LC-MS定性定量方法与技术

LC MS定性定量方法与技术 盛龙生中国药科大学南京210009E mail shenglsh LC MS定性定量方法与技术 1 LC MS的基本数据与信息 2 LC MS定性分析技术 3 LC MS定量分析技术 本讲内容 LC MS的基本数据与信息 LC MS的基本数据与信息基于 MS质谱峰的m z和强度LC色谱峰的保留数据与面积 LC MS定性定量分析数据 定性数据TIC 或BPC EIC等 色谱峰的保留时间 tR 质谱及m z测定数据化合物或离子的分子量 实验式 不饱和度质谱峰的同位素丰度比MSn CID 结构信息 氮规律 定量数据质谱峰強度 色谱峰的面积 TIC BPC LC MS提供的信息 磺胺类药物的LC MS TIC EICm z311 0805 磺胺类药物的MS MS specifictosulfadimethoxine commontoallsulfonamides 4GHz Resolution12184 m z156 0773 m z156 0119 磺胺类药物的MS MS 平均分子量 averagemolecularmass 由分子中各元素的 相对 平均原子量计算所得 a AtomicWeightsoftheElements1987 PureAppl Chem 1988 60 841括号内的数值为测不准水平 主要是同位素丰度的自然变化 例如 氢原子量为1 00794 0 00007 分子量信息 分子量信息 单同位素分子量 monoisotopicmolecularmass 由分子中各元素中丰度最高 最轻 的同位素的 相对 原子量计算所得 高分辨质谱和元素组成 如果离子质量测定的准确度足够高 则可以得到该离子确定的元素组成 对于未知物分析 这个方法非常重要 常常称为 高分辨质谱 其实 仪器的分辨率和质量测定的准确度显然是两个不同的概念 但是 通常 质谱的准确质量测定是以高分辨率为前提的 如果仪器的分辨率不高 不能分离名义质量 整数质量 相同而准确质量稍有差别的离子 则质谱测定的是由不同离子重叠而成的质谱峰的质量 因为每个元素均有特定的准确质量 因此 如能准确测定离子或分子的质量 就可以计算其元素组成 例如C13H24和C12H22N的质量分别为180 1753和180 1879u 相差0 0126u 为了分离这两个化合物 仪器的分辨率m m应为14300 为了区分他们 质量测定应准确到小数点后4位有效数字 但是 随着待测物质质量的增加 由各种元素组合成该质量的可能性迅速增加 而且其中某些组合的质量的差别可能很小 因此 对仪器的分辨率及质量测定的准确度的要求更高 高分辨质谱和元素组成 用质谱仪的应用程序 根据仪器测定的质量及离子或分子中可能存在的元素 可计算出在一定测定误差范围内分子或离子的各种可能的元素组成 即实验式 用准确质量计算元素组成时 不能忽略电子的质量 质量测定的误差越小 可能的元素组成越少 确定待测物质的实验式或元素组成时 应考虑质谱法及其他理化方法提供的各种信息 高分辨质谱法也提高了目标化合物筛选和定量测定的选择性 同位素丰度 绝大多数元素在自然界以同位素混合物存在 如天然的碳是98 90 的12C和1 10 的13C的混合物 由于元素的同位素的存在 所以质谱峰呈现为同位素峰簇 是各种元素及其同位素组成的表现 他们提供了另一重要性息 在质量测定的准确度有限时 根据同位素丰度数据有可能限定元素组成 例如 C10H20和C8H12O2的名义质量均为140u 而其在m z141处的同位素峰相对于m z140峰的强度分别为11 和8 8 这是由13C存在的机率所确定的 因而可区分这两个离子 应该注意低丰度同位素峰的测定误差较大 还可能有其他成分的离子与之重叠 所以实际应用有一定限制 不饱和度 如果分子或碎片的元素组成己知 可计算其不饱和度 包括环 双健和叁键 故又称双键相等数 doublebondequivalents DBE 设分子式的通式为CxHyNzOn 则 DBE x 1 2y 1 2z 1卤素等取代一个H的元素计作H S计作O P计作N Si计作C 在质谱法中 此式只适用于分子离子M 偶电子离子 如CH3 比CH4少1个氢 故导致DBE出现半整数 同理 由M H 计算所得的中性分子M的DBE应加0 5 M H 计算得到的M的DBE应减去0 5 氮规律 奇电子离子 偶电子离子 氮规律指出 含偶数氮原子或不含氮原子的分子其分子量为偶数 这是因为氮的质量是偶数 14 而价态为奇数 而其他元素的质量和价态要么均为偶数 要么均为奇数 在质谱中氮规律指出 不含氮或含偶数氮原子的任何离子 如为奇数电子 游离基阳离子或游离基阴离子 其质量应为偶数 反之 若为偶电子离子 阳离子或阴离子 其质量应为奇数 含奇数氮的离子 如为奇电子离子 其质量应为奇数 如为偶电子离子 其质量应为偶数 质谱解析 质谱裂解主要为由游离基驱动 奇电子离子 的 裂解和由电荷驱动 