黄酮标准曲线绘制的实验报告

黄酮标准曲线绘制的实验报告1. 总黄酮的测定1.1 实验仪器电子天平 ar2140;紫外可见分光光度计uv2754;型数控超声波清洗器kq3200db;超级恒温槽 ;rotavapor r200旋转蒸发仪; fd21c250冷冻干燥机 21.2 试剂及药品芦丁标准品硝酸铝国产分析纯（配成5 % ） 亚硝酸钠国产分析纯（配成10 % ）氢氧化钠国产分析纯配成（配成1mol/l ）95% 乙醇，无水乙醇国产分析纯（配成60% 乙醇50% 乙 醇 ） dpph （ 2， 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基） vc（ascrobic acid ，维生素c，抗坏血酸）没食子酸对照品：基准纯。大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔1.3 实验步骤：1.3.1 准备工作及波长的确定样品 60烘干粉碎机粉碎， 过 20 目筛， 装入试剂瓶中备用。 根据查阅文献精品资料总黄酮在波长为510nm 处吸收值最大。1.3.2 参照品芦丁标准溶液的制备精密称取 120 干燥至恒重的芦丁标准样品 37.5mg 置于 100ml 烧杯中, 用 60% 乙醇溶解后定容至 25ml 容量瓶中 ,摇匀，即可得 1.5mg/ml 的芦丁标准溶液。1.3.3 标准品的测量及绘制标准曲线精密吸取芦丁标准溶液 0.0 、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0、6.0ml ,分别置于10ml 容量瓶中，并定容至刻度线。得到 0.0mg/ml 、0.15mg/ml 、0.3mg/ml 、0.45mg/ml 、0.6mg/ml 、0.75mg/ml 、0.9mg/ml 的标准品溶液，分别取 1ml 到试管中各加 5 %亚硝酸钠溶液 0.3ml 摇匀,放置 6min ,加 10% 硝酸铝溶液 0.3ml 摇匀,放置 6min , 加 1mol /l 氢氧化钠溶液 4ml , 再用 60% 乙醇溶液稀释至刻度 , 放置 15min 后,分别在 510nm 处测定其吸光度（ tai,cai&dai,2011 ）。（以试剂空白做参比）以吸光度 a为纵坐标 ,浓度 c 为横坐标 ,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得 c 与 a 的线性回归方程以及相关系数r2。序号浓度（ ug/ml ）吸光度1002150.1803300.3494450.5465600.7276750.884精品资料7901.063表 1-1 ：芦丁标准曲线测定数据图 1-2 ：芦丁标准曲线1.3.5 样品的测试根据查阅文献总黄酮在波长为510nm 处吸收值最大。 取黄酮提取液，取提液 2ml 至 10ml 的比色管中用60% 的乙醇定容至刻度线则稀释5 倍。取稀释好的溶液 4 份 1ml 置入 10ml 的比色管中， 其中一份用60% 的乙醇定容， 作为参比溶液。其余各份各加5% 亚硝酸钠溶液0.3ml摇匀,放置 6min , 加 10% 硝酸铝溶液0.3ml摇匀,放置 6min , 加 1mol氢氧化钠溶液4ml , 再用 60% 乙醇溶液稀释至刻度,放置 15min 后,分别在 510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可 得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含 量。样品总黄酮含量 (mg/g)=x*n*v 1 /( v *w)式中： x测出的浓度， mg/ ml; （直接代入，不用换算。 ）n稀释倍数，量纲为1; vi样液总体积， ml;v测定时取样体积，ml; w样品质量， g。2. 总分含量的测定2.1 实验仪器alzo4 型电子分析天平 :上海梅特勒一托利多仪器有限公司; dela 犯 o 型 ph 计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; 723 可见分光光度计 :上海菩华科技仪器有限公司;dk 一 512 型电热恒温水浴锅 :上海森信实验仪器有限公司;容量瓶 (250ml ，10oml ， 25ml) 、比色管管 (10ml);烧杯、移液管、吸耳球。2.2 试剂及药品没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50 真空干燥箱真空中干燥 4 h。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。2.3 folin ciocalteu 比色法测定总酚酸含量3.3.1 folin ciocalteu 试剂的配制称取20 g钨酸钠和 5 g钼酸钠于圆底烧瓶中， 用140 ml 蒸馏水溶解，加入10ml 85 的磷酸溶液和 20 ml 浓盐酸，文火回流10 h ，然后加入 3 g硫酸锂及 15 ml 双氧水，加热沸腾 15 min 至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入250 ml 容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4冰箱保存。2.3.2 对照品溶液制备准确称取 15 00 mg 干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至 50ml ，制成 0.3mg/ml 没食子酸的溶液，作为对照品溶液。精品资料将0.3mg/ml 的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/ml ， 0.03mg/ml ， 0.06mg/ml ，0.09mg/ml ，0.12mg/ml ，0.15mg/ml 、 0.18mg/ml 、 0.21mg/ml 的溶液，分别取 1ml 置于10ml 的容量瓶中，加入 2 ml 福林试剂，充分摇匀，加入0 75ml 7.5 碳酸钠溶液混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h(guo&wei,2011)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同 时制作不加显色剂的对照管。