结核病细菌学检查的概要.ppt

结核病细菌学检查的重要作用河南省疾病预防控制中心结核病预防控制所闫国蕊 为了进一步加强结核病控制工作 实现国家结核病控制规划 NTP 目标 加强直接面视下短程化疗 DOTS 策略和结核病细菌学实验室质量控制 提高肺结核病人的发现率 通过实验室细菌学诊断传染性肺结核是实施DOTS策略的一个关键 而且对结核病控制项目的成功起着重要的影响作用 结核病细菌学检查的目的和任务 在结核病控制工作中痰结核菌检查对于发现传染源 确定诊断和化疗方案 考核疗效 评价防治效果具有重要意义 结核病细菌学检查是国家结核病控制规划 NTP 的重要组成部分 在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用 实验室网络及职能 在国家参比实验室的管理和监督之下 以省级参比室为中心实验室 采用自上而下质量保证体系与同级实验室室间质控相结合的方式 建立我国实验室质量控制网络 网络中的各级实验室应有效地发挥各自的职能 我国参比实验室网络 SNRL 跨国参比实验室NRL 国家参比实验室PRL 省级参比实验室PLL 地市级实验室CLL 县级实验室 SNRL NRL PRL PLL CLL 何为DOTS DOTS为 directly0bservedtherapyshortcourse 的缩写 中文译为直接督导短程化疗 统称现代结核病控制策 DOTS 该策略 年开始在全球推广 被认为是当今结核病诊治和管理的最有效方法 世界银行将DOTS列为 成本效益比最高 的治疗方法之一 现代结核病策略 DOTS 1 政府承诺2 痰菌检查 发现病人3 医务人员直接观察下的短程化疗4 定期不间断的药品供应5 信息监测系统 承诺 痰检 督导 药品 监测 我国结核病疫情目前有5 5亿的人口感染了结核菌 44 5 估算全国现有活动性肺结核病人450万 其中传染性肺结核病人 涂阳肺结核 150万据WHO估算 我国每年新发活动性肺结核病人145万 其中传染性肺结核65万例每年因结核病死亡13万 我省结核病疫情 河南是我国第一人口大省 人口达9700多万 结核病疫情较为严重 已被国家确认为结核病高负担省 我省现有活动性肺结核病人46万 患病率159 10万 其中传染性病人15万 患病率497 10万 占全国肺结核病人数10 河南省结核病控制工作1993年在全国率先开展了 卫生部加强与促进结核病控制目 1998年自筹资金开展 河南省结核病控制项目 2002年实施 世行贷款 英国政府赠款 日本政府援助中国结核病控制项目 2003年开展 全球基金项目 项目的实施使我省的结核病防治工作进入了全新的发展阶段 但是结核病防治工作并不尽如人意 疫情下降缓慢 结核病人的发现率低 耐药率高 治疗管理工作仍处于较低水平 痰检质控文件1999年河南省结防所签发豫结防字 1999年 第10号文件 河南省结核菌检验质量控制标准 2004年河南省卫生厅签发豫卫疾控 2004年 第91号文件 河南省结核病实验室痰涂片检查质量控制标准 结核病细菌实验室布局原则一 结核病细菌学检查要有独立的实验室 不得与其他实验室混用 二 培养基制备 洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检 培养前处理 药敏试验等污染操作要有独立分开的场所 最好分别在专用的房间进行 三 基层只从事涂片镜检的实验室只拥有一间独立房舍的情况下 相对洁净区 镜检区 登记区 与污染区 涂片 染色区 要有明显区分 基层痰检室布局范例 染色池 收集标本用的桌子 工作台 采光用窗户 固定 实验室门 试剂柜 显微镜 记录用的桌子 可以开关的窗户 结核菌检验实验室安全操作规则 结核菌检验实验室必须具有与其服务级别相应的装备 