利用植物反应器生产药物蛋白及疫苗的研究进展.doc

植物反应器生产药用蛋白的研究进展李世成现代基因工程技术最初是建立在结构简单的微生物，尤其是以大肠杆菌为受体表达外源蛋白，用植物反应器生产药用蛋白的思路出于偶然。二十世纪八十年代，比利时PGS公司的科学家将一个神经肽（enkephalin，脑啡肽）编码基因转入烟草中表达，用意在于让瘾君子们不用抽烟，只需拿烟叶闻一闻或放在口中嚼一嚼即可过烟瘾，以此减少尼古丁对人体的危害及减少空气污染。他们在这个小肽基因两端设计了两个蛋白酶的酶切位点，将改造后的基因串联导入烟草细胞并成功获得再生植株，结果小肽以多聚体的形式表达存在，用胰蛋白酶和羧肽酶作用后获得了神经肽，每粒种子在200nmol。虽然，他们的目的最终没能达到，因为神经肽要经血液运输而起作用，在口腔及消化道内会被降解掉，但他们却意外地找到了一条利用转基因植物生产药用蛋白的途径，引起人们对此领域的关注。尤其是转基因植物生物反应器的研究和开发使植物能以极低的费用大量生产药用蛋白,具有极大的商业价值。植物反应器生产药用蛋白的优点利用植物反应器生产药用蛋白已成为制药产业重点开发的热点领域。通过植物基因工程技术，在转基因植物中生产药用蛋白及多肽疫苗，具有微生物或动物反应器不可替代的独特优点（见表1）。它们不仅可以对真核生物蛋白进行准确的糖基化、酰氨化、磷酸化、亚基的正确装配等翻译后加工，使表达产物具有良好的生物活性和较低的免疫原性，而且也不像细菌在发酵过程中那样由于产生不溶聚合物包涵体，而需要将它们重新溶解并折叠成天然蛋白质，这一过程所需要的成本很高；不仅如此，植物反应器也不会像动物反应器那样含有人类的潜在病原或其他污染等潜在的威胁；另外利用植物反应器，来源广，可进行大量田间栽培；转化植株系的种子易于储存，有利于重组蛋白的生产和运输；投资小，成本低。据推算，利用转基因植物生产药用重组蛋白的成本，仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的 110 150。表1 微生物、动物和植物反应器的比较原核微生物反应器植物反应器动物反应器真核蛋白翻译后加工的能力有限；上游生产成本较低；细胞培养需要用胎牛血清作为生长培养基，以及从培养上清中提取，成本昂贵；细菌发酵常形成不溶聚合物或回收率低；基因转化容易、成功率高、周期短、表达量高、提纯容易、收效快（少于两年）；转基因动物生长繁殖、饲养条件及营养要求高；宿主菌的表达药物种类及表达量有限；转基因植物自交后得到的同质后代的遗传性状稳定；进而在植物体内积累多基因；基因转化难度大、转化成功率低、生产药物等待周期长（牛需要7年，羊需要3年）；噬菌体等污染造成倒灌的威胁；不存在噬菌体污染造成倒灌的威胁；动物反应器的污染问题；下游加工复杂、成本高；发酵常常需庞大的设备投资。可食药物节省下游加工开支；转基因动物易产生社会和伦理问题。植物反应器生产药用蛋白研究进展近20年来，随着植物基因工程的迅速发展，在植物抗虫、抗病毒和品质改良等方面已取得了举世瞩目的成就，同时利用转基因植物生产药用蛋白等为攻克医药难题也开辟了新的天地。科学家正逐渐把药物的生产从微生物转向植物，在这方面许多国家竞相研究。据不完全统计，目前已有几十种药用蛋白或多肽在植物中成功表达，一些研究机构或公司已开始从这些药物蛋白的生产中获得了巨大经济效益。