木瓜蛋白酶的纯化和性质_cropped.doc

文章编号 :1007 5570 (2002) 01 - 0011 - 04木瓜蛋白酶的纯化和性质乙引 ,张显强 ,唐金刚 ,罗在柒(贵州师范大学 生物科学技术系 ,贵州 贵阳 550001)摘要 :探讨木瓜蛋白酶的理化性质 ,对番木瓜未成熟果实乳汁进行真空干燥 、( N H4 ) 2 SO4 沉淀和 SP - Sep hadex 50柱层析 ,分别得到木瓜蛋白酶的粗酶 、精酶和纯化酶 ,可用于不同的工业用途 。同时 ,对纯化的木瓜蛋白酶进行 了分子量 、等电点 、巯基数目 、圆二色性 、反应动力学以及 N - 末端和 C - 末端氨基酸序列等性质的研究 ,为该酶 的进一步开发提供科学依据 。关 键 词 :木瓜蛋白酶 ;纯化 ;性质中图分类号 :Q55文献标识码 :APurif icat ion an d characterizat ion of pa pa inYI Yi n , ZHAN G Xian2qiang , TAN G J i n2gang ,L U O Zai2qi(Depart ment of Biological Science and Technology , Guizhou Normal U niversity , Guiyang , Guizhou 550001 , China)Abstract : Papain in unripped f ruit of Ca rica p a p ay a was p urified by vacuum desiccatio n , ( N H4 ) 2SO4 depo sit and SP - Sep hadex 50 chro matograp hy. The p ro duct s of each p rocess had t heir use fo r i ndust ry. In t he meantime ,t he p roperties of p urified papain were st udied ,such as molecular weight , isoelect ric point ,sulf hydryl number ,circular dichroism ,reactio n kinetics ,and amino acid sequence of N2and C2ter minals. The result s can p rovide scientific basis fo r t he f urt her develop ment of papain .Key words : papain ;p urificatio n ;characterizatio n剂 ,用于治疗消化不良 、各种炎症和水肿 ,防止腹膜粘连 ,处理血检及创伤脱痂 ;此外 ,它还可以用于研 究蛋白质结构1 。早在 1873 年 , Roy 就报道了番木瓜果实的乳 汁可作为酶的来源2 。以后的研究表明 , 番 木 瓜 未成熟果实中含有木瓜蛋白酶 、木瓜凝乳酶 、木瓜 肽酶 A 、木瓜肽酶 B 等多种蛋白水解酶 。其中 ,木 瓜蛋白酶属巯基蛋白酶 ,可水解蛋白质和多肽中精 氨酸和赖氨酸的羧基端 。近年来 ,虽然有关木瓜蛋 白酶的研究工作已有很多报道3 27 ,但大多集中于0前言木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜茎叶和果实中 ,以未成熟果实的乳汁中为最高 。因其含量高 、稳定 性好 、蛋白水解能力强 ,对多种蛋白质均具有很好 的降解作用 ,目前已被广泛应用于各个行业 。在食 品中 ,用于肉类嫩化 、啤酒澄清 、饲料添加剂 ,饼干 松化剂和鱼类加工 ;在工业上 ,用于明胶制造 、蚕茧 脱胶 、皮革脱毛等 ; 在医疗卫生方面 , 用于驱肠虫收稿日期 :2001 - 09 - 19气 ,加入 0125 mL l mol/ L KH2 PO4 - 012 mol/ L HCl溶液 , 5 min 后 加 1 mL 丙 酮 , 密 封 , 振 荡 试 管 , 使NaB H4完全分解 。通氮气 5 min ,加 0125 mL 0101 mol/ L D TNB 水溶液 ,用水定容至 3 mL ,通氮气 2 min ,密封 ,静置 15 min ,测 412 nm 的吸光度 。11216 Cys 含量测定 木瓜蛋白酶经过过甲酸氧 化 ,6 mol/ L HCl 水解 ,用氨基酸自动分析仪测定 。