其原则是能满足该级别实验室的需要 使实验室人员得到充分的保护 并避免造成环境污染 安全操作规则 1 1 实验室应有合理布局及合适的单向 外排 通风体系 2 实验室应具备相应的防护设备 以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行 分离培养 药物敏感性测定 菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等 安全操作规则 2 3 实验室工作人员应用正确方式进行技术操作 穿戴隔离衣 口罩和帽子等 4 实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理 5 建立清洁消毒制度 限制非工作人员进入室内 禁止在实验室饮食和吸烟等 安全操作规则 3 6 进行下列操作时应严格按照技术规范 防止产生细菌气溶胶 涂片制作 培养液的倾倒和转移 高速混合含菌液 滴加 接种培养物 吸管稀释和混合菌悬液 取样器和震荡器的使用 细菌细胞超声粉碎 感染动物实验等 分枝杆菌生物学基础 简介 结核分枝杆菌是1882年郭霍 Rober tKoch 从肺结核病人痰标本中发现 是人类结核病的主要病原菌 分枝杆菌属裂殖菌纲 放线菌目 种类甚多 目前已命名的有56多种 一般可分为缓慢生长和快速生长两大类 结核菌生物学基础 生物特性 分枝杆菌的形态 结核分枝杆菌是专性需氧菌 无鞭毛 荚膜 无运动能力 形状 1 5 3 5 0 3 0 6微米的细长杆状 直或稍弯 镜下常堆积成团 成束 排列杂乱无章 也有呈串珠样 链状 索状者 萋 尼氏抗酸染色阳性 镜下的抗酸杆菌为淡兰色背景下的红色或粉红色细长杆菌 结核菌生物学基础 生物特性分枝杆菌的结构 分枝杆菌由于细胞结构和细胞成分的特殊性 具有经碱性燃料染色后能够忍受酸性介质脱色的特征 具有其染色特征的细菌习惯上称为抗酸菌 AFB AFB菌体细胞结构的完整性与其抗酸染色特性有着密切联系 用电子显微镜观察分枝杆菌 完整的细胞结构主要有以下部分组成 细胞壁 细胞膜 细胞质 核区 细胞器 抗酸性抗酸性是分枝杆菌的重要特征 其化学基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高 并含有大量分枝菌酸 抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密切 若菌体自溶 如标本保存时间过长 温度过高 结核菌的变异型 如L 型菌 可能失去抗酸性 结核菌生物学基础 生物特性 结核菌生物学基础 培养特性 生长适宜温度370C PH6 8 7 2 营养要求较高 在常用的罗氏 Lowenstein Jensen 培养基上生长的菌落粗糙 凸起 致密 有表面皱折 呈颗粒 结节或菜花样 乳白色或米色 不透明 结核菌生长缓慢 在一般培养基上分裂一代需要10多小时 根据接种菌量的多少 一般10 30天肉眼可见菌落生长 结核菌检验方法 一 涂片法 直接涂片法集菌法二 培养法 鸡蛋固体培养基法 Lowenstein Jensen 快速培养法三 动物试验四 分子生物学诊断 PCR 五 免疫学诊断 各种方法可检出结核杆菌数量 个 ml方法直接涂片集菌培养动物试验PCR菌数10 0001 000100101 一条结核杆菌在体内的繁殖情况 结核杆菌数 结核杆菌数 结核杆菌数 排菌量 1ml痰液中含菌量为1000 10 000 其痰涂片阳性率为40 50 痰涂片检查的意义 一 痰菌检查是确定传染源的唯一方法 控制结核病流行以发现和控制传染源为主 痰涂片抗酸杆菌 AFB 阳性的肺结核患者是结核病的主要传染源 因此痰涂片AFB镜检结果对诊断传染性结核病是一项重要指标 二 