解谱.doc

结构并不是太复杂的一个化合物。照例先放上氢谱。HNMR 从氢谱可以先试着做一下简单归属。 从高场开始，12是端位的NH2，10和11显然是两个亚甲基出的峰，14为与氧相连的甲基。从耦合常数上来看，6和7应该是苯环上相邻两个氢， 而2和9是另外两个孤立的氢。 如果是初学者，可能大致就归类到这样。而10和11,2和9以及6和7具体归属也许并不好作判断（事实上由于7为dd，9为d，可以通过计算耦合常数讲7与9进行确定，与此同时6与2也确定下来了，但10与11的归属有一定难度，从谱图来看，10的峰型比11略为宽，由于N的核四极矩影响，与N直接相邻的CH2一般会略宽一些，然后之后的实验否定了这个结果，下面我会细说），而最低场的活泼氢是NH的。 而很多情况下并没有一些明显的证据可以单从HNMR准确判断所有峰的归属，尤其在做多维实验前，我的习惯是如果氢谱某些峰的归属处于模棱两可的情况时，先不做判断，因为随着实验的进行，一些确定因素会渐渐浮上水面。HNMR参数上面这张图是第一张氢谱图的右半部分，我所出的每一张核磁谱图都会有这一栏。因为论坛图片显示大小的关系，我将它单独截下来做一个简单解释。很多人并不会留意核磁参数的设置，其实适当的了解还是很有用的。对于核磁操作人员来说，可以通过这些参数看出一些谱图“失败”的原因；而对于解谱人员来说，了解这些参数有利于做到对自己的谱图“心中有数”，并且可以DIY自己的实验，和核磁操作者更好地进行交流。这里我将一些我觉得比较实用的参数用黄色标记，并做简单的解释。PULPROG：pulse program 是实验的脉冲序列。zg30是氢谱最常用到的脉冲序列，为30度激发。TD：采样点数。这个值决定了FID的真实采样点。值越大，点越多，在谱宽确定的情况下，会延长采样时间。一般氢谱没有必要去改，默认的即可。SI：变换点数。决定了傅里叶转换后的谱图点数。和TD相对应，但只能是2的N次方。是过程参数，一般大于TD的一半即可。SWH：谱宽。绝大部分的氢谱出峰在-2 ppm至18 ppm之间，对应20 ppm的谱宽。对于400MHZ的核磁,即对应400x20=8000HZ的谱宽。如果您的化合物结构比较特殊，对于谱图的呈现范围有特殊要求，可以提前和核磁操作人员联系。他们一般会通过修改SWH和O1P来进行调整。FIDRES：谱图分辨率。这个值一般会被忽略，但其实很重要。举个例子，如果你的核磁谱图分辨率为0.5Hz，但是你在文章中说你的某个峰耦合常数是0.32HZ，这显然就是错的。因为谱图是由数据点构成，而两个最接近的点间隔都有0.5，你怎么会看到小于0.5的细微结构呢？事实上，这张图给出的fidres是fid的分辨率，但是涉及到傅里叶转换后的频域谱图，SWH/SI应该是文献中给出的分辨率。SOLVENT：实验中用于溶解样品的氘代试剂。NS：重复扫描次数。氢核灵敏度高，一般情况下扫1次结果就很好了。如果你的样品很少或者溶解度很差，你可以要求核磁人员增加扫描次数，当然这需要付出额外的扫描时间。谱图信噪比正比于扫描次数的1/2次方。D1：弛豫等待时间。一般在做严格的定量谱图时这个值很重要，而通常的谱图默认即可。SF：在此核磁的磁场强度下，H1的共振频率为400MHZ,即所谓的400M核磁。LB：窗函数的重要参数。这个值越大，信噪比越高，但分辨率差（大数值适用于灵敏度低但不注重分辨率的碳谱）；这个值小，分辨率提升但信噪比变差。对于普通氢谱而言，NS，SWH是解谱人员在实验前可以向核磁人员要求DIY的参数。D1用于定量实验中，也不排除一些文献中规定了D1的取值。单纯改脉冲激发角度一般没什么用，但有些文献喜欢强调这一值，也可以单独向操作者要求。