偶电子离子或奇电子离子 的诱导裂解 i裂解 引起的两种基本途径 软离子化技术 如ESI等 主要生成准分子离子 如M H M Na M H M Cl 等 这些离子均为偶电子离子 在所得的质谱中 准分子离子常常是主峰 没有或较少碎片峰 因而缺乏结构信息 为了获得结构信息 主要采用两种技术 即MS CID MS 或MSn 及源内碰撞诱导解离 insourceCID 偶电子离子优势裂解反应为丢失一个小的中性分子并生成另一偶电子离子 质谱解析的经典著作是McLafferty的 InterpretationofMassSpectra 另外 也有商品化的解析软件 MassFrontier 等 单键裂解伴随电荷的迁移CH3 CH2 OH2 CH3 CH2 H2O键的裂解伴随环化及电荷的迁移 环状离子断裂两个键 电荷保留 基本的偶电子离子裂解反应 1 两个键的断裂 伴随着重排 基本的偶电子离子裂解反应 2 如烷链较长 通过六元环的 位氢重排为优势过程 这是发生在偶电子离子上的McLafferty重排 基本的偶电子离子裂解反应 3 肽产生的离子的命名 磷酸二酯键的4种可能的裂解产生8种离子 含5 OH的离子称an bn cn和dn而含3 OH的离子称wn xn yn和zn 下标n指示其裂解位置 碱基的进一步丢失用括号表示 如a3 B3 A 表示键的开裂发生在3位的磷酸二酯基的核糖碳原子和氧原子之间并在同一位置进一步丢失了腺苷碱基 寡核苷酸产生的离子的命名 为了解释互补离子an Bn和wn的形成 提出了几种裂解途径 例如 上述裂解途径中首先通过1 2消除丢失碱基 这一消除可能是由于分子间的碱催化产生的 3 磷酸酯基的带负电的氧原子 然后 由这一中间体通过磷酸二酯基的3 C O键的开裂产生an Bn和wn碎片 裂解途径 电荷保留在非还原端的碎片称A B C 而电荷保留在还原端的碎片称X Y Z 寡糖产生的离子的命名 形成B Y的机制 形成A X的机制 黄酮苷产生的离子的命名 化合物鉴定 用LC MS鉴定化合物通常分两个步骤 在样品中发现化合物 采集产物离子谱鉴定化合物在复杂样品中鉴定化合物 有一定挑战性 低浓度的化合物常被基质抑制或掩盖 化合物鉴定 基于四极仪器的方法技术 如前所述 目前用得最多的还是基于四极原理的质谱仪 如QMS TSQMS QTrap ITMS 这些仪器为扫描仪器 此处 主要讨论MS MS的方法 用LC MS鉴定化合物鉴定时 以质谱全扫描作为搜索扫描 触发MS MS扫描 在总离子流或基峰离子流中发现化合物 用产物离子谱进行结构鉴定 分析同类化合物中的未知物时 可用已知的裂解途径 进行母离子扫描 PI 或中性丢失扫描 NL 以发现未知物 然后采集产物离子谱进行结构鉴定 BuspironeC21H31N5O2MW 385 M H M Na ESI MS全扫描图 Buspirone Buspirone产物离子谱 M H 磺胺类药物的 母离子扫描 Q3固定在m z122 Q3 前体离子扫描 寻找代谢物 中性丢失扫描 中性丢失扫描 Q1 Q3质量差为121Da 寻找代谢物 寻找代谢物 化合物鉴定 基于高分辨仪器的技术 在化合物鉴定中 高分辨质谱仪 如Q TOFMS等应用日益广泛 TOFMS为典型的非扫描仪器 记录输入的离子的全部信号 釆样速率和全谱灵敏度高 采集的数据可用各种后处理技术 取得有关信息 对于已知化合物 用高分辨质谱 可直接在MS和MS MS谱中提取目标离子 用产物离子谱进行结构确认 进行未知物分析时 可直接在MS和MS MS数据中 用各种数据质处理技术 如EIC MDF IPF PIF NLF BGS MFE PCA等 发现和鉴定未知化合物 此处 以代谢物自动分析为例 说明有关技术 分子信息提取 MolecularFeatureExtract 分子信息 molecularfeature 指在LC MS分析中由保留时间 质量及其响应所确定的分子实体 分子信息提取 molecularfeatureextract MFE 质谱数据处理方法 在全扫描质谱原始数据中 排除干扰 降低数据的复杂性 由此产生的化学上合理的分子信息列表 Treatsdataasathreedimensionalarrayofretentiontime m z andabundance Removespersistentandslowlychangingbackground Searchesforfeatureswithacommonelutionprofile masseselutingatnearlythesametime Massesgroupedinto compounds Co elutinginterferencesareresolved Isotopicclusterrecognizedandgrouped Chargestateassignmentsandmolecularadductsarerecognized 2D 