于765 nm 波长处测定吸光度值。2.3.3 标准曲线的制备序号浓度吸光度0（ ug/ml ）0（wl765.0 ）0130.132260.284390.4114120.5825150.7126180.8437211.013以吸光度 a为纵坐标 ,浓度 c 为横坐标 ,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得 c 与 a 的线性回归方程以及相关系数r2。表 3-1 ：没食子酸标准曲线测定数据精品资料图 3-1 ：没食子酸标准曲线2.3.4 样品的测定取提液 2ml 至 10ml 的比色管中用60% 的乙醇定容至刻度线则稀释5 倍。取稀释后溶液1ml 四份,分别置于 10ml 比色管中，加入2 ml 福林试剂，充分摇匀，加入 075ml 7.5 碳酸钠溶液混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下， 静置2h。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm 波长处测定吸光度值。总酚酸含量计算：多酚含量（ mg/100g ）=x(mg)稀释倍数1000.5总酚酸称样量（g）3. 清除dpph 的能力的测定3.1. 实验仪器、药品及试剂2.1.1实验仪器alzo4 型电子分析天平 :上海梅特勒一托利多仪器有限公司; dela 犯 o 型 ph 计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; 723 可见分光光度计 :上海菩华科技仪器有限公司;dk 一 512 型电热恒温水浴锅 :上海森信实验仪器有限公司;容量瓶 (250ml ，10oml ， 25ml) 、比色管 (10ml);精品资料烧杯、移液管、吸耳球。3.1.2 试剂及药品dpph （ 2， 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基） ；vc（ascrobic acid ，维生素c，抗坏血酸）为分析纯； 无水乙醇，蒸馏水3.2.1 配 制 dpph 溶 液配制 0.06mmdpph试剂，放入冰箱4进行冷藏，以备用。3.2.2 参照品 vc 标准溶液的制备准确称取 17.6mgvc到 100ml 的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50ml 的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/l的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.2mmol/l 、0.4mmol/l 、0.6mmol/l 、0.8mmol/l 、1mmol/l 、1.2mmol/l 的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的dpph ，反应30min, 在517nm 测出吸光值 (thoo&ho,2010) ，用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。清除率=(ac-ai)/ac 100%式中， ac： 0.1 ml无水乙醇加3.9ml dpph溶液的吸光度；ai：0.1 ml待测液加3.9mldpph溶液的吸光度。3.2.3 标准曲线的绘制精品资料3.2.2 测试数据及标准曲线的绘制序号c（mmol/l ）吸光度清除率/%00010.20.52914.9220.40.42430.9030.60.3246.7340.80.20963.62510.1178.6961.20.0292.39表 3-1 ：vc 标准曲线测定数据以吸光度 a为纵坐标 ,浓度 c 为横坐标 ,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得 c 与 a 的线性回归方程以及相关系数r2。图 3-1 ： vc 含量与吸光度的关系精品资料图 3-1 ：vc 含量与清除率的关系3.2.4 样品的测定取提液 4ml 至 10ml 的比色管中用60% 的乙醇定容至刻度线则稀释2.5 倍。取稀释后溶液0.1ml 三份,分别置于 10ml试管中，再分别加入配置好的dpph 溶液 3.9ml, 摇匀，反应 30min 后，分别在 517nm 处测定其吸光度。 代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以vc 为参比） ,三次结果取平均值。经换算后得样品自由基清除率。4. 清除 abts +自由基能力的测定4.1abts +自由基的配制准确称取0.19215gabts于 50ml 的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀， 浓度 7mmol/l ；7mmol/labts +.与 2.45mmol/l的高硫酸钾等体积混合， 在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应1216h ，形成abts +自由基储备液。该储备液在室温，避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm 处测得其吸光度为0.7000 （0.02 ），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4进行冷藏，以备用。