DB21∕T 2049-2012 动物尿液中9种β-受体激动剂检测 液相色谱-串联质谱法.doc

ICS65.120B46备案号：DB21辽宁省地方标准DB 21/ XXXXXXXXX动物尿液中9种-受体激动剂检测 动物尿液中9种-受体激动剂检测液相色谱-串联质谱法Determination of -receptor agonists in animal urineLiquid chromatography-tandem mass spectrometry点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/ XXXXXXXXX前言本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。本标准主要起草人：王丽娜 刘凯 刘笑 陈玉艳 李延山 杜柏林 田晓玲 郝利忠 张明 刘敬先 徐丽佳 苗翠 李楠 杨希国 张秀琴 刘颖 马帅9动物尿液中9种-受体激动剂检测 液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了动物尿液中苯乙醇胺A、沙丁胺醇、特布他林、莱克多巴胺、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、西布特罗、喷布特罗9种-受体激动剂的原理、试样保存、试样制备、试剂材料、仪器设备、操作方法、测定方法。本标准适用于动物尿液中苯乙醇胺A、沙丁胺醇、特布他林、莱克多巴胺、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、西布特罗、喷布特罗9种-受体激动剂残留检测；本标准为确证方法，方法检测限为0.1g/L，方法定量限为0.2g/L。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法。3 原理样品经酶解后，加入高氯酸沉淀蛋白，离心后用固相萃取小柱净化，洗脱浓缩后用含0.2%甲酸水溶液溶解，供液相色谱-串联质谱仪进行检测，内标法定量。4 试样保存-20 以下贮存。5 试样制备样品使用前放至室温，如有浑浊，离心后取上清液备用。6 试剂和材料除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。水应符合GB/T 6682一级水的规定。6.1 甲醇：色谱纯6.2 0.2mol/L乙酸铵溶液（pH5.2）：称取乙酸铵15.4g至1L水中，调PH至5.2。6.3 氨水。6.4 高氯酸。6.5 0.2%甲酸水溶液：取甲酸1mL，用水定容至500mL。6.6 5%氨水甲醇溶液：取氨水5mL与95mL甲醇混合。6.7 苯乙醇胺A、沙丁胺醇、特布他林、莱克多巴胺、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、西布特罗、喷布特罗对照品纯度95.0%。6.8 -受体激动剂储备液的配制：分别精密称取9种-受体激动剂，用甲醇配成浓度各约1mg/mL标准储备液，2-8冷藏保存，有效期1个月。6.9 混合对照工作液：分别吸取9种-受体激动剂储备液，置于一棕色容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液稀释成浓度为1g/mL对照品工作液，2-8冷藏保存，有效期1个月。6.10 同位素内标：克伦特罗-D9、沙丁胺醇D、莱克多巴胺D、,苯乙醇胺D，纯度95.0%。6.11 同位素内标储备液：分别取四种同位素内标，用甲醇配成浓度约为10mg/mL。6.12 同位素内标工作液：分别取四种同位素内标储备液，用0.2%甲酸水溶液稀释成浓度为40g/L 对照品工作液，2-8冷藏保存，有效期1个月。6.13 固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱，3mL/60mg，或其他类似性能小柱。6.14 氮气：纯度99.9%。7 仪器和设备7.1 液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾电离源）。7.2 涡旋混合器。7.3 离心机：转速大于7000r/min。7.4 微量移液器： 100 L。7.5 旋转蒸发仪。7.6 天平：感量0.0001g。7.7 滤膜：0.22m，水系。8 操作方法8.1 提取取备用液（5）5.0 mL于50 mL离心管中，添加内标工作液100L ，充分混匀。加入40L-葡萄糖醛酸-芳基硫酸酯酶，15mLpH5.2醋酸铵缓冲溶液（6.1.2），37.0震荡水浴16h后，加入0.5mL高氯酸，涡旋混匀，10000r/min离心5min。8.2 净化固相萃取小柱用3mL甲醇，3mL水，3mL2%甲酸水溶液活化，备用液（8.1）过柱，3mL2%甲酸水溶液，3mL甲醇淋洗。空气抽干。5mL氨水甲醇溶液（6.6）洗脱。收集洗脱液，40氮气吹干后，1.0mL0.2%甲酸水溶液（6.5）溶解，经0.22m滤膜过滤后进样测定。8.3 测定8.3.1 液相色谱条件a) 色谱柱：C18100mm2.1mm，粒径1.7m。或其他效果等同的C18柱；b) 柱温：40；c) 进样量：10L；d) 流动相：A:甲醇；B：0.1%甲酸水溶液；e) 流速：0.3mL/min；f) 梯度洗脱：04.5min，5%A线性变化至70%，4.54.6min，70%A线性变化至100%A，4.67.5min维持100%A，7.57.6100%A线性变化至5%A，7.611.0min维持5%A。8.3.2 质谱条件a) 离子源：电喷雾离子源；b) 监测方式：多反应监测；c) 扫描方式：正离子扫描；d) 电离电压：3.2KV；e) 源温：120；f) 雾化气温度：350；g) 锥孔气流速：50L/h；h) 雾化气流速：650 L/h；药物定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表1表1 药物定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量药 物定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）锥孔电压（V）碰撞能量(V)特布他林226.07125.04226.07152.023026226.07152.023016西布特罗234.15160.03234.15160.032414234.15216.292410沙丁胺醇240.09148.02240.09148.022620240.09222.082610沙丁胺醇-D3243.12150.99243.12150.992620莱克多巴胺302.07107.03302.07164.053230302.07164.053216莱克多巴胺-D3305.12167.04305.12167.042816克伦特罗277.03202.97277.03202.973016277.03259.023010克伦特罗-D9286.08203.98286.08203.982616马布特罗311.03217.10311.03236.993025311.03236.993016溴布特罗366.90292.86366.90292.863018366.90348.963012苯乙醇胺A345.39150.08345.39150.082525345.39327.482512苯乙醇胺A-D3348.26153.09348.26153.092525喷布特罗292.38201.17292.38236.283520292.38236.2835168.3.3 定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中带测物质的保留时间与混合对照品工作液中对应的保留时间偏差在+2.5%之内，且样品图谱中各组分定性离子的相对离子丰度与接近的对照品工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对离子丰度502050102010允许最大偏差+20+25+30+508.3.4 定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合对照品工作液进样，以标准溶液中被测组分峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，对照品工作液中被测组分浓度为横坐标绘制工作曲线，用工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。苯乙醇胺A用苯乙醇胺A-D3内标定量、沙丁胺醇、特布他林用沙丁胺醇-D3内标定量、莱克多巴胺用莱克多巴胺-D3内标定量、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、西布特罗、喷布特罗用克伦特罗-D9内标定量。上述色谱和质谱条件下，苯乙醇胺A等9种-受体激动剂对照品的多反应监测（MRM）色谱图见附录A。8.3.5 平行试验按上述步骤，对同一样品进行平行试验测定。8.3.6 回收率试验8.3.6.1 本标准的工作范围为：0.5100g/L。8.3.6.2 阴性样品中添加对照品工作液，按样品制备步骤操作，测定后计算样品添加回收率。在0.2g/L20g/L浓度范围内的添加回收率为60100%。8.4 计算试样中每种-受体激动剂的含量以质量分数X计，数值以g/L表示，按式（1）计算：X=m1n(1)m式中：m1试样的色谱峰对应的某一种-受体激动剂的质量，单位g；n试样的稀释倍数；m试样的体积，单位L。8.4.1 重复性在同一实验室由同一操作人员完成的两个平行