3DDatavisualization Chemicalidentification ppm isotopematching Featurelistsstorableinspace efficientbinaryformat andsavedastextfiles 分子信息列表用于数据库检索和 或分子式计算 以及统计分析 MetaboliteIDsoftware鉴定代谢物 分子特征提取技术 MFE MetlinmetabolitepersonaldatabaseForover23000endogenousandexogenousmetabolites http metlin scripps edu MetablitesIdentification 3DPlotBefore MFE AutomatedDataReductionSoftware OriginalTIC ProcessedTIC 3DPlotNoBackground DataReducedsumintensitiesofisotopes adducts clustersandmultiplychargesionstogether FindsFeaturesinTOF QTOFData CoelutingFeatures Computed assistedIdentificationmetabolitesofNefazodone 预测Nefazodone的phaseI和phaseII代谢产物及其massshift Massshift Metaboliteresults expectedandunexpectedmetabolites Expectedresults Unexpectedresults Rt9 2min Nefazodonehydroxylationmetabolite ParentdrugMS MS MetaboliteMS MS Rt9 2min Nefazodonehydroxylationmetabolite FragmentoverviewofNefandmetbolites Parentdrug Mass to charge m z Retentiontime UsingFragmentoverviewtofindpotentialmetabolites 代谢物与母药相同的碎片离子 具有和PIscan相同的功能 Parentdrug metabolite ProposedMetabolicpathwayofNefazodone 统计分析和化学计量学数据分析 Massprofiler两组数据间的差异比较T testMassprofilerprofessional多组数据间的差异比较PCA PLSA ANOVA MassProfilerSoftware鉴定代谢物 AllDataRT Mass What sChanged Mass RT 2FoldChange What sUnique MetaboliteControl DifferentanalysisusingMP 化合物SP的胆汁代谢物的鉴定 利用MP进行差异分析 红色的点代表代谢样品中独有的feature 蓝色的点代表control样品中独有的feature UsingMetlinpersonaldatebaseIDmetabolitesofSP 将MP分析中得到的代谢物样品独有的features 带入自建的Metlindatabase 进行所搜 即可得到可能存在的代谢物 LC MS定量分析 LC MS数据采集常用以下形式 总离子流 totalioncurrent TIC 选择离子监测 selectedionmonitoring SIM 选择反应监测 selectedreactionmonitoring SRM 如用扫描仪器 如四极质谱仪 TIC的灵敏度较低 所以定量分析通常采用SIM或SRM 但是 为了鉴定化合物 TIC是必需 此时 仪器在一定m z范围和时间内 采集每次扫描所得质谱中的各个离子的信号加和得到总离子强度 对扫描数或时间作图 即得TIC 在TIC上的每一点均可显示一张质谱图 也可用提取离子流 extractedioncurrent EIC 进行定量分析 即从TIC中提取待测离子的离子流 质谱定量数据 选择离子监测 在SIM方式中 与TIC不同之处在于不是采集完整的质谱 而是不断记录选定的一个或几个离子的信号 选择的离子越少 灵敏度越高 而专属性则相反 单离子监测的灵敏度最高 在实践中 如果准分子离子 或分子离子 的信号最强 则SIM通常记录这些离子的信号 否则 记录其他强质谱峰的离子流 选择的离子应处于质谱的高质量端 以提高含量测定的专属性 提高专属性的另一种方法是使用高分辨质谱仪 选择反应监测 SRM是一种串联质谱技术 在定量分析应用中 常用串联四极质谱仪 QqQ 如SIM受到样品中其他化合物或基质背景干扰时 可采用SRM方法 在SRM中 前级质量分析器选择一前体离子 