从单链模板合成双链DNA 27 三 T4噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的E coli 分子量114kDa T4噬菌体DNA聚合酶与Klenow酶相似 但3 5 外切活性强200倍 且不从单链DNA模板上替换引物 因此在诱变反应中更有用 诱变率约提高1倍 28 五 逆转录酶 逆转录酶是一种有效地转录RNA产生cDNA的酶 产物DNA称cDNA 即互补DNA complementaryDNA 该酶又称为依赖于RNA的DNA聚合酶 RNA dependentDNApolymerase 逆转录酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA为模板 合成cDNA 用以组建cDNA文库 进而分离为特定蛋白质编码的基因 29 六 末端转移酶 来源于小牛胸腺催化dNTP加于DNA分子的3 羟基端dNTP为T或C 二价阳离子首选CO2 为A或G首选Mg2 对3 羟基突出末端的底物作用效率最高在cDNA或载体3 末端加同聚尾用于克隆用标记的rNTP dNTP或ddNTP来标记DNA片段的3 末端 30 DNA聚合酶在基因工程中的用途 1 DNA分子的体外合成2 体外突变3 DNA片段探针的标记4 DNA的序列分析5 DNA分子的修复6 聚合酶链式反应 PCR 等 31 三 DNA连接酶与DNA分子的体外连接 体外DNA片段的连接方式 1 用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段 2 用T4DNA连接酶将平端的DNA片段连接起来 3 先在DNA片段的末端加上化学合成的衔接物或接头 使之形成粘性末端之后 再用DNA连接酶将它们连接起来 注意 1 DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化单链的DNA分子 被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分 用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶称为连接酶 它催化DNA5 磷酸基与3 羟基之间形成磷酸二酯键 32 具有3 OH和5 P基团的缺口被DNA连接酶封闭起来 如果缺失一个或数个核苷酸的裂口DNA连接酶则不能将它封闭起来 注意 2 连接酶如果缺失一个或数个核苷酸的裂口DNA连接酶则不能将它封闭起来 33 四 其他酶类 1 T4多核苷酸酶 T4多核苷酸酶催化ATP的 磷酸基转移至DNA或RNA片段的5 未端 在基因工程中主要用于 1 标记DNA片段的5 端 制备杂交探针 2 基因化学合成中 寡核苷酸片段5 磷酸化 3 用于测序引物的5 磷酸标记 34 2 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶的功能是去除DNA或RNA5 未端的磷酸基 反应可表示为 碱性磷酸酶5 pDNA或5 pRNA5 HODNA或5 OHRNA碱性磷酸酶可用于 1 去除DNA片段5 磷酸 以防止在重组中的自身环化 以提高重组效率 2 在用 r 32P ATP标记DNA或RNA的5 磷酸前 去除DNA或RNA片段的非标记5 磷酸 35 利用碱性磷酸酶CIP防止 载体的再环化 pUC19 SacIKpnISmaIBamHIXbaISalIPslISphIHindIII 对接DNA 可通过凝胶电泳纯化靶DNA 3 OH 3 OH 5 P 5 P 5 P 5 P 3 OH 3 OH 用T4噬菌体DNA连接酶连接去磷酸化的质粒与靶DNA 3 OH 3 OH 3 OH 3 OH 用CIP去除5 P 限制性内切酶 3 OH 3 OH 3 OH 3 OH 鉴定重组子 检查a互补能力的丧失情况核酸杂交对小量制备的质粒DNA进行酶切分析 CIP 牛小肠提取BAP 大肠杆菌提取 36 3 核酸酶 nuclease 核酸外切酶 可降解dsDNA中或DNA RNA中的一条链核酸内切酶 可切割DNA链中的单链 1 BAL31核酸酶 BAL31nuclease 来源于交替单胞菌 主要活性为3 外切核酸酶活性 可从线性DNA两条链的3 端迅速去除单核苷酸 随后可从单链DNA内部发挥缓慢的内切酶活性 形成截短了的平端双链DNA分子 约占10 20 以及带有约5个核苷酸突出单链的截短分子 约占80 90 对于所形成的单链突出 可用DNA聚合酶补平 37 2 Sl核酸酶 S1nuclease Sl核酸酶来源于米曲霉 可降解单链DNA或RNA 是一种单链核酸酶 产生带5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链 对dsDNA dsRNA和DNA RNA杂交体不敏感 酶浓度大时可完全消化双链 中等浓度可在切口或小缺口处切割双链 该酶可用于分析DNA RNA杂交体的结构 去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端 打开双链cDNA合成中产生的发荚环 38 3 脱氧核糖核酸酶 DNase DNase 来源于牛胰 是内切核酸酶 可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA 在Mg2 存在下 独立作用于每条DNA链 且切割位点随机 在Mn2 存在下 它可在两条链的大致同一位置切割dsDNA 产生平端或1 2个核苷酸突出的DNA片段 39 4 核糖核酸酶A RibonucleaseA或RNaseA 核糖核酸酶A来源于牛胰 为内切核酸酶 