痰菌检查是确定化疗的依据 病人是否需要化疗 首先应以痰结果为准 如不查痰或查痰不对 就只能凭X线判断有无活动性 这样就可能将本来没有活动性 不需治疗的病人进行长期治疗 三 痰菌状况是流行病学重要指标由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义 因此在反映某一国家或地区结核病疫情严重程度的指标中 年感染率 涂阳患病率 涂阳发病率被更多关注 四 化疗方案的选择需以查痰结果为根据排菌病人 说明在病变中藏有大量繁殖旺盛的结核菌 需要有强有力的化疗方案 以达到迅速控制繁殖 短期内杀灭大部分结核菌的目的 不排菌病人 一般病变中结核菌数量不大 繁殖不旺盛 就不必要用特别强的化疗方案 排菌与不排菌病人的治疗 在用药品种配伍 化疗时间管理方式上都有明显差别 五 化疗效果的考核过去常以X线病变变化为考核治疗效果的指标 当前认为以痰菌阴转考核化疗效果更为合适 因为 1 化疗作用在于直接杀灭病灶中的结核菌 痰菌的变化反映了病变的情况 2 痰菌检查较X线更客观 误差较小 在各地 各人前后之间比较容易标准一致 可比性大 五 化疗效果的考核3 化疗目的在于控制传染源4 化疗情况下 痰菌变化比X线敏感 5 有效化疗下 完成疗程 痰菌阴转后 即使X线阴影尚未完全吸收 硬结 稳定 也可以停药 化疗前后结核杆菌的定量分析 1976年Yeager报告对痰菌阳性病人在化疗前后做结核杆菌培养的定量分析 化疗前每ml细菌数106 107 化疗2周后减少至5 4周减少至0 25 化疗后结核杆菌呈对数减少以至消失 降低了传染性 六 化疗中查痰要求 治疗方案痰涂片检查6个月方案8个月方案强化期第2个月末第2个月末继续期中第5个月末第5个月末治疗末第6个月末第8个月末 痰涂片检查的优点 1 作为诊断手段 对传染性肺结核的诊断比x线准确性高 2 作为实验方法 AFB镜检方法技术相对简单 3 建立AFB检查所需设备投入少 4 检查成本低 易于接受 5 报告结果时间短 能满足临床诊断的需求 6 对阳性患者的治疗效果 能够作出及时和准确的评价 检查对象 确定诊断 凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者 均应进行直接涂片检查 一般包括持续咳嗽 咳痰超过3周 咳血或伴有血痰 发热或胸痛超过2周 胸部X线异常 确定诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本 就诊当时在门诊留一份 即时痰 标本 同时给患者2个痰盒 嘱患者留取 夜间痰 和 晨痰 于次日交验 疗效评价 凡已确诊 登记 治疗的肺结核患者 在化疗期间按照规定应定期查痰 初治涂阳患者在疗程满2 5 6个月时 复治涂阳患者在疗程满2 5 8个月时 按期送检两份痰 当日即时痰 当或次日晨痰 疗效评价 初 复治涂阳患者在疗程满2个月时 痰菌仍为阳性者 应在延长期满1个月时增加检查一次 若复治涂阳患者治疗满3个月时痰菌仍阳性 应在治疗满5个月增加晨痰检查一次 送检两份痰 当日即时痰 当或次日晨痰 确诊 登记的涂阴肺结核患者 即使患者因故未接受治疗 也应在登记后满2个月和6个月时进行痰菌检查 痰标本的采集 1 容器 采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶 或可密封塑料盒 蜡纸盒收集痰标本 参考规格 直径4厘米 高度2厘米 痰容器应标明病人姓名 编号 初诊病人门诊序号或随访病人登记号 检查项目和容器序号1 2 3 1 当日即时痰 2 夜间痰 3 次日晨痰 痰标本采集 2按采集的时间 可将标本分为三类 即时痰 就诊时深呼吸后咳出的痰液 晨痰 患者晨起立即用清水漱口后 咳出的第2口 