LB是处理参数，可以在得到谱图后自行进行调整。celan:论坛上曾有过不少朋友的帖子提问过NMR实验参数的意义问题，tcxuefeng朋友是个有心人，他将bruker NMR的实验参数做了注释，这对NMR图谱分析者是有用的，感兴趣者不妨粘贴下来。DEPT135 由于之后还要针对这个化合物做各种二维实验，因此碳谱的归属是必须要做的。与氢谱想比，由于C13的丰度小，以及碳本身的旋磁比仅为H核的1/4，因此做碳谱需要比氢谱花更多的时间。很多氢谱扫描一次信噪比已经很好，但相同浓度的碳谱要得到同样的信噪比却需要数千次的扫描即意味着数千倍的时间，因此很多合成人员的碳谱都被安排在晚上过夜。而事实上，很多情况下在得到氢谱的数据后，如果需要加做碳谱往往只是解谱人员对某些基团的不确定，当这些基团不是季碳的时候，有一种碳谱能够在1/3的时间内得到比普通碳谱更好的结果DEPT！ DEPT是Distortion Enhancement by Polarization Transfer的缩写，翻译成中文就是无畸变极化转移增强。其碳信号增强原理与大名鼎鼎的INEPT相似，但是较后者有更多的优点，原理我就不多说了，在氢谱不能给出满意答案不得不求助于碳谱的信息时，我会习惯先做一个DEPT135！ 上图即是这一结构的DEPT135的谱图，我们可以看到有正和负两种相位，这正是DEPT135的奇妙之处！它能够让CH3和CH信号为正，CH2信号为负，而不与氢相连的季碳不出信号！（即所谓的奇正偶负）由于普通碳谱对氢去耦后不像氢谱能观察到相邻基团的耦合信息，对于碳谱的解读很多时候只能靠数碳的个数和看化学位移来大致判断，当化合物结构很复杂时，对于碳的归属往往让人一筹莫展。但DEPT135能在更短的时间内帮我们把这些信号分类：去除掉季碳信号；将碳信号按照正负排列；更别说还能大幅度减少实验时间何乐而不为呢。几乎只瞄了一眼这图我们就可以清晰认出，43和30 ppm的两个负峰为亚甲基的碳，55.8 ppm的那个峰为与氧相连的甲基碳，低场的4个峰为环上的4个CH。 不过对于解谱人员有一点需要了解的是，拿到手的谱图相位有可能是反的。因为在输入相位校正命令的时候软件自动将最高的峰定义为正，有时候当CH2的信号最强时，往往会被校正为正峰。对于软件而言，正负只是相对的。如果出现了谱图中碳信号与预想中正负完全相反时，可以要求核磁人员将信号校正过来。 此外，DEPT谱还有另外两种常见的形式，分别是DEPT45和DEPT90。与DEPT135一样，所有DEPT实验都没有季碳信号。（这里要注意，与碳谱不同，理论上氘代溶剂DEPT应该不出峰。但是实际上有时候能够在DEPT谱上看到较弱的溶剂信号。这一信号可以对应碳谱的溶剂出峰位置予以排除）但是，区别在于DEPT45中所有CH,CH2,CH3均为正峰，而DEPT90中我们理论上仅能看到CH信号。在DEPT家族中，DEPT135给出的信息显然最多，因此一般做135即可。而与另外两种实验结果线性组合可以给出CH,CH2,CH3三种信号的三个独立子谱。为了让帖子更为完整，今天补充做了DEPT90和DEPT45的谱图如下，方便大家与DEPT135进行区别。可以看到，在DEPT90的谱图上还是可以看到残留的季碳信号的，这是由于90度H脉冲与实际值偏差导致，可以通过调节仪器的P3时间来优化谱图。DEPT90DEPT 45C13CPD 即普通的碳谱。CPD的意思是组合脉冲去耦的意思（Composite Pulse Decoupled）这种碳谱由于对氢去耦，因此出的碳都是单峰而观察不到H对C的裂分。由于CH的一键耦合常数很大，如果没有CPD，峰和峰之间相互重叠很严重，将严重影响解谱。