1、植物抗体自从十几年前转基因烟草成功地表达免疫球蛋白的重链和轻链基因并组装成功以来,植物已经能够生产完整的IgG和IgA分子,分泌型IgG 和IgA 分子,单链可变区片段(scFv),Fab片段和重链可变区以及双特异性抗体(通过具柔性的肽键接头连接到一起),膜锚定抗体以及嵌合型的IgG和IgA 分子等不同类型抗体。应用植物生产单克隆抗体具有极大的市场潜力,获得的价格低廉的单克隆抗体在人类及牲畜的疾病治疗中将发挥巨大的作用。目前已经成功地获得具有潜在医疗价值的植物抗体。主要有转基因烟草生产针对腐蚀牙齿的致病原Sreptpcpccus mutans 抗体IgG-IgA、人抗疱疹病毒(antiherpessimplex virus) 的抗体、针对癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ,CEA) 的抗体、利用植物病毒载体侵染烟草瞬时表达淋巴瘤特异的疫苗等植物抗体全面用于诊断和治疗需要解决的主要问题包括产品的数量和质量、下游纯化工艺、糖基化等。通过调节表达元件、优化密码子以及提高抗体的稳定性可提高表达系统中重组抗体的积累水平。重组蛋白在植物体内的糖基化 (glycosylation)方式与在人体内不同，这一问题近年来引起人们的关注，因为不同模式的糖基化会对人体形成免疫原性。一些专门的研究工作就是针对如何消除这种免疫原性的，如在不需要糖基化仍具有抗体活性的情况下，将抗体中有关植物N-糖基化的识别序列去除。对于高尔基体介导的糖基化，只要在抗体的C末端附加内质网滞留信号肽 KDEL，就可避免糖基化。另一种非常理想的方法是将植物糖基化方式转变为适合人体的糖基化，如将人的-1,4-乳糖基转移酶（galactosyl transferase）转化烟草， 然后再与表达鼠抗体的烟草杂交，其后代产生的抗体就完全适合于人体了。这有助于消除对植物抗体作为人类药物可能存在免疫原性和致敏性等问题的忧虑。而且人类食物中普遍存在植物糖蛋白,因此对多数人而言,植物抗体的应用不会存在危险。2、口服疫苗转基因植物生产口服疫苗的前景非常诱人。在植物组织内合成某种致病原的关键免疫原性蛋白,然后作为可口服的亚单位疫苗给人和牲畜服用,人或动物的体内就会产生相应的抗体,具有抵抗该致病原的能力。迄今为止,在植物中表达用于疫苗研究的病原基因主要有乙肝疫苗、大肠杆菌热敏肠毒素B 亚单位(LTB) 基因 、霍乱弧菌毒素B亚单位(CTB) 基因 、Norwalk 病毒衣壳蛋白疫苗、猪传染性胃肠炎病毒S 糖蛋白(TGEVS) 基因 、口蹄疫病毒VP1蛋白(MDVVP1) 基因、狂犬病病毒G蛋白基因 、兔出血病病毒(RHDV) VP60 蛋白基因等。另外结核杆菌分泌蛋白MPT64 基因在胡萝卜中获得了表达 ,轮状病毒结构蛋白vp4 、vp7 基因分别在马铃薯中获得了表达。与注射疫苗相比,口服疫苗成本低、便于管理,是一种很有市场前景的大众免疫防护方式。口服疫苗还能够提高黏膜免疫力,提高对通过黏膜表皮进入人体的传染性因子的抵抗能力。目前对于口服疫苗的主要忧虑在于:蛋白质成分在胃肠中的降解是否在引发免疫反应之前。为了防止降解,人们利用重组微生物,脂质体以及转基因植物组织运送这些蛋白质,使这些蛋白质能够完整地到达肠部,引发免疫反应。目前已开发了几种有效的制剂，如生物胶丸。另外，表达水平一直是关注的焦点。在现有的研究中,外源基因所表达的重组蛋白大约只占植物中可溶性蛋白的0.01%0.37% ,即使以高表达量者为标准,此表达量作为疫苗仍然很低。