可特异攻击RNA上嘧啶残基的3 端 可除去DNA RNA中未杂交的RNA区 可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置 广泛用来去除DNA样品中的RNA 核糖核酸酶A商品制剂可能会污染其它酶 如DNA酶 使用前应加热使DNA酶失活 40 第三节基因工程的载体 将外源DNA或基因携带入宿主细胞 hostcell 的工具称为载体 一 基因工程载体的概念 41 二 基因工程载体的分类 基因工程载体决定了外源基因的复制 扩增 传代乃至表达 目前已构建应用的基因工程载体主要有质粒载体噬菌体载体病毒载体人工构建的组合载体 42 一 细菌质粒载体 质粒介绍 质粒 plasmid 是能自主复制的双链环状DNA分子 它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在 一个质粒就是一个DNA分子 其大小可从1kb到300kb 质粒广泛存在于细菌之中 在某些蓝藻 绿藻和真菌细胞中也存在质粒 质粒DNA的特点为 1 双链环状 2 分子量很小 3 自主或半自主复制 4 不同生物质粒中的基因种类不同 43 从分子量大小看 质粒DNA只占细胞染色体组的一小部分 一般约为1 3 但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状 质粒赋予寄主细菌一些额外的特性 包括抗性特征 代谢特征 修饰寄主生活方式等 由质粒DNA编码的基因还包括有产生抗菌素的基因 芳香族化合物降解基因 糖酵解基因 重金属抗性基因 产生细菌素的基因等等 44 1 质粒的复制每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列 它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制 质粒的复制和遗传独立于染色体 但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区 整个遗传单位定义为复制子 45 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型 严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限 大约1 几个 松驰型质粒拷贝数较多 可达几百 松驰型质粒 复制不需要质粒编码的功能蛋白 其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶 如DNA聚合酶 依赖于DNA和RNA聚合酶等 来进行 严紧型质粒 复制要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质 2 质粒的拷贝数 46 47 3 质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性 它是指在第二个质粒导入后 在不涉及DNA限制系统时出现的现象 不相容的质粒一般都利用同一复制系统 从而导致不能共存于同一宿主中 两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时 在分配到子细胞的过程中会竞争 随机挑选 微小的差异最终被放大 从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒 而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体 一般具有相同的复制子 在大肠杆菌中现已发现30多个不相容群 如ColE1和pMB1 pSC101和p15A 48 4 转移性 质粒具转移性 它是指在自然条件下 很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内 它需要移动基因mob 转移基因tra 顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic 可分为 转移带动转移 49 5 选择标记 选择标记用于鉴别目标DNA 载体 的存在 将成功转化了载体的宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记 50 氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记 绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成 与有关的酶结合并抑制其活性 抑制转肽反应 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶 该酶可分泌进入细菌的周质区 抑制转肽反应并催化 内酰胺环水解 从而解除了氨苄青霉素的毒性 1 氨苄青霉素抗性基因 ampr 51 2 四环素抗性基因 tetr 四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合 从而抑制核糖体的转位 四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白 可阻止四环素进入细胞 pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外 还带有四环素抗性基因 52 3 氯霉素抗性基因 Cmr cat 氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成 