此外，弛豫等待期对氢去耦能产生NOE效应从而增强碳信号，因此C13CPD是最常规的碳谱。在之前DEPT135的帮助下，我们很快能判断新出的4个碳信号为季碳上面的C。如果进一步分析，我们可能可以认为最低场153 ppm的为与氧直接相连的季碳，但是还是那句话，在有后续谱图的前提下，我们暂不做分析。姑且将谱图的碳指认进行到上图所标示的结果为止。 针对普通碳谱而言，我觉得有几个需要注意的地方。 一是由于这一脉冲仅对氢核去耦，因此一些有自旋的核并不在去耦之内。因此在碳谱中如果看到很明显的裂分结构，要注意F,P,D这些元素的存在。如图中特征的溶剂峰，即为D对C耦合所造成（根据2In+1规则，D的spin为1，甲基由3个D组成，因此形成2x1x3+1的7重峰型），而F,P这类丰度较高的1/2核将造成和H相类似的裂分峰型。 另一方面，可以发现，季碳峰的峰高较低。一般而言，C13CPD不能和氢谱一样定量。主要原因有两点：一是碳谱去耦过程中引入的NOE效应对不同的级数碳影响不同，针对季碳这一增强可以忽略不计；二是碳的弛豫恢复时间分布很广且很长，举个不恰当的例子，对于甲基而言可能激发5秒后已经恢复到平衡位置，而对于季碳可能才恢复了1/10。造成的结果就是可能第一次扫描大家信号都出1，但是第二次扫描因为短时间内恢复程度不同，甲基信号可能变成2，而季碳才1.1，而随着碳谱扫描次数的增加，这一差距愈发明显。针对这一情况，有类似的反转门控去耦脉冲可用于碳谱定量及门控去耦碳谱可用于保留NOE增强下H对C裂分情况的观察。后面有机会我会把这两种谱图放上来。但是这一现象也给我们一个启示，通常而言季碳或者芳香环上的碳在同样扫描条件下峰高较低；而一些类似的C如长链烷烃中间的CH2也可以通过普通的C13CPD部分定量。CNMR参数碳谱的参数和氢谱差不多，这里就不一一叙述。不过有几个比较特殊的参数我用黄色标记了。NS:由于碳的灵敏度差，Bruker默认的扫描次数为1024，一些样品量少的碳谱往往会扫数万次。不过这个样品因为浓度很高，为了节省扫描时间，16次就已经有了很好的结果了。因此在扫碳谱的时候，浓度提高比增加扫描次数好的多。SWH:碳的信号范围一般在-20-220ppm。由于碳的激发频率在400MHZ核磁上为100M，因此谱宽换算成HZ为240x100=24000HZ。这一数值可以根据特殊样品，要求核磁操作人员进行调整。D1:相对于氢谱而言，碳的弛豫等待时间更为重要一些，但一般也就限于定量碳谱。原因上面已经提到，要考虑弛豫恢复时间。不过针对一般的碳谱，这个数值不需要做太大改动。SF:由于碳13的旋磁比约为H核的1/4，因此碳的激发频率在400MHZ核磁上约为100MHZ。LB:由于碳的谱宽范围广，并且通常不用观察耦合裂分，因此相对于氢谱，碳的分辨率要求比较低；而与氢相比，碳的信噪比要求比较高。因此，可以通过调高LB值，达到理想的效果。不过这一数值可以在做完核磁谱图后再做调整。总之，与氢谱相比，碳谱的NS,SWH,D1可以根据化合物特殊性质，要求核磁操作人员在扫描前进行修改。H-C HSQC 在得到了氢谱和碳谱信息之后，如何将他们关联起来成了一个主要的问题：较碳谱而言，氢谱能给出相邻核之间的耦合值，因此在归属上能够给出更明确的信息；而与氢谱比较，碳谱因为谱宽分布大的多，因此当氢谱中由于化学位移相近而严重重叠时，往往能够在碳谱一维得到很好的区分。而有一种实验能够将两者完美的关联在一起，令人兴奋的是，这一实验是成功率最高的二维实验之一，同时他所需要的时间极短，往往在5-10分钟内就能得到很好的结果。如此实用的一个实验，没有理由不记住它的名字：HSQC 上图即是这一化合物的HSQC谱图。作为本帖出现的第一个二维谱图，HSQC开了个好头：如图所示，它的结果是明确和令人愉悦的。