那么如何提高转基因植物的抗原蛋白产量?针对这一问题,解决方法是通过对目的基因的修饰，如附加先导序列和poly（A）信号、优化密码子以适应植物系统或通过转基因植物与各种遗传背景杂交，都可提高表达水平。表达产物在细胞中的定位也很重要，关系到转译后加工及产品的稳定性。对于亚单位疫苗而言,适宜表达部位是细胞表面、内质网以及高尔基体。人们还将疫苗基因与植物病毒表面蛋白基因融合构成瞬时表达系统,也得到了较高的表达水平。还有一个相关的策略是用来抵抗自身免疫疾病:利用转基因植物表达自身抗原作为口服疫苗,服用较大剂量的自身免疫原产生免疫耐受,进而达到抑制自身免疫疾病的发生。这一策略已经在治疗糖尿病的小鼠模型中获得了成功。3、其他蛋白质生产具有药学活性的植物蛋白和多肽是近年来转基因植物应用的另一迅速发展的领域。大量研究表明，人体内含量甚微但具有重要临床价值的蛋白或多肽也可在植物系统中表达。如人生长激素、人血清白蛋白、人干扰素、人蛋白C、人表皮生长因子、红细胞生长素、脂肪酶、乳铁蛋白、水蛭素、胶原蛋白等。目前生产实践中面临的主要问题仍是表达水平过低。编码人源蛋白质的基因在植物中的表达量很低:人血清白蛋白(human serum albumin)占植物TSP的0. 020%；人蛋白C(human protein C)占0.001%；红细胞生成素(erythropoietin ,EPO) 占0.003 %；人干扰素(human interferon-)不到0.001 %(鲜重) 。人工合成的人表皮生长因子(human epidermal growth factor) 基因在转基因烟草中表达量仅达到TSP的0. 001% 。一般来说，在临床应用中需要纯化的重组蛋白表达量应占转化细胞TSP的1%以上时才具有商业价值。因此, 真正用于生产还需做大量工作。为了进一步提高人源蛋白在植物细胞内的表达水平,人们采用的策略: (1) 希望在叶绿体内合成复杂的需要翻译后修饰的或亚基装配的真核蛋白质,如sIgA ；在高等植物叶绿体中表达外源基因是一种可供选择的转基因体系。整合到烟草叶绿体基因组中的外源基因拷贝数能够达到每个细胞10000个拷贝,相应的重组蛋白占全部可溶性蛋白的比例也提高到47%；(2) 蛋白质靶向定位:重组抗体不在细胞质中而是靶向定位在离质体(apoplast) 的表达策略明显提高了重组抗体的产量；靶向定位在内质网的重组蛋白的表达水平提高了10100 倍； (3) 植物中遗传密码子的使用频率与动物不同,对外源基因的一些密码子进行替换能够显著提高该基因在植物体内的表达水平；(4) 使用组织特异启动子和病毒序列能够提高基因转录和翻译的水平；(5) 在拟南芥中生产豆类arcelin ,同时表达种子储存蛋白清蛋白(albumin) 2S 的反义基因,结果使得arcelin 的表达量达到种子总蛋白的24%,利用相似的策略有助于显著提高目标蛋白的表达水平。 药用蛋白的表达策略在植物中生产药物蛋白主要通过两个途径：第一条途径是利用土壤杆菌或农杆菌属（Agrobacterium）介导转化法、粒子轰击法或其他标准转化技术，来培育稳定转化的转基因植物。这一途径科学家作了许多研究工作。1989年美国Scripps研究所分别克隆了抗体的重链和轻链基因，并导入烟草中，子代烟草叶片中抗体表达量达叶片总蛋白的1.3%，随后白细胞介素、血清白蛋白、二氢吡啶羧酸合成酶等都成功地在烟草中得到表达。