11217 N - 末端氨基酸序列测定 用丹酰氯法测定11218 C - 末端氨基酸序列测定 取 215 mg 木瓜 蛋白酶溶于 400L 双蒸水 ,加入 8L 10 % SDS 溶 液 ,100 水浴 5 min ,冷却后加 400L 011 mol/ L Na2 HPO4 - 柠檬酸缓冲液 (p H810) , 最后加 80L 羧肽酶 A ( 1 mg/ mL ) ,30 下反应 ,间隔一定时间 取出一定体积反应液 ,加等体积 1 mol/ L 醋酸溶液 终止反应 ,离心去沉淀 ,用氨基酸自动分析仪测定 上清液中氨基酸的含量 。根据其出现先后和数量 来推算氨基酸序列 。木瓜蛋白酶的应用开发上 ,对其理化性质的研究有待加强 。此外 , 对于木瓜蛋白酶的商业化生产来 说 ,不同用途的酶所要求的纯度存在相当大的差 异 。再有 ,木瓜蛋白酶初级生产地大多分布于经济 不发达地区 ,导致精酶生产不可能直接取用新鲜乳 汁 ,而必须使用含木瓜蛋白酶的干燥乳汁 。因此 , 研究木瓜蛋白酶的理化性质 ,对于建立系统 、有效 的分级制备工艺具有现实意义 。本课题组曾就木瓜蛋白酶粗品的生产工艺进 行过研究8 , 本文进一步探讨不同等级木瓜蛋白 酶的生产工艺及酶的性质 ,以期为该酶的有效生产 和进一步开发提供科学依据 。1 材料和方法1 . 1实验材料未成熟番木瓜的新鲜乳汁取自贵州省三都水族自治县 。1 . 2实验方法1 . 2 . 1木瓜蛋白酶活力测定和 Brocklehurst (1976) 的方法9参照 Malt ho use, 以苯甲酰 - L -2 结果与讨论精氨酸乙酯为底物 。蛋白质浓度用紫外分光光度法 。11212 蛋白质电泳 用 I EF - PA GE 测定蛋白质p H 值 ,以两性电解质 Amp holine 形成 p H 梯度 。11213 圆二色性测定 样品在 4 下对 0101 mol/ L 磷酸缓冲液 (p H710) 渗析 48 h ,然后用 J A SCO J- 500A 型旋光光度计记录 ,温度为 25 ,用 ( + )- 10 - 樟脑磺酸校正 。在远紫外区 ( 182250 nm) 测量时 ,用 011 cm 比色槽 ,蛋白浓度约为 011 mg/ mL ;在近紫外区 ( 250320 nm) 测量时 ,用 110 cm 比色槽 ,蛋白浓度约为 014 mg/ mL 。蛋白浓度用紫 外分光光度法测定 。11214 自由巯基测定 取 015 mL 蛋白质溶液 ,加015 mL 含 4 %SDS ,1 mg/ mL ED TANa2 的 011 mol/ L 磷酸缓冲液 (p H810) ,再加含 50L D TNB (4 mg/ mL ,p H810 ,011 mol/ L 磷酸缓冲液) ,反应 15 min , 测 412 nm 吸光度 。211木瓜蛋白酶的纯化21111粗酶制备取新鲜乳汁 ,经搅拌使其液化 ,过滤 ,加入等量 含 012 mmol/ L ED TA , 1 mmol/ L NaCl 和 0104 mol/ L Cys 的溶液 , 混合均匀后 , 缓慢加入已溶解 的丹宁溶液至浓度达到 011 % ,静置 ,用盐酸调 p H 至 314 ,3 500 r/ min 离心 20 min ,沉淀于 60 真空 干燥 ,粉碎后即得粗酶 。该方法实际上属物理浓缩 过程 , 其 得 率 为 3617 % , 酶 活 力 约 为 600 U / mg DW 。用该法制备木瓜蛋白酶设备简单 , 投资少 , 而且酶稳定性好 ,适合用于食品及制革等对酶纯度 要求不高的工业 。21112精酶制备取上述固体粗酶 ,加入含 0104 mol/ L Cys 和 1 mmol/ L ED TA 的溶液 (p H517) 中 , 研磨 , 过滤 , 滤液用 1 mol/ L NaO H 调 p H 至 910 , 不 断 搅 动 10 min ,过 滤 , 滤 液 中 加 ( N H4 ) 2 SO4 至 45 % 饱 和 度 ,20 ,000 g 离 心 30 min , 沉 淀 用 1 mmol/ L ED TA溶解 , 再加入 ( N H4 ) 2 SO4 至 40 %饱和度 , 离心 , 沉 淀溶于含 0104 mol/ L Cys 和 1 mmol/ L ED TA 的011 mol/ L 磷酸缓冲 (p H715) ,加入 NaCl 至终浓度11215二 硫 键 测 定0172 g 尿素 , 0105 mL取 015 ml 蛋 白 质 溶 液 , 加011 mol/ L ED TANa2 及 015mL 215 %NaB H4 溶液 ,用水定容至 115 mL ,然后加1 滴正辛醇 ,在 40 下变性及还原 5 h ,取出通氮50 柱 (115cm 15cm) 进行梯度洗脱 ,洗脱液为含1 mmol/ L ED TA 的 011110 mol/ L 乙酸钠溶液 , 流速为 015 ml/ min 。