目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性P1噬菌体 也携带Tn9 cat基因编码氯霉素乙酰转移酶 一个四聚体细胞质蛋白 每个亚基23kDa 在乙酰辅酶A存在的条件下 该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物 使之不能与核糖体结合 53 4 卡那霉素和新霉素抗性基因 kanr neor 卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷 都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶 APH 3 25kDa 的基因 氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化 从而干扰了它们向细胞内的主动转移 在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔 保护宿主不受这些抗生素的影响 54 二 质粒载体的种类 一 克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段 是最简单的载体 克隆载体必须具备的基本条件 具有复制起点具有抗菌素抗性基因具有若干个限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较高的拷贝数 55 1 质粒载体pBR322pBR322大小为4361bp 由人工改造而来 有一个复制起点 一个抗氨苄青霉素基因 一个抗四环素基因 多种限制酶切点 36个 可容纳5kb左右外源DNA 优点 具有较小的分子量 易于自身DNA的纯化及克隆载体的纯化 具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号 具有较高的拷贝数 且经氯霉素扩增后 每个细胞中可累计1000 3000个拷贝 56 Thebacterialchromosomeandbacterialplasmids asshownintheelectronmicroscope 57 Brokencell TheuseofplasmidpBR322asacloningvector showinghowinsertionofforeignDNAcausesinactivationofthetetracyclineresistancegene permittingeasyidentificationoftransformantscontainingtheclonedDNAfragment 58 外源基因克隆入质粒载体的过程 59 DNAcloningusingbacterialplasmids 60 2 质粒载体pUC18 19这对载体由2686bp组成 带有pBR322的复制起始位点 一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子 半乳糖苷酶基因 lacZ 的调节片段 一个调节lacZ 基因表达的阻遏蛋白 repressor 的基因lacI 还有多个单克隆位点 由于pUC质粒含有Ampr抗性基因和lacZ 基因 可以通过颜色反应和Ampr对转化体进行双重筛选 61 多克隆位点 质粒载体pUC19 MSC区段 pUC优点 具有更小的分子量 更高的拷贝数 适用于用组织化学方法检测重组子 具有多克隆位点MSC区段 与M13mp8噬菌体相同的克隆区段 62 二 其他质粒载体 1 低拷贝数载体2 检测转录控制信号的载体3 表达载体 是在常规克隆载体的基础上衍生而来的 主要增添了强启动子 以及有利于表达产物分泌 分离或纯化的元件 63 噬菌体噬菌体内含双链环形 单链环形 双链线形 单链线形等多种形式 大小不一的DNA 最常见的是双链线形DNA 且感染率高 0 02 0 3 m 二 噬菌体 Bacterophage 载体 64 噬菌体的形态 65 噬菌体 275 000 Scanningelectronmicroscopy 66 噬菌体特性 含有线性双链DNA分子 其长度为48502bp 两端各有12个核苷酸组成的5 端凸出的互补粘性末端 cohesiveend cos 当 DNA进入宿主细胞后 互补粘性末端连接成为环状DNA分子 连接处称之为cos位点 噬菌体为温和噬菌体 DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA上 以溶源状态存在 随染色体的复制而复制 67 噬菌体能包装 DNA长度的75 105 的外源DNA 约38 54kb 即使不对 DNA进行改造 也允许承载5kb大小的外源DNA片段带入受体细胞 DNA上的D基因和E基因对噬菌体的包装起决定性作用 缺任何一种基因都将导致噬菌体不能包装 在宿主 受体 细胞中积累大量供包装用的其它壳蛋白 DNA分子上有多种限制性内切酶的识别序列 便于用这些酶切割产生外源DNA片段的插入和置换 但是有的酶在 DNA上有多个识别序列 有的识别序列位于必需基因区域 将影响外源DNA片段的插入和置换 68 噬菌体的cos末端 69 构建 噬菌体载体的基本途径为 抹去某种限制性内切酶在 DNA分子上的一些识别序列 只在非必需区保留1 2个识别序列 若保留1个识别序列 可供外源DNA插入 若保留2个识别序列 则两个识别序列之间的区域可被外源DNA片段置换 用合适的限制性内切酶切去部分非必需区 但是由此构建的 DNA载体不应小于38kb 在 DNA分子合适区域插入可供选择的标记基因 70 噬菌体载体的主要类型插入型载体 外源DNA克隆到插入型载体分子上 