第3口痰液 夜间痰 送痰前一日 患者晚间咳出的痰液 痰标本的采集 3 对疑似肺结核病者 临床医护人员应通过解释 使其充分了解标本质量对相应检查项目的重要性 示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法 如患者识字 可提供宣教材料 注意 由于当患者咳嗽 咳痰时易于产生含有结核菌的气溶胶 感染周边人群的机率较高 故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行 或在通风良好的室内进行 痰标本的采集 4 患者留取的痰标本 应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量 特别是用于初次诊断的痰标本 标本量一般在3 5ml 标本性状属于干酪痰 褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰 粘液痰者为合格的标本 痰标本不合格者 应予以进一步指导并要求其重新送检 进行细菌学检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状 以供分析结果时参考 标本的性状 1合格的痰标本应是患者深呼吸后 由肺部深处咳出的分泌物 干酪痰 标本外观以黄色 或奶酪色 脓样 团块状的肺部分泌物为主 粘度较粘液痰低 制片时较易涂抹 涂片染色后镜检 可发现大量脓性炎症细胞 肺上皮脱落细胞 血痰 此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成 颜色为褐色或深褐色 鲜红色或伴有血丝 标本的性状 2 粘液痰 标本外观以白色 粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主 制片时需仔细涂抹 涂片染色后镜检时 镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞 伴有少量肺上皮脱落细胞 脓性炎症细胞 口腔脱落细胞及口腔寄生菌 此类标本的AFB检出率较唾液高 标本的性状 3 唾液 目视观察标本整体外观 以透明或半透明水样 粘度较低的口腔分泌物为主 标本中有时伴有气泡 涂片染色镜检时 镜下可见少量口腔上皮脱落细胞 形态不规则 细胞核着色较细胞质深 核质比接近或大于1 2 和口腔内寄生菌 有时可见食物残渣 由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低 用于对患者确定诊断时是不合格的标本 涂片抗酸染色检查方法 1 用于AFB检查的玻片要求 一张栽玻片上只能涂抹一份痰标本 每张栽玻片只能使用一次 不得清洗后再次用于AFB涂片检查 涂片抗酸染色检查方法 2 用于AFB检查的玻片要求 在玻片正面一端的1 3处注明实验室序号及标本序号 如使用的载玻片一端无磨砂面 必须使用玻璃刻刀注明编号 如使用的载玻片一端有磨砂面 可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写 涂片抗酸染色检查方法 3 制备涂片 小心打开承载痰标本的容器 防止产生气溶胶或使标本外溢 仔细观察标本 使用折断的竹签茬端 挑取痰标本中干酪样 脓样或可疑部分约0 05 0 1ml 于玻片正面右侧2 3处 均匀涂抹成10mm 20mm的卵圆形痰膜 痰膜朝上静置自然干燥后 一般约需要30分钟 进行染色 涂片抗酸染色检查方法 4 制备涂片 涂抹完毕后的痰标本 在结果报告前应暂时保留 为了保证检验人员的安全 严禁在涂抹痰标本的同时 对载玻片进行加热 涂片抗酸染色检查方法 5 Z N染色步骤 操作流程 涂痰膜自然干燥 