通常为准分子离子或分子离子 该离子用CID等方法使之裂解 然后 用后级质量分析器选择一产物离子 通常为位于高质量端的特征离子 记录其离子流 与SIM比较 SRM显然有较高的选择性 排除了本底干扰 化学噪声 因而有较高的信噪比 如果前体离子的裂解反应不止一个或选择多个前体离子及产物离子 则称为多反应监测 multiplereactionmonitoring MRM 质谱定量方法和内标 和其他定量分析方法一样 质谱定量分析可采用外标法和内标法 由于内标法可减少仪器等一系列的误差 故最为常用 内标物的理化性质应尽可能与待测成分一致 有较高的纯度 不含待测成分 对样品是惰性的 内标物通常为化学结构类似物 包括稳定同位素标记物 同系物和同类化合物 内标物应在实验开始时即加入样品中 这样可减少样品预处理 导入仪器及离子源条件变动等一系列误差 内标物产生的离子的m z值应与待测物质产生的离子的m z值不同 这样 即使内标物与待测物质不能分离 通过监测不同m z的离子流可以准确定量 相反 如内标物产生的离子的m z与待测物质产生的离子相同 只要色谱法能够分离内标和待测物 同样能够进行定量分析 四极质谱法飞行时间质谱法1用SIM SRM等方法采用提取离子流 EIC 2随着选择监测的离子种类提取多种离子检测灵敏度的增加 检测灵敏度下降不受影响3为提高专属性 需同时记提供待测成分的全谱 准录 定性离子 确质量 实验式 不饱和度 同位素丰度比等信息4低分辨 对tR和m z相近的高分辨 可定量测定名义离子难以定量质量相同而准确质量不同的离子 四极质谱法与飞行时间质谱法定量分析的比较 BuspironeC21H31N5O2MW 385 M H M Na ESI MS全扫描图 Buspirone Buspirone子离子谱 M H 磺胺类药物的 LC ESI MS MS SRMMode10pg mLBuspirone Spiperone HaloperidolinBovinePlasma100fgoncolumnBallisticGradientMethod 1mL min nosplit Totalacquisitiontime 1 6min MRM定量 基于准确质量EIC的药物动力学研究 三七总皂苷注射液特征成分的体内代谢 10ng mlnotoginsenosideR1 EICm z967 531 967 532 MSspectrumofnotoginsenosideR1 EICm z967 0 968 0 三七总皂苷注射液特征成分的体内代谢 基于准确质量EIC的药物动力学研究 线性范围 血药浓度10ng mL 5ug mL线性 R 0 9998 三七注射液活性成分的血药浓度测定 R1 三七注射液主要成分药物动力学曲线 三七注射液14个成分药物动力学曲线 克服ESI响应非均一性的一些技术 低流动相流速LC MS Captivesprayionization CSI Nanosprayionization CSI Alowflowionizationtechniquetointegratequantitativeandqualitativesmallmoleculebioanalysis RaguRamanathan InternationalJournalofMassSpectrometryxxx 2010 xxx xxx CSIallowstheuseofconventionalHPLCoruHPLCcolumnsandflowratesof0 35 0 6mL min beforepostcolumnflowsplitting andcanbeconsideredasatechniquewhichcanfunctionasananosprayormicrospray Also incomparisontoconventionalnanosprayionization NSI techniques setupandmaintenanceofCSIdonotrequire 1 X Y andZpositioningorcamerastoguidethespraypositioning 2 difficulttocontrolsplitterstodelivernano flowratiosanddifficulttomaintainnanospraynozzles EvaluationsusingequimolarmixtureofbuspironeandfourmonoxymetabolitespresentinhumanplasmashowthatLC CSI MSisahighlysensitivetechniquethatgivesanearequimolarresponseforthecompoundsusedinthisexample ComparisonsofLC ESI MSdatawiththatobta