分部收集 ,检测酶活力并收集 有酶活力的洗脱液 ( 图 1) ,透析 ,冷冻干燥 ,4 冰 箱保存 。用该法制备的木瓜蛋白酶纯度最高 ,但成 本也高 。且得率较低 ,故主要用于科学试验及医疗 卫生 。10 % ,室温静置 30 min ,4 18 h 至结晶析出 ,冰冻干燥 ,4 冰箱保存 。用该法制备的木瓜蛋白酶纯 度高 ,适用于作为化妆品成分及部分医疗卫生产 品 。21113纯化酶制备 取上述冰冻干燥酶于室温下对 011 mol/ L 乙酸钠缓冲 (p H510) 渗析 10 h ,然后上 SP - Sep hadex表 1番木瓜果实乳汁中木瓜蛋白酶的纯化步骤Papain activit yYield/%Purificatio n/foldStepTotal/USpecific/U/ mgProtein/mg310 106111 106417 104215 104Fruit juiceCo ncent ratio nCrystallizatio nSP - Sep hadex 5025 0001 82732412010602101 468186 2501010010361711601851012125211Elutio n volume ( mL )图 1 木瓜蛋白酶的 SP - Sep hadex 50 柱层析212 木瓜蛋白酶的性质在 SDS 和 ED TA 存在下 ,用 D TNB 测定总自 由巯基 ,根据光吸收值推知 ,木瓜蛋白酶含有一个 自由巯基 。用 8 mol/ L 脲变性 , 再经 NaB H4 还原 , 用 D TNB 测定巯基含量 ,表明含有 7 个自由巯基 , 即该酶含有 3 个二硫键 。经过甲酸氧化 , 6 mol/ L HCl 水解 ,氨基酸自动分析仪测定 ,结果表明该酶 含有 7 个半胱氨酸 。这与前面的结果相符 。用蛋 白序列仪测定了木瓜蛋白酶 N - 末端氨基酸 ,结果 为 Ile 。用羧肽酶 A 方法测定了木瓜蛋白酶 C - 端6 个氨基酸序列 (图 2) ,其结果为 - Phe - Tyr - Pro- Val - L ys - Asn - COO H 。Sep haro se 排 阻 层 析 结果表明该蛋白分子量为 24 kd , I EF 结果表明该 蛋白 p I 值为 8175 。动力学曲线表明 ( 图 3) ,木瓜 蛋白酶的底物反应符合 Michaelis - Menten 方程 ,Time ( h)图 2 木瓜蛋白酶 C - 末端氨基酸残基的释放进程其 Km 值为 20 mmol/ L 。 圆二色谱可以了解蛋白质的空间结构 。远紫外圆二色谱反映蛋白的二级结构 ,近紫外圆二色谱 反映蛋白质芳香族残基的不对称环境 。图 4 是木 瓜蛋白酶的圆二色谱 。由图可知 ,在 185186 nm 处有最大正值 ,在 200 nm 周围出现的负信号表现 为肩峰或小峰 , 在 208 nm 处出现最大负值 。这些 特征与其它巯基蛋白酶具有相似之处10 。此外 ,当木瓜蛋白酶中加入 Cys 后 ,在远紫外区域的圆二 色谱发生了较大变化 。推测在正常情况下 ,木瓜蛋 白酶的一些活性基团隐藏在分子内部 ,使之成为激 活状态 ,而 Cys 的加入使之暴露于分子外部 ,成为 激活状态 ,显现酶的活性 。根据 Co mp to n 等11 的方法 ,可得到木瓜蛋白 酶二级结构的含量 (表 2) 。由表可知 ,其二级结构主要以- 螺旋为主 ,反平行- 折叠也比平行2折叠多 。S ( mmol/ L )图 3 木瓜蛋白酶的 Lineweaver - Bur k 动力学曲线WAV EL EN GT H( nm)图 4 木瓜蛋白酶的圆二色谱激活态非激活态表 2 木瓜蛋白酶的结构- 螺旋反平行- 折叠平行- 折叠转折其它总值 0124 01005 0 . 10 0 . 011 0 . 03 0 . 013 0 . 14 0 . 015 0 . 30 0 . 024 1 . 01 7黄文 ,胡慰望 ,谢笔钧. 脱脂花生蛋白酶解产物的焙烤香味研究 木瓜蛋白酶水解作用的影响 J . 食品科 学 , 1996 ,17 (12) :18 - 20 .乙引 ,谭爱娟 ,刘宁 ,王利民 . 木瓜蛋白酶的生产工艺研 究 J . 贵州农业科学 ,2000 ,28 (5) :24 - 25 .Malt house J P G and Brocklehurst K. 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