复红加热初染5分钟 自然干燥镜检 流水冲洗 美兰复染30秒 5 盐酸酒精脱色1 3分钟 流水冲洗 流水冲洗 涂片抗酸染色检查方法 6 一张染色合格的玻片 被亚甲兰染色而呈亮蓝色 将染色后的玻片放置在报纸上 如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字 则表明该玻片涂抹过厚 萋尼氏染色玻片镜检 使用双目显微镜10 目镜读片 取染色完毕且已干燥的玻片 痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定 首先使用40 物镜 转动卡尺移动玻片至痰膜左端 将光线调节至适当亮度 调节焦距至可见细胞形态 移开40 物镜 在玻片上滴1 2滴镜油 使用100 油镜进行细致观察 镜检读片 1 读片时 首先应从左向右观察相邻的视野 当玻片移动至痰膜一端时 纵向向下转换一个视野 然后从右向左观察 依此类推 通常10mmx20mm的痰膜 使用100 油镜 每行可观察约100个视野 镜检读片 镜检读片 2推荐使用专门用于100 油镜 不干燥 不变硬的镜油 仔细观察完300个视野 一般需要5分钟以上 每个工作日 连续阅读10 12张玻片后 应休息20分钟左右 萋尼氏染色镜检结果报告 由于与疾病传染的程度及其相应严重程度密切相关 故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据 因此痰涂片镜检的结果报告 不仅是对疾病的定性 也是对疾病严重程度的半定量 结果分级报告标准 抗酸杆菌阴性 连续观察300个不同视野 未发现抗酸杆菌 报告抗酸杆菌菌数 1 8条抗酸杆菌 300视野 抗酸杆菌阳性 1 3 9条抗酸杆菌 100视野 抗酸杆菌阳性 2 1 9条抗酸杆菌 10视野 抗酸杆菌阳性 3 1 9条抗酸杆菌 每视野 抗酸杆菌阳性 4 10条抗酸杆菌 每视野 结核病细菌学实验室登记本 填写说明 实验序号和编号 初诊病人的3个标本 随访病人的2个痰标本 要在玻片上注明每个痰标本的序号和编号 例如 实验序号为18 3个痰标本的编号分别为18 1 18 2 18 3 痰标本来源 初诊病人门诊序号以门诊登记本为据 随访病人登记号以病人登记本为据 痰标本性质 干酪痰 血痰 粘液痰和水样痰分类登记 标本镜检结果 中的 日期 为实际镜检日期 即时痰与晨痰阳性检出率比较 即时痰总计 晨 217 84 4 29 11 3 246痰 6 2 3 5 2 0 11合计22334257 不同性状痰样本涂片检查分枝杆菌阳性检出百分率 作者干酪样痰血性痰脓性痰粘液性痰水样痰郭氏 78年 63 6 77 121 31 4 13 26 4 37 140 8 7 74 847 2 8 2 71 车氏 87年 65 5 36 55 34 8 16 46 32 1 42 131 10 6 56 52 9 4 3 4 92 宋氏 97年 72 36 50 30 8 60 26 8 52 194 20 38 190 2 7 4 148 闫氏 99年 76 5 39 51 41 2 21 51 33 3 33 99 20 6 49 238 2 3 7 304 假阳性产生的原因 偶尔痰标本或涂片上有抗酸颗粒 用萋 尼法染色后 这些颗粒仍保持红色 石碳酸复红 用酸酒精不脱色 这些红色颗粒有时与结核菌相象 这些颗粒包括 一 一些抗酸颗粒 1 1 食物颗粒 如蜡 油 要去掉这些 嘱病人在留标本以前清水漱口 刷牙 不用牙膏或消毒剂 更好是嘱病人在早饭前或空腹时留标本 一 一些抗酸颗粒 2 2 染液沉渣虽然这些沉渣与抗酸杆菌容易辨别 但可影响镜检或偶尔使经验不足的镜检者看错 沉渣可以通过过滤从染液除去 保险的方法是使用新鲜配制经过滤的染液 