4.2 标准曲线的绘制4.2.1 参照品 vc 标准溶液的制备及测试准确称取 8.8.mgvc 到 100ml 的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于 50ml 的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到 1mmol/l 的母液，分别量 1、2、3、4、5、6、7、8ml 至 10ml 的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到 0.1mmol/l 、0.2mmol/l 、0.3mmol/l 、0.4mmol/l 、0.5mmol/l 、0.6mmol/l 、0.7mmol/l 、0.8mmol/l的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml 溶液置于试管中再加入 3.9ml 的 dpph ，反应 30min, 在 517nm 测出吸光值，用无水乙醇代替待测液作为对照 (zhu&lian,2011) ，用无水乙醇作空白，重复三组。清除率=(ac-ai)/ac 100%式中， ac： 0.1 ml无水乙醇加3.9ml abts + 自由基溶液的吸光度；ai：0.1 ml待测液加3.9mlabts + 自由基溶液的吸光度。4.2.2 测试数据及标准曲线的绘制c序号（mmol/l ）吸光度清除率/%100.0020.10.5712.04精品资料30.20.49323.9240.30.42234.8850.40.35145.8360.50.27657.4170.60.269.1480.70.11881.7990.80.03594.60表 4-1 ：vc 浓度与吸光值和清除率的数据图 4-1vc 浓度与其吸光值的关系精品资料图 4-2 ：vc 浓度与其清除abts 能力的关系5. 还原能力的测定5.1 实验试剂磷酸盐缓冲溶液（配成ph6.6 0.2mol/l）; k3fe(cn) 6 溶液（配成1% ）;三氯乙酸（配成10% ）； fecl 3（配成 0.1% ）； 没食子酸无水乙醇5.2 标准曲线的绘制5.2.1 试剂的配制磷酸盐缓冲溶液 (ph6.6 0.2mol/l) ：准确称取 7.16g 的磷酸氢二钠至100ml 的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100ml的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/l的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/l的磷酸二氢钠。准确量取37.5ml 的 0.2mol/l 磷酸氢二钠溶液和62.5ml 的 0.2mol/l 磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用 ph 校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(ph6.6 0.2mol/l) 。5.2.2 标准溶液的配制及测试用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50 300ug/ml ，准确称取50mg 没 食子酸到 100ml 烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到 0.5mg/ml的母液，在分别取1ml 、2ml 、3ml 、4ml 、5ml 、6ml 至10ml 的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得 到 50ug/ml 、100ug/ml 、150ug/ml 、200ug/ml 、250ug/ml 、300ug/ml 的溶液，取不同浓度的待测液或样品1ml 于 试管中，依次加入ph6.6 磷酸盐缓冲溶液（ 0.2mol/l ）2.5ml 和 1% k3fe(cn)6溶液 2.5ml 后混合均匀，混合液于 50 水浴 20min, 再加入 10% 的三氯乙酸2.5ml 。于（ 3000r/min ）离心 10min, 取 2.5ml 的上清液再依次加2.5ml 蒸馏水和0.1% 的 fecl3 0.5ml混合均匀， 静置 10min 在 700nm 处测定吸光值， 通过在 700nm 下的吸收值来测量提取物的还原能力，吸光值越高表明还原力越强，ec 50 的计算是吸光值为0.5 时的浓度（ roy&laskar,2011）。5.2.3 测试数据及标准曲线的绘制精品资料test setgallic acidconcentration ug/mlabsorbency1002500.5931001.141501.52752002.07362502.57973003.1表 5-1 ：没食子酸的质量浓度和吸光值的数据图 5-1 ：没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系精品资料6. 超氧自由自测定6.1 实验试剂1 实验试剂tris-hcl 缓冲液（配制ph8.20 50mmol/l） 邻苯三酚 (配制 3mmol/l)vc无水乙醇精品资料6.2 标准曲线的绘制6.2.1 试剂的配制tris-hcl （ ph8.250mmol/l ）缓冲溶液：取0.6057g三羟甲基氨基甲烷（ tris），蒸馏水溶解定容至50ml 容量瓶；取 0.309ml 分析纯盐酸溶液至100ml的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得0.1mol/l盐酸溶液；分别取配置好的tris50ml和 0.1mol/l盐酸溶液22.9ml于 100ml 容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，用 ph 计进行校正即可以得到tris-hcl（ ph8.2 50mmol/l ）缓冲溶液。邻苯三酚：配制10mmol/l的稀盐酸，取0.310ml 分析纯盐酸溶液至1000ml的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；取焦性没食子酸0.0095g ，至 25ml 的容量瓶中用 10mmol/l的稀盐酸溶液定容至刻度线。6.2.2 标准溶液的配置及测试精密称取 vc 标准样品 0.0300g 置于 100ml 烧杯中,用纯净水溶解后定容至100ml容量瓶中 ,即可得 0.3mg/ml的 vc 标准溶液。将 0.3mg/ml 的 vc 标准溶液分