常规组织病理技术.doc

第二章 常规组织病理技术活体组织检查：活检的目的 l 协助临床对病变作出诊断或为疾病诊断提供线索l 了解病变性质、发展趋势，判断疾病的预后l 验证及观察药物疗效，为临床用药提供参考依据l 参与临床科研，发现新的疾病或新的类型，为临床科研提供病理组织学依据 活检的应用范围 l 协助临床对病变作出诊断或为疾病诊断提供线索l 了解病变性质、发展趋势，判断疾病的预后。l 验证及观察药物疗效，为临床用药提供参考依据l 参与临床科研，发现新的疾病或新的类型，为临床科研提供病理组织学依据活检标本类型l 手术摘除的器官、组织，如阑尾、甲状腺、胆囊、淋巴结等l 穿刺抽取组织，如肝、肾、淋巴结的穿刺组织l 自病变部位切取的小块组织，包括用纤维胃镜、纤维支气管镜等内镜钳取的病变组织l 刮取的组织：刮出的子宫内膜组织（诊刮），外科手术刮取的病变骨组织等活体组织标本的固定与送检 l 固定 存放 送检 组织与细胞的取材l 一张好的切片是保证病理诊断和科研结果准确性的前提和基础 与正确的取材、合适的固定和良好的染色密切相关组织处理要求完整保存组织细胞的形态最大限度保存组织或细胞成分的抗原性抗原不弥散，以保证其准确定位组织取材（一）一般原则l 厚度 0.20.3cm；面积 1 1.5cm2l 较薄的皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条缠绕成同心圆状l 骨组织需先经脱钙处理l 若需保存新鲜组织，应将所取组织用锡箔纸包好，浸入液氮速冻，然后置-70冰箱中（二）取材注意事项 刀剪应锋利、避免前后拉动和挤压l 避免使用有齿镊，动作轻柔以免挫伤或挤压组织l 避开坏死组织和血凝块，去掉异物l 取病变主体、病变与正常交界和正常组织各一块固定及常用固定剂一、概念：将组织浸入某些化学试剂中，使组织细胞内的物质能尽量保持其生活状态时的形态结构和位置二、固定的作用1. 保持组织、细胞与生活状态时相似的结构和形态，防止组织自溶和细菌繁殖导致的组织腐败2. 保持细胞内蛋白质等成分凝固并定位于原有部位3. 便于区别不同的组织成分：固定可使组织细胞中各种成分沉淀、凝固并易着色4. 有利于切片：固定剂兼有组织硬化的作用，能使组织细胞从半液体状变为半固体状5. 有利于免疫组化染色和核酸原位杂交：完整保存及准确定位抗原、DNA和RNA成分三、组织固定的注意事项1. 取材后要及时固定，尤其是温度高的季节，以免腐败2. 容器：最好选择广口的容器，一是避免组织受挤压变形，二是方便取材时易于取出3. 固定液要足量，至少应为组织块总体的5倍以上4. 根据不同研究目的选择不同的固定液 Masson染色，最好用甲醛升汞、Zenker液或bouin液固定l 保存细胞内糖原应选用Carnoy液固定l 显示尿酸盐结晶可用100%酒精固定5. 固定时间：视组织块大小、固定温度、固定液种类而定l 一般固定6小时以上，然后保存于70%酒精中l 温度低于4时，固定时间应延长l 比较大的标本除延长固定时间外，还应做多个切面固定，以免固定不均匀四、固定方法1. 浸泡法2. 蒸汽固定法：常用于固定组织中的可溶性物质3. 灌注固定法：用于组织块过大或固定剂难以进入其内部的标本（如整个器官、整只动物）4. 滴加法：细胞涂片5. 微波固定法（63 65）：具有核膜清晰、染色质均匀、组织结构收缩小等优点，但由于其固定时间不易掌握，一般不主张运用于小组织块固定常用固定液及其配制（一）单纯固定液：由单一化学物质组成1. 甲醛（1）优点：价格便宜、组织穿透力强、固定均匀、组织收缩小，可长期保存标本（2）缺点：易挥发，有一定毒性（3）性质：交联性组织固定剂（4）适用范围：适合多种特殊染色，对脂类和类脂体、神经及髓鞘均有良好的固定效果；也可固定高尔基体、线粒体和糖类（5）使用浓度：10% formalin，即10ml市售原液（40%）加90ml的水，此液的甲醛实际浓度为4%2. 中性甲醛 以pH7.27.4的磷酸缓冲液（PBS）为溶剂配制的甲醛溶液，浓度同前l 优点：固定效果及对组织抗原的保存均优于一般甲醛溶液l 是科研用组织最常用的固定液3. 