多重耐药不鲍曼动杆菌研究进展 0515.doc

鲍曼不动杆菌耐药机制的研究进展 芮小红1 综述，赵文君2 校审(1. 2.南京医科大学附属无锡人民医院检验科，江苏无锡)【摘要】 近年来，随着临床上广谱抗菌药物的大量应用，出现了多重耐药菌株，并有逐年上升趋势，特别是多重耐药鲍曼不动杆菌的出现，给临床抗感染治疗提出了严峻的挑战。本文就近年来国内外鲍曼不动杆菌的耐药现状、耐药机制以及临床治疗研究进展等方面作一综述。【关键词】 鲍曼不动杆菌；耐药机制；临床治疗The advance of multidrug-resistant Acinetobacter baumanniiRUI Xiao-Hong1,ZHAO Wen-jun2.(1.2.Department of Clinical Laboratory， Wuxi Peoples Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi 214023，China)【Abstract】 In recent years, extensive use of broad-spectrum antimicrobial therapy in clinic has contributed to the emergence and yearly increase in the number of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii (MDRAB) strains,especially multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strains. It has become a challenge to antimicrobial therapyThe condition of multidrug- resistant Acinetobacter baumannii,resistance mechanism and clinical treatment strategies in domestic and foreign in recent years are reviewed in this paper.【Key words】 Acinetobacter baumannii； Drug-resistant mechanism； Clinical treatment 鲍曼不动杆菌是临床上常见的条件致病菌，广泛存在于自然界、医院环境及人体皮肤，主要引起医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性肺炎、尿路感染、伤口感染、菌血症和继发性脑膜炎等1。目前多重耐药鲍曼不动杆菌是指对以下五类抗菌药物至少三类耐药的菌株：头孢菌素类抗生素、碳青霉烯类抗生素、含有-内酰胺酶抑制剂的复合制剂、氟喹诺酮类抗菌药物、氨基糖苷类抗生素。在抗生素压力下多重耐药菌株逐年上升，给临床治疗造成了极大困难。1 耐药现状 目前，多重耐药鲍曼不动杆菌感染是医院内感染关注的焦点之一。据报道鲍曼不动杆菌的多重耐药株(MDRAB，至少耐受头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素和亚胺培南中三种药物者)分离比率在明显增加。在美国一项65个实验室，1998-2011年的监测中显示:ICU 住院患者MDRAB分离比率由27.6增至32.5,而ICU 则由11.6增至24.2,90以上的分离株对亚胺培南和美罗培南敏感2。在中国的一项10个不同地区教学医院医院内感染革兰阴性杆菌的调查发现：MDRAB分离率由2003年的33增至2004年的48,对碳青霉烯类的耐药率由2003年的4.5增至2004年的183。