会使噬菌体的某种生物功能丧失效力 免疫功能失活 inactivationofimmunityfunction 大肠杆菌 半乳糖苷酶失活 inactivationofE coli galactosidase 替换型载体载体DNA分子中有一段可以被替换的DNA片断 71 用 噬菌体作为克隆载体 72 噬菌体DNA的复制 1 感染早期 环形DNA分子可以按 形式从双向进行复制 感染晚期 滚动复制 2 稳定整合到染色体DNA上复制 噬菌体载体可以成功的应用来作为扩增外源基因拷贝数的克隆载体 使外源基因得到最大限度的表达 已经应用 噬菌体载体实现基因克隆和表达的有DNA连接酶 DNA聚合酶I和聚合酶III 亚基等 73 基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组 获得具有高度应用价值的新物种 为此 须从现有生物群体中 根据需要分离出可用于克隆的此类基因 这样的基因通常称之为目的基因 目的基因主要是结构基因 目的基因 纯度很高片断大小适于重组操作 第四节获得真核生物目的基因的方法 74 目的基因的获得方法分离化学合成 75 一 利用PCR法获取目的基因 PCR polymerasechainreaction 聚合酶链式反应 是80年代发展起来的新技术 是通过模拟体内DNA复制的方式 在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术 摘要 其过程与DNA复制一样有三个步骤 模板变性 引物与模板复性 延伸 76 2 PCR扩增 主要的是引物设计 引物设计需要遵循一定的原则 3 用于PCR的DNA聚合酶种类很多 性质各异 可以满足不同的实验需要 4 PCR技术应用广泛 可以通过A T克隆 UDG克隆等方法介导克隆 还可以通过同源重组 重叠延伸等方法介导定点诱变 反向PCR 反转录PCR在基因操作中也扮演了重要角色 PCR技术还广泛应用于鉴定 诊断等领域 77 一 PCR的基本原理 1 基本要素和扩增原理基本要素与DNA复制的基本要素是一致的 待拷贝的DNA称为模板 它可以是双链DNA也可是单链DNA 最后扩增得到的产物是双链状态的 引物是DNA复制的先锋 就象结晶过程中的晶核 引导DNA的合成 在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物 DNA聚合酶是DNA复制的动力 在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链 78 2 PCR扩增的步骤 首先将模板DNA置于92 96 进行变性 denaturation 处理 使dsDNA在高温下解链成为ssDNA 且热变性不改变其化学性质 然后退火 annealing 将温度降至37 72 使引物与模板的互补区相结合 最后 在72 条件下 DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3 OH端 合成DNA 这个步骤称为延伸 extension 这三个热反应过程的重复称为一个循环 经过20 40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段 79 80 PCR 81 PCR 变性 退火 延伸 82 二 PCR反应体系 1 缓冲液标准的缓冲液含10mMTris HCl pH为8 3 9 0 室温 而在延伸温度 72 下 pH值接近7 2 缓冲液中含有一种二价阳离子 用于激活DNA聚合酶的活性中心 一般使用Mg2 有时使用Mn2 一般以MgCl2的形式提供 标准浓度为1 5mM Mg2 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率 缓冲液中还含有50mM的钾离子 有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率 提高富含G C模板的扩增效率 83 2 脱氧核苷三磷酸 dNTP 脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物 标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP 即dATP dTTP dCTP和dGTP 终浓度一般为200mM 即饱和浓度 dNTP的浓度会影响扩增的产量 特异性和忠实性 84 3 引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1mM 即1pmol ml 在100 l反应体系中相当于6x1013个分子 如果5 用于扩增1kb的DNA片段 可得到3 3 g的产物 足以用于常规分析 85 4 模板模板的数量会直接影响扩增的效果 对于一般的PCR扩增 104至107个模板分子可达到满意的效果 用人类或哺乳动物基因组DNA进行扩增时 一般使用1 gDNA 相当于单拷贝基因有3 105个拷贝 以酵母菌 细菌 质粒和M13噬菌体噬菌斑的DNA作模板时 要达到这么多拷贝数分别需要10ng 1ng 1pg和1 噬菌斑 86 5 DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌 Thermusaquaticus TaqDNA聚合酶分子量大小为94kDa 为单分子酶 在75 活性最强 具有5 3 合成活性和5 3 外切活性 但是无3 5 外切活性 在95 的半衰期为40分钟 启动PCR反应的能力很强 聚合速度快 在72 的聚合速度为每秒30 100碱基 由于没有3 5 外切活性 在扩增过程中有8 9 