乙醇（1）优点：具有硬化、固定、脱水等作用，还能保存糖原和尿酸结晶（2）使用浓度：固定组织用80%95%为好，70%的乙醇可用于保存组织；证明尿酸结晶和保存糖原用100浓度（3）缺点：l 组织渗透力较弱l 能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白沉淀后能溶于水，使核染色不良l 高浓度乙醇固定的组织硬化显著，组织收缩明显且脆，既影响切片，又致组织形态改变，影响诊断l 溶解脂肪、类脂质和血红蛋白，还损害其它色素（二）混合固定液：由多种化学物质混合组成1. A-F液酒精-甲醛固定液l 固定兼脱水，固定后可直接入95%酒精脱水l 配制方法：95%以上浓度酒精90ml，40%甲醛10ml，混合而成2. Bouin液（1）优点：渗透力强，对组织固定均匀，收缩很小，不会使组织变硬变脆，适用于睾丸活检等小组织的固定（2）固定时间：小块组织只需数小时，较大脏器固定1224小时（3）配制方法：苦味酸饱和水溶液75ml，40%甲醛水溶液25ml，冰醋酸5ml80%酒精150ml， 40%甲醛60ml，冰醋酸15ml，加入结晶苦味酸1g（用前配制）3. Zenker液（1）优点：HE染色最好的固定液，此液固定的标本，胞核和胞质染色清晰（2）固定时间：1224小时（3）缺点：配制该液的试剂较昂贵，且需处理汞（4）配制方法： 重铬酸钾2.5g，升汞5.0g，蒸馏水100mll 将升汞、重铬酸钾和蒸馏水混于烧杯中，加热（4050）溶解，冷却后过滤，贮存与棕色瓶中l 临用时取贮存液95ml，加入冰醋酸5ml4. Carnoy液l （1）优点：l 穿透力强，能很好地固定胞质和染色质l 特别适合固定外膜致密的组织l 在固定组织的同时，能溶解大部分脂肪l 用于糖原及尼氏小体的固定l 对显示DNA和RNA的效果很好（2）固定时间：小块组织固定12小时（3）配制方法：无水乙醇60ml，冰醋酸10ml，氯仿30ml。（4）缺点：氯仿有毒组织的脱水、透明 浸蜡和包埋：切片前的处理过程，主要目的是便于切薄片和长期保存组织块一、脱水l 用某些溶媒（脱水剂）置换组织内水分的过程l 脱水剂必须能与水任意比例混合l 常用脱水剂：有乙醇、丙酮及叔丁醇（2-甲基-2-丙醇 ）l 丙酮引起组织收缩作用强而较少应用l 为了减少组织的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从70%浓度开始，经80%、95%直至无水乙醇 二、透明l 组织块中的水分被透明剂所取代，组织块变得透亮的过程l 最常用的透明剂为二甲苯，因其既能与酒精混合，又能溶解石蜡l 处理时间一般为30min左右l 其它透明剂：苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等三、浸蜡l 组织透明后在熔化的石蜡内浸渍，让蜡液完全渗透入组织细胞内的过程 用于浸渍的石蜡熔点为5256 浸蜡时间一般为3小时，需更换3次石蜡液 浸透或透入：用其它浸透剂（火棉胶、碳蜡、明胶等）渗入组织内部的过程四、包埋 组织块经过浸蜡或浸透后，再用包埋剂包起来的过程l 包埋后的组织块具有一定的硬度和柔韧性，有利于切薄片l 常用的包埋剂：石蜡、火棉胶、碳蜡、明胶和塑料等，可根据不同的研究需要选用一、石蜡切片厚度：35m漂片附贴（40的恒温热水中完全展开）烘片：5660，经3060min 石蜡切片注意事项用于DNA提取的石蜡切片一般为5 10m，用小镊子夹入微量离心管中，每管可装5 10片切片过程中应严格注意防止标本间的交叉污染，以避免假阳性应避免刀痕、皱折和残缺二、冷冻切片适用范围：快速病理诊断、酶组化染色、苏丹染色等厚度：68m适应症 l 确定病变的性质 l 确定切除肿瘤的边缘是否有残存肿瘤组织以明确手术范围 l 辨认手术切除组织 l 确定切除的淋巴结内有无转移的肿瘤细胞 不宜作冷冻切片诊断的情况 l 骨、脂肪、钙化明显的组织 