特别是自1991年美国报道出现碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB4,碳青霉烯类药物在医院抗菌治疗中的大量使用导致CRAB菌株感染在世界范围的出现和增加，据统计在美国占1.2、加拿大占0.9、亚太地区占1.6、欧洲占4.7、拉丁美洲占8.2。2004年中国北京、上海、浙江等地均报告出现泛耐药的鲍曼不动杆菌(pandrug-resistant Acinetobacter baumannii，PDRAB),并有蔓延的趋势5，已成为临床抗感染治疗中的难点和重点。2 耐药机制2. 1 -内酰胺类抗生素 鲍曼不动杆菌对-内酰胺类耐药机制有：(1)产生水解抗菌药物的酶，即-内酰胺酶(-lactamases)；(2)细胞膜上的膜蛋孔白缺陷；(3)细胞内膜上作用靶点青霉素结合蛋白(penicillinbindingproteins，PBP)结构或数量或两者皆有的改变；(4)外排泵功能增强，因-内酰胺类抗生素的作用靶位在内膜的周质空间里面，因此外排泵对其-内酰胺类药物耐药影响不，产-内酰胺酶是其耐药的主要机制。2.1.1 产-内酰胺酶导致的耐药 Ambler根据-内酰胺酶分子结构的不同将酶分为A、B、C、D四类。A类为丝氨酸蛋白酶，B类为金属伊内酰胺酶，C类为头孢菌素酶，D类为丝氨酸苯唑西林水解酶。其中B类、D类为具有水解碳青霉烯活性酶。 A类为超广谱-内酰胺酶,早期革兰阴性杆菌对-内酰胺类抗生素的主要耐药机制之一是产生了广谱-内酰胺酶，后来由于稳定性较好的新型广谱-内酰胺类抗生素的广泛使用，细菌在抗生素的选择压力下衍生了超广谱-内酰胺酶(extended-spectrum-beta-lactamases，ESBLs)，使细菌对青霉素、13代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青霉烯及酶抑制剂敏感。 ESBLs包括TEM、SHV起源ESBLs和非TEM、SHV起源ESBLs，前者主要是由广谱-内酰胺酶基因TEM-1-2和SHV-1经点突变而形成的，后者主要包括VEB-1、PER-1、CTX-M系列等。前者为经典的ESBLs，在鲍曼不动杆菌中比较常见，后者的报道也日益增多。已在鲍曼不动杆菌中检测到的经典ESBLs基因主要有：blaTEM-1、blaTEM-92、blaTEM-116、blaSHV-12等。 近些年来含有VEB-1型的耐药鲍曼不动杆菌在东南亚、法国广泛流行6。Jeong等7发现PER-1型ESBLs在韩国ICU中广泛流行，其在法国、比利时和阿根庭也有报道8。学者研究发现在blaPER-1上游有插入序列ISPal2，这可能与提高其表达相关。在鲍曼不动杆菌中发现的CTX-M主要为CTX-M-2型、CTX-M-43型ESBLs。 B类为金属-内酰胺酶(metallo-beta-lactamases，MBLs)，能水解所有的-内酰胺类抗生素，对酶抑制剂不敏感。但对乙二胺四乙酸敏感。在鲍曼不动杆菌中的MBLs，主要为IMP型、VIM型和SIM型，其中IMP和VIM型家族现已发现各有十几种亚型。 IMP型MBLs由日本学者9首次在铜绿假单胞菌中发现，现在世界范围不同地区均有报道。在耐药鲍曼不动杆菌中发现的blaIMP基因主要是blaIMP-1、blaIMP-2、blaIMP-4,引起亚胺培南耐药。IMP型MBLs产生的对碳青霉烯耐药现已成为韩国和太平洋岛国严峻的问题10,VIM-l首次被确认于1株铜绿假单胞菌中 11。韩国首次报道了产VIM-2型MBLs的不动杆菌12，最近又一种新型产MBLs鲍曼不动杆菌被报道13，即SIM-1。 C类-内酰胺酶简称AmpC酶，是由革兰阴性杆菌的染色体或质粒介导产生的一类-内酰胺酶。AmpC酶(CMY-1)于1989年在韩国首次被发现。