而不用陈腐的染液 二 细菌 微生物 植物类等 1 1 腐生抗酸杆菌这些菌出现在土壤和水里 在工作时有时会混入痰标本里或涂片上 用蒸馏水或煮沸过的水就可以避免 2 非结核分枝杆菌如 堪萨斯分枝杆菌 枯草杆菌的芽孢枯草杆菌的芽孢等 这些抗酸杆菌偶尔出现在标本里 当这些菌引起肺部疾患时 出现的菌数较多 二 细菌 微生物 植物类等 2 3 纤维和花粉纤维 包括毛 棉 滤纸和竹等 一般单个地出现 而且只在一个视野里 某些松树的花粉是短小 球菌样的杆状 标本里较罕见4 玻片反复使用 不洁净 有划痕 常常会滞留痰液 使初学者弄混 划痕多呈并排状波纹形 一般比抗酸菌长 三 操作过程中造成的污染 1 1 染色当几个玻片同时放在一个染色缸或脱色缸里处理时 有时抗酸杆菌会从一个阳性玻片上污染到另一个阴性玻片上 因此抗酸染色不允许缸染 必须把每一张玻片放在染色架上分开处理就可以防止这种情况 三 操作过程中造成的污染 2 2 镜检油滴管接触到涂片上 油镜头碰到涂片 用吸水纸连续压干几个涂片均可造成交叉污染 假阴性产生的原因 假阴性结果常常是由于涂片 染色以及镜检中的缺点 做一个好涂片 痰标本的收集以及痰块的选择是基本要求 应予以特别注意 一 痰收集不好 有时病人没有被告诉清楚什么是一个合格的痰标本 怎么咳出来 必须清楚的告诉病人唾液和鼻咽部的分泌物不是痰 不适合于检查 应该鼓励病人并且给他时间要从肺内 深处 把支气管里的痰咳出来 如果咳不出来 可用咽试子或向气管内滴入5 10毫升冷盐水 或蒸馏水 有条件的地方可以用超声雾化的方法取痰 其它刺激方法如洗胃以及支气管镜等 二 痰标本和痰涂片的保存不善 1 抗酸杆菌可因标本受到日光照射 紫外线辐射 过热 在干 热的条件下储存而失掉抗酸性 2 在保存涂片时 应将玻片上的香柏油用二甲苯去掉 因为油会撤掉抗酸杆菌的颜色 三 未能选好合适的痰颗粒作涂片 结核菌最容易在痰里灰绿色或黄色浓稠奶油样的小粘块里找到 这些小粘团常常含有从肺内空洞里排出的干酪样坏死组织 假如痰未经离心和浓缩处理 则应从痰里仔细地把这些小粘块挑出来 四 涂片做的不当或染色不当 1 涂片上涂抹的痰液太少 一致涂片太薄 2 涂片过后 透光性差 3 涂片固定时过热 4 涂片固定不好 一些东西被冲洗脱掉 5 石碳酸复红染色时间过短 或因过热而沸腾 造成染色太重 6 复染太浓 以致抗酸杆菌模糊不清 五 涂片阅读不够 扫描阅读的不规范或时间过短 则检查的视野太少 六 错误结果的其它原因 1 弄错了病人 写错了名字 把名字或标本号 涂片号弄乱 2 痰容器的标签弄错 3 记录或结果报告写错 4 阅读上的错误 由于视觉和心理上的原因造成的 也称之为 人的因素 5 涂片镜检的个人之间的阅读差异 据报道 对于这样一个问题 这个涂片的抗酸杆菌是阴性还是阳性 一致率是93 6 诊断偏见 倾向于有病 假阳性结果与预防措施 1一 假阳性结果的后果1 造成不必要的治疗及药品的浪费 2 对国家结核病措施的执行产生影响 假阳性结果与预防措施 2二 预防措施1 必须使用新的载玻片进行相应检查 2 每个标本均使用一个新竹签完成涂片涂抹 3 所有染液均经过滤 4 染色时玻片彼此保持一定距离 相互彻底隔开 5 严禁使用染色缸染色 假阳性结果与预防措施 3二 预防措施6 染色时勿使玻片上的染液干燥 7 滴加镜油时 严禁容器滴口直接接触玻片痰膜 8 严禁物镜镜头直接接触玻片痰膜 9 完整 准确地标注痰盒 标本和实验室登记本 10 登记前 后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对 11 准确纪录和报告结果 假阴性结果与预防措施 1 一 假阴性结果1 患者未给予治疗 造成身体进一步损害 结核病传播 甚至死亡 2 未能得到合理的强化期