11x10 5的错配几率 87 商用混合酶为了提高扩增的保真度或扩增较长的DNA片段 将TaqDNA聚合酶的强启动能力和具有3 5 外切活性的高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来 可以达到很好的效果 88 三 PCR反应程序 1 常规程序预变性 94 96 几十秒至几分钟变性 94 30秒钟退火 50 65 30秒钟 25 35次循环延伸 72 1分钟72 保持3 7min4 保存 89 2 复性 退火 和延伸温度 复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素 通常在50 60 之间 具体的温度主要由引物的Tm值决定 延伸温度绝大多数设定为72 如果复性的温度很高 可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度 变成二步法PCR 90 3 反应时间 变性步骤一般使用30秒钟 如果模板的G C含量较高 或直接用细胞做模板 变性时间可适当延长 复性时间有30秒种一般是足够的 延伸时间由扩增产物的大小决定 一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间 91 4 循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关 在模板拷贝数为104 105数量级时 循环数通常为25 35次 平台效应 plateaueffect PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象 原因 底物和引物的浓度已经降低 dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低 产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用 非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用 扩增产物自身复性 高浓度扩增产物变性不彻底 92 5 PCR反应液的配制 PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行 常规方法与其它酶学反应一样 在最后加入DNA聚合酶 早期的PCR仪没有带加热的盖子 要求在反应液上覆盖一层矿物油 防止水分蒸发 对于使用具3 5 外切活性的高温DNA聚合酶时 有时会扩增不出产物 在遇到这个问题时 如果将反应成分分开配制 A管含模板 引物和dNTP 以及调整体积的H2O B管含缓冲液 DNA聚合酶和水 然后再将两管溶液混合起来 可较好地克服这个问题 93 按照常规的方法配制反应体系 有时会出现非特异性扩增的问题 热启动 hotstart PCR操作方式可较好解决这一问题 将dNTP 缓冲液 Mg2 和primer先配制好 然后加入一粒蜡珠 如AmpliWaxPCRQam100 加热熔化 再冷却 使蜡将溶液封住 最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分 只有当PCR反应进入高温阶段后 蜡层熔化 所有反应成分才会混合在一起 94 四 PCR反应体系各成分的主要作用 1 模板DNA 研究对象2 Mg2 影响反应的产率和特异性3 反应缓冲液 维持反应环境4 dNTPs 原料 多 速度过快且易出错 少 慢单精度可上升5 TagDNA聚合酶 聚合作用 无纠错功能6 引物 引导起始合成 95 五 循环条件的设定 1 变性2 退火3 延伸4 循环次数 96 六 引物设计原则 通用原则 1 引物长度 15 30Nt为宜2 引物碱基尽可能随机分布3 引物内部不应自身形成二级结构4 两个引物之间不能形成互补结构5 引物3 末端与模板配对 97 加酶切位点PCR引物设计 长度 互补序列大于20 没有上限 3 端绝对不能互补 两引物具有较好的协调性 内部二级结构较少 加酶切位点是需要注意保护碱基长度 检测特异性 98 七 PCR技术的应用 1 基因克隆2 不对称PCR与DNA序列测定3 RT PCR与RNA分析4 基因的体外诱变与突变的检测5 基因组研究 99 RT PCR 100 基因文库 Genelibrary 包括cDNA文库 cDNAlibrary 和基因组文库 Genomiclibrary cDNA是指以mRNA为模板 经反转录酶催化合成DNA 则此DNA序列与mRNA互补 称为互补DNA或cDNA 二 基因组文库的构建与基因克隆 101 基因组DNA文库从生物组织细胞提取出全部DNA 用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段 然后将这些片段与适当的载体连接 转入受体细菌或细胞 这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子 而且可以繁殖扩增 许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体 就称为基因组DNA文库 如果这个文库足够大 能包含该生物基因组DNA全部的序列 就是该生物完整的基因组文库 能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列 102 cDNA文库 提取出组织细胞的全部mRNA 在体外反转录成cDNA 与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌 则每个细菌含有一段cDNA 并能繁殖扩增 