Bou等14首次报道了鲍曼不动杆菌耐药株产生染色体AmpC酶并对其基因序列进行了分析。 鲍曼不动杆菌产染色体介导的非诱导型高产AmpC酶在其多重耐药以及对-内酰胺类抗生素的交叉耐药中有重要意义15，因有别于其他AmpC酶。Hujer等16将其命名为鲍曼不动杆菌所产的头孢菌素酶(aeinetobacter-derived cephalosporinases，ADC)-内酰胺酶。研究发现，ADC型AmpC酶基因在鲍曼不动杆菌中普遍存在，其存在上游插入序列ISAbal，可调节基因过度表达。 D类-内酰胺酶为OXA酶，它对苯唑西林水解活性很强。大部分0XA型-内酰胺酶可使碳青霉烯类抗菌药物失活。第1个OXA型碳青霉烯酶来自于苏格兰临床分离的鲍曼不动杆菌，为质粒编码，可以转移，起初被命名为ARI-I，现统称为OXA-2317。后来在分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)中相继报道了0XA-24、OXA-25、OXA-26、OXA-27、OXA-40、OXA-51、OXA-58、OXA-69等0XA酶的存在。 据报道，国内大约有80的CRAB是由于产生了0XA-23型碳青霉烯酶，其可能是鲍曼不动杆菌耐药的主要原因。国外流行的CRAB也主要是产生OXA-23型碳青霉烯酶。一项报道显示18新加坡总医院CRAB有9l携带blaOXA-23基因。Qi等19研究发现芝加哥某医院随着A型鲍曼不动杆菌在该院逐渐流行，对亚胺培南的耐药率也在逐年增高，基因检测与表型分析发现blaOXA-23和blaOXA-40基因与亚胺培南的耐药相关。希腊学者20报道了由blaOXA-58基因介导的CRAB流行。 研究发现OXA酶介导的细菌对碳青霉烯类耐药有赖于某些插入序列。Corvec等21在CRAB中发现blaOXA-23的上游含有ISAbal和ISAba4插入序列，这些插入序列可以增强blaOXA基因的表达。2.1.2 膜孔蛋白缺陷导致的耐药 外膜蛋白(outermembrane protein，OMP)形成可供小分子转运过磷脂双分子层的通道，但对亲水溶质的通透性很低22。非亲水性的-内酰胺类和喹诺酮类药物须借助细菌细胞膜上的膜孔蛋白方能进入细菌细胞抵达药物作用靶位。膜孔蛋白缺陷导致的耐药机制包括：膜孔蛋白结构的变化或者抗生素诱导的膜孔蛋白表达下调。资料显示，鲍曼不动杆菌的主要外膜蛋白为热修饰蛋白HMP-AB，此膜孔蛋白属于Ompa家族，OmpA家族的成员是允许-内酰胺类和大约800的糖类通过的慢膜孔蛋白，可允许小溶质的较慢弥散，亦可允许不能透过大肠杆菌OmpF通道的较大分子弥散23。 鲍曼不动杆菌培养浮游物的蛋白组学分析显示，在高浓度NaCl中，外膜蛋白释放，包括两种膜孔蛋白(CarO和一个3336 kDa的蛋白质)，其丢失或失活与抗菌药物耐药有关24。CarO蛋白的二级结构是具有典型孔蛋白波谱的一个-桶状构象由CarO形成的孔具有轻度离子选择性，而无电压关闭25。在CarO上无特定的亚胺培南连接位点，因此其更可能是一个非特异的单体通道26。carO基因可被插入序列的ISabal插入打断，插入的ISabal在位点315形成一个未成熟终止密码子，导致此分离株缺失一个29 000的蛋白链(Cad3)27。当carO基因被ISaba825或ISabal25元件插入打断时，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物敏感性降低28，表明CarO膜孔蛋白改变与碳青霉烯类药物耐药相关。2.1.3 PBP突变导致的耐药 各种PBP在细菌胞壁必需成分肽聚糖的合成中起决定性作用。PBP催化聚合作用(转糖基)和使用转肽作用来环化肽聚糖的最后一步29。-内酰胺类药物可抑制细菌肽聚糖合成，因其天然D-丙胺酰-D-丙胺酰的结构类似，可与PBP活性位点通过共价键结合，抑制转肽酶活性，从而阻止肽聚糖的合成，导致细胞壁缺损，引起细菌细胞死亡30。