横的一维称作F2维又叫直接维，从下面的坐标范围可以清楚的看到，它描述的是氢维度的信息，顶部的氢谱明确了H各个峰的位置（顶部谱图是单独做了氢谱后载入的，单纯的HSQC实验给出的投影往往没有这么好）；而纵向的维度称为F1维又叫间接维，它描述的是碳谱的信息。由于这一维度并不是由采样直接获得，因此分辨率一般较差（与提高F2维分辨率相比，间接维的分辨率提升需要付出更多的实验时间）。好在碳谱不差分辨率。正如图中所看到的那样，图中的信号往横和纵两个方向可以分别在氢谱和碳谱上找到对应的峰，而碳和与之直接相连的氢也就因此关联了起来。正如红色线段所标示的那样，H14和C14的关系出现在了它最应该出现的位置。而再花上不到1分钟的时间，我们就可以将所有H和C“绑定”在了一起。 这里我想插一句的是，在很多教材上，有一个与之相类似的实验HMQC。某种程度上，可以认为HSQC是HMQC的某种进化，两者在解谱上面没有任何区别。一般而言，当你的仪器性能比较正常的时候，HSQC比HMQC的分辨率要好一些。但HMQC的优势在于它的脉冲序列更为简单：因此如果核磁谱仪非常老，或者脉冲角度不太准的时候，HMQC的图也许好一些；但大部分情况下，如果你看文献上面是HMQC实验而核磁操作人员给你出的是HSQC的谱图，并没有什么问题。 讲到这里，大家也许会奇怪。既然HSQC能够同时给出H谱和C谱的信息，那理论上它的实验时间至少应该和C谱相当，为什么它所花费的采样时间却远低于碳谱呢？其实，这才是HSQC的魅力所在！已知H的旋磁比是C13的4倍，由于核磁信噪比正比于旋磁比的5/2次方，而这一实验从激发到采样都只和H有关，那么从理论上这一增强即是32倍这还是相当可观的。这一技术被称作反向检测，被广泛应用在许多二维实验中，今后会大量遇到，尤其是在一些比C丰度更小，旋磁比更低的核（如N15）上，HSQC实验能使在短时间内对N核的检测从不可能变为可能。这一部分我将在之后细说。 再讲两个HSQC的实用应用。 由于HSQC采用的反向检测技术使碳维信息的给出时间大为缩短，因此当想在短时间初略观察碳（非季碳）时，HSQC是一个很好的选择。我曾经尝试过利用软件将HSQC在F1维的投影单独抽取出来以碳谱形式呈现，效果也是不错的！ 另外，关于活泼氢的判断，教科书往往把重水交换作为一个主要内容。其实，相对于重水交换取出样品加入重水再充分交换匀场做样而言，我更习惯直接在氢谱后排个HSQC了事，而很多时候这样没准更快。因为HSQC给出的是HC直接相关的信息，当有一个H信号没有与之相关的C相连时，结合它的峰型和出峰位置，基本可以做出是活泼氢的判断。H-C HSQC(edit) 这一HSQC与前面所介绍的相比，能够给出更多的信息：CH及CH3类型的碳氢一键相关，图中出现的点为“正”；CH2类型的相关，则给出“负”的相关信号，正负信号由两种不同的颜色在谱图上区分（如上图中的黑色和红色）。这一规律同DEPT135相当类似，但也有同样的问题相位是可以校正的，所以如果发现颜色与预期相反，要求操作人员把峰矫正回来就是了。 事实上，这一谱图可以取代传统的H-C HSQC，甚至可以部分取代DEPT135的作用。如果在做完氢谱之后再给我5分钟的话，我会顺手做个edit的HSQC。同核J分辨谱 J-分辨谱在早期曾经是一种非常有用的谱图，它能够很好地区分由于化学位移相近而相互重叠的峰，并将它们的耦合信息在另一个维度加以放大。如上图所示，横向F2维表征了氢谱的出峰位置，而纵向F1维却给出了相应峰在邻核耦合下的裂分情况很显然，这一裂分比单看氢谱要明显的多，以至于我们可以通过右侧放大的“刻度尺”直接读出相应耦合值。