这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库 cDNA文库和基因文库的不同之处在于 cDNA文库除去了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分 便于DNA重组的使用 其复杂性比基因文库低得多 实际为不包含内含子的基因组文库 103 DNA片断的部分酶解和全部酶解 一个完整的基因文库应该包括目的生物体所有的基因组DNA 104 第五节 目的基因的获得 MakingagenomicDNAlibrarieswithplasmidvectors 105 3种通用的鉴定方法 用标记的DNA探针做DNA杂交用抗体对蛋白质进行免疫杂交对蛋白质的活性进行鉴定 鉴定文库中带有目的序列的克隆的方法 106 用标记的DNA探针做DNA杂交 通过免疫反应进行基因文库的筛选 107 组建一个cDNA文库的步骤 1 分离表达目的基因的组织或细胞2 从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA3 第一条cDNA链的合成 第一条互补DNA链的合成需要RNA模板 cDNA合成引物 逆转录酶 4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液 Mg2 等 4 第二条cDNA链的合成5 cDNA的甲基化和接头的加入6 双链cDNA与载体的连接 108 互补DNA的合成原理 mRNA分子的3 末端都有poly A 尾巴 可以与结合寡聚核苷酸 oligo dT 的惰性物质结合 并得以分离 12 20个寡聚核苷酸的oligo dT 作为引物 合成第一个cDNA链 随机引物法 切割常损失需要的cDNA 形成发卡环的机理不清楚 第一条cDNA 第二条cDNA 109 基因组DNA文库及cDNA文库的建立 110 根据研究目的 选择克隆策略 控制基因表达的调控序列mRNA中不存在的特定序列 蛋白质的氨基酸序列 111 碱基对 玉米 人 果蝇 酵母 物种 大肠杆菌 5 109bp 3 5 109bp 1 6 108bp 1 4 107bp 4 106bp 112 1967年Khorana提出化学合成基因的想法 并进行了实践 1979年Khorana在 Science 上发表了 一个基因的合成 的著名论文 三 基因的人工合成DNA的化学合成 113 DNA的化学合成单链DNA短片段的合成已成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术 化学合成DNA分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5 端 而在细胞中DNA分子合成的方向恰恰相反 整个DNA的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行 并且可以对合成过程进行计算机控制 目前常用的化学合成DNA的方法是磷酰胺法 合成的DNA片段可用于连接成一个长的完整基因 用于扩增目的基因 PCR 引入突变 作为测序引物 还可用于杂交 114 目的基因能否有效地导入受体细胞 取决于是否选用合适的克隆载体 合适的受体细胞和合适的基因转移方法 基因克隆的受体细胞 从实验技术上讲 是能摄取外源DNA 基因 并使其稳定维持的细胞 从实验目的上讲 是有理论研究价值和应用价值的细胞 基因工程发展到今天 从原核到真核细胞 从简单的真核如酵母菌到高等的动植物细胞都能做为基因工程的受体细胞 受体细胞也不同 所用的基因载体也不同 第五节DNA体外重组与基因转移 115 一 载体与目的基因的连接 DNA体外重组所需的材料 载体 目的基因 限制性内切酶和连接酶 原核生物的载体有 质粒 噬菌体等 真核生物的载体有 动物病毒 一 粘性末端连接法1 相同限制酶切位点连接同一限制性内切酶切割不同的DNA 具有相同粘性末端 适合于DNA片段与DNA片段 载体与DNA片段的连接 2 不同限制酶切位点连接两种不同的限制性内切酶切割不同的DNA片段 具有相同类型的粘性末端 116 二 平头末端连接1 粘性末端转化为平头末端末端添补法和末端消除法 Kienow片段常用于末端补平 S1和Bal31等核酸酶常用于末端消除 2 连接效率低 一般只有粘性末端的1 3 提高效率的办法 增加目的DNA片段和连接酶的浓度 三 人工接头连接人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列 将其接在目的基因片段和载体DNA上 使它们具有新的内切酶位点 四 同聚物加尾连接利用末端转移酶在DNA片段的3 末端添加同聚物造成延伸部分 117 二 基因的转移重组体DNA分子导入受体细胞 原核细胞 低等真核生物宿主 高等动 植物细胞宿主 118 根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择 要使重组体的 转化或转染效率高 能 稳定传代 受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配 易于筛选重组体以及外源基因可在其内高效表达和稳定积累等 补充内容 受体细胞选择的一般原则 原核生物 动物细胞 119 目前已使用的受体细胞有三大类 1 微生物表达系统最早使用和至今最广泛使用的是大肠杆菌 其次是酵母和枯草杆菌 2 植物细胞表达系统因在植物细胞使用的载体很有限 目前主要是农杆菌介导 双子叶植物表达系统使用较多 3 动物细胞表达系统哺乳动物细胞主要是胚胎细胞和培养的体细胞 但培养条件苛刻 成本较高 且易污染 