细菌可通过改变它们的PBP结构对-内酰胺类药物耐药，PBP介导的-内酰胺类耐药机制包括：获得一个“新”的低敏感性的酶，固有的PBP发生突变导致与-内酰胺类的反应减少(而同时维持转肽酶活性)或者下调PBP表达31。Gehrlein等32从一株来自德国的亚胺培南敏感的分离株和亚胺培南耐药的克隆中确定了7种PBP，在亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌克隆株中，除了24 000的PBP数量增多并对亚胺培南显示低亲和力，其他所有PBP的表达均有降低。总体来讲，PBP改变或PBP编码基因突变与-内酰胺类耐药关系研究报道较少。2.1.4 细菌膜主动外排泵活性增加 细菌主动外排系统可主动地将膜内尚未发生作用的抗生素排除菌体外，从而降低药物的作用浓度。目前与CRAB有关的外排系统主要是AdeABC，此外还有AdelJK、Ahem系统。荧光定量PCR实验对碳青霉烯类抗生素敏感和耐药的AB分组比较adeB基因的表达量，结果显示敏感组的adeB的表达量低于耐药组的表达量，说明adeB基因或者说AdeABC外排泵可能在临床菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中起作用33。2.2 喹诺酮类抗生素 其主要耐药机制与gyrA、parC基因点突变有关34。喹诺酮耐药株中的gyrA基因存在两种点突变，其中gyrA基因TCA-TrA突变导致其编码的DNA旋转酶第83位丝氨酸被亮氨酸所替代，TGT-CGT突变导致第121位半胱氨酸被精氨酸所替代。parC基因也可发生突变，AGC-AAC突变导致其编码的拓扑异构酶4第144位丝氨酸被天冬酰胺酸所替代。2. 3 氨基糖苷类抗生素 (1)产生氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因。此基因大多位于可移动遗传元件(如质粒、转座子、整合子等)上，可在菌株间水平传播，从而细菌耐药性广泛传播。(2)甲基化修饰：16S rRNA甲基化酶能使药物作用靶位(16S rDNA)甲基化，导致甲基化后的16S rDNA与氨基糖苷类药物亲和力下降，从而产生了对氨基糖苷类药物的高水平耐药35，编码的基因以arnA基因型为主。2. 4 对甘氨环素抗菌药物的耐药机制 替加环素是第1个甘氨酰环素类抗生素，作用机制是与细菌30S亚单位核糖体结合，阻止tRNA与核糖体的结合，抑制蛋白质的合成而限制细菌的生长。Olson等36对替加环素的抗菌机制研究结果显示，其抑制细菌蛋白合成的能力是米诺环素的3倍，四环素的20倍。替加环素与米诺环素的主要区别在于前者在9位上增加了一个甘氨酰氨基，在其他天然或半合成四环素类抗生素中均未出现过，它使得替加环素能够克服四环素类抗生素有关的2种主要耐药机制：由TetA和TetB转座子介导的外排泵及对核糖体的保护性，从而可以用于治疗四环素耐药菌所致的感染。在体外实验中替加环素对鲍曼不动杆菌的抗菌活性大于亚胺培南，对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌同样有效37。 关于替加环素的耐药机制，Ruzin等38的研究结果显示，AdeABC外排泵在鲍曼不动杆菌对替加环素耐药方面发挥了作用。2. 5 对多黏菌素耐药机制 多黏菌素类为19世纪40年代发现于多黏芽胞杆菌的一组多肽类阳离子抗生素，已成为治疗MDRAB感染的最后选择。临床中应用的为多黏菌素B和多黏菌素E。 多黏菌素类通过其阳离子分子竞争置换革兰阴性菌细胞外膜上的钙、镁离子，导致细胞膜的局部稳定性降低，通透性增加，胞内成分外溢，最终导致细菌的崩解死亡。此外，多黏菌素类还能够与革兰阴性菌外膜脂多糖组分脂质A相互作用而中和其内毒素活性。