l 组织太少太小的标本 l 需依据核分裂计数判断良恶性的软组织肿瘤 l 疑为恶性淋巴瘤者 l 其他风险及可能的后果 l 冷冻切片诊断由于取材有限l 制片方式特殊l 染色质量差l 诊断时间短等不足l 临床应用有一定的风险性 冷冻切片病理诊断知情同意书 l 难免有出现误诊的可能性，病理医师将承受极大压力 l 应该由临床医师、病理医师和患者共同来承担这种风险 l 让患者知道自己可能面临的各种结果，有权接受或拒绝该项检查 常用的病理染色技术及其应用一、苏木素-伊红染色 HE染色，被称为常规染色l 能较好地显示组织结构和细胞形态l 保存时间长l 应用广泛1. 染色步骤（略）2. 结果显示：l 细胞核呈蓝色；细胞质、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色l 钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色3. 注意事项l 切片脱蜡应彻底l 根据染片多少和染液新鲜程度掌握染色时间长短l 分化处理要适度l 染色后酒精脱水应遵循从低浓度到高浓度，由快到慢，梯度脱水l 染色要求切片色泽鲜艳，明亮清晰二、常用特殊染色方法及其应用（一）结缔组织染色结缔组织含有三种纤维：胶原纤维、网状纤维和弹力纤维它们在HE染色时不易区分，特染可鉴别1. 胶原纤维染色目的：判断梭形细胞肿瘤的来源：鉴定心肌瓣痕灶、早期肝硬化、肺纤维化以及其它纤维组织增加或减少性病变等常用方法：Masson三色染色法结果：胶原纤维呈蓝色，肌纤维和红细胞呈红色，细胞核为蓝褐色注意事项：l Masson复合染色液经磷钨酸分化时须在显微镜下控制至肌纤维清晰为止l 苯胺蓝可用亮绿染料替换，此时胶原纤维染成绿色2. 网状纤维染色l 目的：显示网状纤维和基底膜l 用于鉴别l 上皮性与非上皮性肿瘤l 某些间叶组织肿瘤l 判断原位癌与早期浸润癌l 观察肝组织的网状支架塌陷、破坏或增生等改变l 常用方法：Gomori银染色法 结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈红色，背景呈黄色 注意事项：配制氨性银溶液必须将器皿洗干净，所用蒸馏水要纯加氨水要适量，宜现用现配，以免银盐析出，影响染色结果氧化液存放时间不能长，以免失去氧化作用丽春红复染液一般须滴染，无水乙醇冲洗时要将切片倾斜，以防染液停留在切片上而造成的组织中胶原纤维分布不均的假象3. 弹力纤维染色l 目的：l 观察皮肤组织的增殖变化l 老年性肺气肿的纤维断裂、变性或萎缩l 高血压病时小动脉管壁弹力纤维的异常增生l AS动脉管壁弹力纤维的崩解、断裂与缺失l 实验动物组织中的血管壁损害和增生情况常用方法：醛品红弹力纤维染色法结果：弹性纤维呈深紫色，底色为不同程度的黄色注意事项：l 醛品红染液要置冰箱内保存，用时恢复至室温l 橙黄G液要淡染，否则会掩盖弹力纤维的深紫色（二）糖类染色单糖和双糖多糖：淀粉、纤维素、糖原黏多糖：中性黏液物质和酸性黏液物质1. 糖原染色l 目的：l 明确细胞内空泡性质l 糖原贮积病的诊断l 某些透明细胞肿瘤的鉴别诊断l 低分化腺癌的诊断l 早期浸润癌的判断l 肾小球肾炎的分类诊断常用方法：PAS染色法（过碘酸-Schiff）结果：糖原及其它PAS阳性反应物质呈红色，细胞核呈蓝色注意事项组织固定要及时，取材要小，以免糖原颗粒居于细胞一端配制Schiff液的重亚硫酸钠质量必须纯Schiff液应置冰箱内保存，用时取出恢复室温后再进行染色应设对照片（用唾液或1%淀粉酶消化后染色）染色时间示温度而定，夏季短，冬季长2. 粘液物质染色 目的：粘液性上皮肿瘤的鉴别，证明肿瘤内是否有粘液l 常用方法：Alcian blue-PAS染色法l 结果：中性粘液物质呈红色，酸性粘液物质呈蓝色注意事项 Alcian blue染色时，玻片上不能涂白胶或火棉胶，以免背景着色染PAS时采取滴染法，用过的试剂不能再用3. 组织中脂类的显示法l 目的：l 鉴别细胞内空泡的性质，对某些肿瘤的诊断有意义l