昆虫细胞既能表达原核基因 又可表达哺乳动物基因 且有较强的分泌能力和修饰能力 120 选用克隆载体时注意 1 为使导入的目的基因能在受体的细胞中有效表达 应选用具有强启动子的表达载体 2 克隆载体应便于同含目的基因的DNA片段进行连接 3 根据确定的受体细胞 选用相应的克隆载体 因为不同生物类型的受体细胞有各自适用的克隆载体 121 转化与转化把纯化的外源DNA分子导入细菌细胞的过程叫转化 原核细胞的转化过程就是一个导入外源DNA的过程 把以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程叫做转染 一般是将作为受体细胞的细菌放在一定浓度的冰冷CaCl2 50 100mmol l 溶液中处理后 制成感受态细胞 然后至于42 高温热激90s的方法帮助其吸收外源DNA 一 重组DNA向细菌细胞导入 122 感受态细胞 competentcells 是指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞 为制备感受态细胞 应注意以下几点 1 在最适培养条件下培养受体细胞至对数生长期 培养时一般控制受体细胞密度OD600在0 4左右 2 制备的整个过程控制在0 4 3 为提高转化率 可选用复合CaCl2溶液 123 二 外源目的基因向真核细胞导入 1 借助于载体的基因转移真核生物以重组的动物病毒或反转录病毒直接转染受体细胞 优点 定向性好 效率高 重复性好缺点 载体的侵染范围有限 对一些经济性状 载体较大 的基因转移比较困难 124 2 磷酸钙或DEAE 葡聚糖介导的转染法这是将外源基因导入哺乳类动物细胞进行瞬时表达的常规方法 磷酸钙转染法的基本原理 哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA 磷酸钙沉淀物 使DNA转入细胞 操作方法 先将重组DNA同CaCl2混合制成CaCl2 DNA溶液 随后形成DNA 磷酸钙沉淀 粘附在细胞表面 通过内吞作用进入受体细胞 125 3 多聚物介导法原理 多聚物同二价阳离子 如Mg2 Ca2 Mn2 等 和DNA混合 可在原生质体表面形成颗粒沉淀 使DNA进入细胞内 常用试剂 聚乙二醇 PEG 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物 尤以PEG应用最广 126 应用对象 酵母细胞以及其它真菌细胞 操作方法 处于对数生长期的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形体后 在适当浓度的聚乙二醇6000 PEG6000 的介导下将外源DNA导入受体细胞中 127 4 原生质体融合法将带重组质粒的细菌原生质体同受体细胞进行短暂的共培养 经过细胞膜融合 将重组DNA导入细胞 5 脂质体介导法脂质体 liposome 是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构 把用来转染的DNA分子包在其中 通过脂质体与细胞接触 将外源DNA分子导入受体细胞 原理 细胞膜表面带负电荷 脂质颗粒带正电荷 以电荷间引力将DNA mRNA及单链RNA导入细胞内 该法的优点是稳定 温和 128 5 显微注射法利用哺乳动物细胞便于注射的特性 将外源DNA分子通过显微注射法直接注入细胞 6 粒子轰击法 particlebombardment 金属微粒在外力作用下达到一定速度后 可以进入植物细胞 但又不引起细胞致命伤害 仍能维持正常的生命活动 利用这一特性 先将含目的基因的外源DNA同钨 金等金属微粒混合 使DNA吸附在金属微粒表面 随后用基因枪轰击 通过氦气冲击波使DNA随高速金属微粒进入植物细胞 此方法可直接处理植物器管或组织 是当今普遍应用的植物转基因方法 129 7 高压电穿孔法电穿孔 electroporation 法 把宿主细胞置于一个外加电场中 通过电场脉冲在细胞壁上打孔 DNA分子随即进入细胞 原理 细胞膜 其基本组成为磷脂 在适当的外加脉冲电场作用下 细胞膜由于电位差太大而呈现不稳定状态 从而产生孔隙使高分子 如ATP 和低分子物质得以进入细胞质内 但还不至于使细胞受到致命伤害 当移动外加电场后 被击穿的膜孔可自行复原 130 高压电穿孔的操作条件1 电压太低 DNA不能进入细胞膜 电压太高 细胞产生不可逆损伤 故应在300 600V为宜 2 时间20 100ms 3 温度00C为宜 使穿孔修复迟缓 DNA进入机会多应用对象 动物细胞 原核细胞 131 8 激光微束穿孔法利用直径很小 能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理 用激光处理细胞 处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞 此方法适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移 基因导入的方法多种多样 可根据具体要求进行选择 具体操作也参考有关实验手册 132 德国科学家转基因试验成功小猪身上能发出绿光2003年10月27日12 15新华网新华网柏林10月26日电 记者潘治 德国科学家最近利用去除活性的病毒作为载体将外来基因植入猪胚胎体内 成功培育出体内各组织因表现植入基因特性而发出绿光的幼猪 这一成果被认为对今后有目的地培养供人体所用的移植器官具有重要意义 慕尼黑大学科学家亚历山大 普法伊费尔与埃克哈德 沃尔夫等人在 欧洲分子生物学组织通讯 上发表论文说 他们在猪胚胎尚是单细胞阶段时就利用没有毒性的慢病毒作为载体 