在疫苗方面，霍乱毒素蛋白、乙型肝炎抗原、狂犬病抗原、Norwalk病毒外壳蛋白、疟疾抗原及口蹄疫抗原VP1均在不同的转基因植物中得到表达。用这些转基因植物或植物的提取物饲喂小鼠，可以在小鼠体内引发一定的免疫反应，表现出对相应病毒的抗病力，也就是说，这些转基因植物作为饲料对小鼠有强的免疫作用。美国得克萨斯州ProdiGene 公司利用转基因玉米来表达病毒的抗原，首次生产了一种可食疫苗。该可食疫苗生产的资金和人力投入都比较少。在动物实验中，将这种丸状或粉末状的疫苗饲服动物，可使其抵抗病毒感染。该可食疫苗已获得美国专利，并将在美国农业部批准的两三年后投入商品化生产。由于这种疫苗价格低廉、使用方便，因而拥有很好的市场前景。尽管在利用转基因植物生产药用蛋白等方面取得了很大的成绩，但科学家们仍然遇到了外源基因表达水平低的困难，于是科学家们又开发了另一条途径，通过植物病毒作为载体，重组病毒感染植株，使其在复制时将转移基因表达于宿主，瞬时高效表达大量外源蛋白，这是农杆菌等表达系统所不能做到的，它已成为转化植物生产药用蛋白等的重要方向。植物病毒作为瞬时表达载体具有许多优点： 首先是病毒增殖水平较高，可使伴随的外源基因有高水平表达，相对于基因遗传转化，其表达量高达100多倍。其次，病毒增殖速度快，外源基因在较短的时间内，通常在接种后12周以内就可达到最大量的积累。第三，植物病毒的基因组很小，易于进行遗传操作。而大多数植物病毒可以通过机械接种感染植物，这样适于大规模的商业操作。第四，植物病毒可以侵染单子叶等农杆菌的非寄主植物，扩大了基因工程的适用范围。另外，植物病毒主要是利用植物细胞的遗传物质进行繁殖，可以使伴随表达的外源蛋白进行真核生物特有的修饰如翻译后加工和糖基化，这也是大肠杆菌和酵母等表达系统所不能的。国内外不少实验室开展这方面的研究，已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体，包括花椰菜花叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）和豇豆花叶病毒（CPMV）等，其中超过150多种蛋白多肽在TMV载体中成功表达。如美国科学家在TMV中插入指导合成血红蛋白和其它蛋白质的基因，使用叶片切刀和滴管把这种重组病毒引入植物叶片，在两周之内所有叶片便感染病毒，并开始制造目的蛋白质。运用同样的思想方法，英国剑桥的农业基因公司最近宣布已成功地在植物中生产动物疫苗。他们将口蹄疫苗（FMDV）和艾滋病病毒（HIVl）的表面蛋白导入植物病毒载体豇豆花叶病毒（CPMV）基因组，CPMV的分子结构显示构成外壳蛋白之一的S蛋白的BC环编码区中有单个插入位点，FMDV和HIV1核酸序列可插入该位点，且不改变由FMDV抗原决定基因的读码框。用机械方式接种豇豆植株，10d（天）后，接种过的植株显示已被野生型CPMV侵染相同的症状。检测表明，杂合RNA指导产生了完整的病毒粒子，据估算，一片豇豆叶足以产生200剂疫苗所需的病毒。这些实验的成功，无疑为极大降低治疗艾滋病等疑难病症的成本提供了可能性。用植物病毒做载体生产药用蛋白为生物技术开辟了新的领域，极有希望成为药用蛋白的主要来源和生产方法。因此许多发达国家争相研究，一旦有所突破，立即在世界范围内申请专利权，因为这项技术从实验室走向商业化生产后，将产生巨大的经济效益。还有可能产生新的垄断！问题及展望研究及应用植物生物反