从而拮抗内毒素的生物学作用。 细菌对多黏菌素产生耐药的机制主要是通过减少脂多糖，减少特殊外膜蛋白的表达或减少细胞外膜钙、镁离子成分或改变脂质来改变细胞外膜。 国外学者对鲍曼不动杆菌对多黏菌素E的耐药作了体外研究，结果表明由于外膜蛋白的丢失改变了外膜渗透性，外膜渗透性的降低可能是导致细菌对多黏菌素E耐药的原因。3 临床治疗研究进展 一般来说，可供选择的抗鲍曼不动杆菌的药物有：青霉素类(哌拉西林)、头孢菌素类(头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟)、酶抑制剂合剂(头孢哌酮-舒巴坦、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦)、碳青霉烯类(亚胺培南、美罗培南、帕尼培南等)、氟喹诺酮类(环丙沙星)、氨基糖苷类(阿米卡星、庆大霉素)。在目前新型抗感染药物更新缓慢的情况下，联合用药成为治疗MDRAB感染的有力措施39。一项回顾性研究结果显示，碳青霉烯类抗生素联合氨苄西林舒巴坦治疗MDRAB引起的菌血症，其效果优于碳青霉烯类单药和碳青霉烯类联合阿米卡星，舒巴坦除了可以抑制-内酰胺酶外，还可作用于鲍曼不动杆菌的PBP2从而发挥其固有的抗菌作用，虽然体外实验不能完全说明临床效果，但可以作为治疗MDRAB的选择之一。现有的研究发现，美罗培南联合舒巴坦对于鲍曼不动杆菌主要呈协同和部分协同作用，国外学者推荐肾功能正常者舒巴坦使用至少每日6 g的剂量，因此考虑使用1：1的联合制剂则能使2种药物达到所需的最大剂量40。多黏菌素很早即在医院使用，但因其肾毒性严重而淘汰，最近因其对鲍曼不动杆菌的杀菌作用而重新被重视。有体外研究表明，多黏菌素B和利福平联合对MDRAB保持高度敏感性，由于这两类药物的作用位点不同，联合作用以协同作用为主，而且通过降低用药量可能减少多黏菌素B的不良反应，在严重MDRAB感染情况下应该考虑使用该组合41。亚胺培南+庆大霉素、头孢吡肟+左氧氟沙星也具有较高的体外协同作用。但是部分菌株实验中存在拮抗作用，应用这两种组合时要考虑菌株的个体差异42。新甘氨酰环素类药物替加环素尚未在国内上市，已在药敏试验中发现耐药菌株。从理论上来说，对泛耐药鲍曼不动杆菌无药可用，体外研究有多黏菌素+替加环素仍对其敏感，但体外联合药敏试验不能作为临床用药的指南，因此还需进一步的临床试验来证实其有效性。4 小 结 综上所述，MDRAB的耐药机制复杂，对常用的多种抗生素耐药，临床上治疗较困难，而且病死率高。单一药物治疗很难达到治疗效果。已有报道证实了对多黏菌素耐药菌株的出现，而替加环素在临床上的使用还处于摸索阶段。因此联合用药的方案应成为临床的首选。但是，从根本上还是要预防MDRAB的出现，显然这比治疗更有意义。这就要求我们必须充分考虑临床的复杂性，采取综合的治疗策略，在治疗原发病的同时，从隔离传染源、切断传播途径、保护易感者人手，积极预防MDRAB感染，及时去除可能引起感染的各种诱因，采取严格的感染控制措施。最重要的是谨慎并合理地使用抗生素，以减轻抗生素的选择性压力，避免新型耐药菌株的出现，控制耐药菌株的传播，同时对细菌的耐药性进行监测，对MDRAB的耐药机制做进一步深入地研究，并在此基础上研发新一代具有高度抗菌活性的抗生素，以取得满意的治疗效果。 参 考 文 献 1 宋彩虹,陈维贤. 鲍曼不动杆菌多重耐药机制研究进展J. 国际检验医学杂志. 2012(15)2 Potron A,Munoz-Price LS,Nordmann P,et al.Genetic features ofCTXM-15-producing Acinetobacter baumannii from Haiti. 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