向其植入了一种名为GFP的外来基因 这种基因可以编码生成发出绿光的蛋白质 科学家们同时也给猪胚胎植入了一段人体DNA 该片断控制着皮肤细胞内某特定基因的活性 133 他们认为 这是朝着有目的地植入基因以改变动物特性及培养适用于人体的移植器官的重要一步 通过有目的地植入遗传物质 将来可以培养出适合人类接受 不产生排异反应的移植器官 沃尔夫说 134 目前重组体筛选的方法很多 概括起来有三类 1 生物学方法 包括遗传学方法 免疫学方法和噬菌斑的形成等 2 核酸杂交 通过DNA DNA DNA RNA碱基配对的原理进行筛选 以探针的使用为核心 包括原位杂交 Southen杂交 Northen杂交等 3 物理方法 如用电泳法等 第六节重组体的鉴定与筛选 135 一 遗传检测法 一 抗性筛选法 如pUC19 pSK等能否质粒载体中都存在有氨苄青霉素的抗性基因 生长 蓝色和白色菌落 其中白色菌落可能含重组质粒 二 插入失活选择法在载体上本来有一个正常表达的基因 在这一基因中间有些多科隆位点 在没有外源DNA插入时该基因可正确表达 当外源DNA插入到基因这个中间时 该基因就不能正确表达 这种现象称为插入失活 136 二 重组质粒的快速提取与酶切鉴定 137 三 核酸分子鉴定法 核酸杂交技术 基于碱基互补配对 Southern杂交DNA片段Northern杂交RNA原位杂交 138 是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段的技术 也称为Southern印迹 SouthernBlot 通过标记的探针DNA与靶DNA结合 检测目的基因的存在及大小 Southern杂交 139 Northern杂交 也称为Northern印迹 NorthernBlot 用以检测某一特定的RNA 通常是mRNA 片段的存在及表达量 因与DNA的杂交 Southern杂交 相对应 故被趣称为Northern杂交 140 原位杂交 细胞或染色体的原位杂交 用于基因定位 细菌菌落的原位杂交 筛选阳性克隆 141 四 Western 印迹 杂交 蛋白质水平上的杂交技术 又称为免疫印迹 即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合 经放射自显影显示条带 根据条带密度确定蛋白质表达量 与DNA RNA水平上的Southern杂交 Northern杂交相对应 称为Western杂交 常结合Northern印迹技术 检测基因表达调控 142 五 序列测定 Sanger等 1977 发明的双脱氧链末端终止法 143 第七节转基因技术 Transgenictechnology 144 转基因与转基因动物速生长效应的 转基因超级鼠 转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2 3倍 体积大一倍 转基因超级鼠1982年 英国的 自然 杂志发表了一篇文章 有两个美国实验小组利用转基因技术 将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中 培育出具快速生长效应的 转基因超级鼠 转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2 3倍 体积大一倍 145 转基因 1 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中 由于导入基因的表达 引起生物体的性状的可遗传的修饰 称之为转基因技术 2 转基因技术就是指利用分子生物学技术 将某些生物的基因转移到其它物种中 改造生物的遗传物质 使遗传物质得到改造的生物在性状 营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变 转基因动物 所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物 一 概念 146 1 显微注射法 将DNA注射到胚胎的细胞核内 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内 使之发育成正常的幼仔 2 体细胞核移植方法 先在体外培养的体细胞中进行基因导入并筛选 然后将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中 生产重构胚胎 转基因的方法 147 MicroinjectionofDNAintothenucleusofarecentlyfertilizedegg Theeggisheldinplacebyasuctionpipetteshownatthebottom whiletheinjectionpipetteisshownpenetratingtheeggatthetop Transgenicmice Thisphotographshowsapairoflittermatesatage10weeks ThelargermousedevelopedfromaneggthathadbeeninjectedwithDNAcontainingtheratgrowthhormonegeneplaceddownstreamfromametallothioeinpromoter Thelargermouseweights44g thesmaller uninjectedcontrolweighs29g 148 3 逆转录病毒感染法 最早用来得到转基因小鼠的方法 利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式 在逆转录整合