为了便于观察，我将6.6-7.6 ppm的谱图单独放大如下： 从氢谱来看，H-6与H-7 J3耦合,耦合常数8.8 Hz；H-9与H-7的J4耦合，耦合常数2.4 Hz，因此H-6，H-9为d峰，H-7为dd峰。然而通过J-分辨谱，我们观察到了单纯通过氢谱所无法观察到的H-6与H-9 J5耦合的存在，耦合常数0.8 Hz！ 不过随着核磁技术的发展，cosy,tocsy等实验在指认H与H耦合关系中渐渐取代了J分辨谱的地位。如上面提到的H-6和H-9的J5耦合关系，同样可以在之后的tocsy实验以及对称化处理的cosy谱图中看到。celan语:这个同核J分辨谱的帖子图文并茂很精彩。LZ通过实例展示了用同核J分辨谱观察常规1HNMR不易看到的0.8Hz的耦合（当然0.8Hz的耦合可以用更简单的技术来观察）。可贵的是LZ一语道破了同核J分辨谱目前的地位，当很多人还没用过甚至还不知道同核J分辨谱时，比其更好的技术已经出现并成为NMR仪器上的脉冲序列。这应该感谢波谱学家的贡献，这也是化学家的幸运。感谢LZ对本版的厚爱！谢谢！异核J分辨谱 异核J分辨谱与同核的解谱方式相同，只不过其F2维是C信号，而F1维给出的是H对C的耦合常数。同样的，为了照顾到所有碳的信号，图中的信号被不合理地放大了，因此显得难以分辨。这里我截取153 ppm处C-8在F1维上的剖面图如下 由于采样时间较短，F1维误差较大，具体值我就不测量了，后面介绍的J-HMBC谱将给出更为精确的C-H耦合常数。不过我们仍然可以从上图初略看到C-8受到H-6，H-9及H-7耦合而呈现的裂分情况。H-N HSQC H-N HSQC给出的是H与N一键相关的信息。解谱方式参照H-C HSQC。 这一实验的魅力在于，利用反向检测技术，将不灵敏核N15的信息转移到灵敏核H1，极大地缩短了N信号出峰的时间：通常而言N15谱所需要的样品浓度非常之高，而普通样品的N15谱花费数天甚至数星期都是很有可能的，但本实验只用了不到1h就得到了较为满意的结果 。由于N元素在有机物尤其是生物大分子中大量出现，这一实验在结构指认方面的重要性不言而喻。 这里插一句，也许大家会想到既然N15在自然界的丰度如此之低(0.366%)，为何不直接采集N14(99.634%)的核磁信号呢？事实上这是核磁科学家的无奈之举。我们知道，自旋数不为0的核能够被核磁检测出来，然而只有自旋数为1/2的核才能被当做点电荷处理，而其他非0自旋核在磁场中都不得不考虑一种称为核四极矩的电场不均匀效应。幸运的是，对于有些核而言，核四极矩并不会对信号由太大干扰（如我之后将介绍的氘谱），但对于绝大多数核，核四极矩将严重影响谱线的线型，而N14正是这些核的典型：大部分情况下，N14的核磁信号将会展宽到无法被观察到。因此，科学家不得不转向丰度低的多的N15来寻求N元素的信息。H-N HMBC 同大家所熟知的H-C HMBC一样，H-N HMBC给出的是H-N远程耦合的信息。为了便于分析，我将谱图的信号部分单独放大。 同HSQC相同之处在于H-N HMBC给出的同样是N15和H1之间的相关信息，谱图中每一个点所对应的F2维H及F1维N在结构上有相关性；但同HSQC的不同之处在于，HMBC给出的是H-N远程耦合的信息，H-N一键相关的信号在谱图上常以耦合形式出现（如图中N1所对应的在10-11 ppm围绕H1对称出现的点）或干脆消失（如结构中端位的NH2）。但这里要消除的一个关于HMBC的误区是，很多人都认为信号的强度与耦合经历的键数成反比：J2耦合信号强于J3，而J3强于J4，以此类推.然而事实是，C/N-H的耦合常数并不完全取决于传递键的个数(通常而言，J2耦合X-Y-X角大，耦合值大，J3耦合值受所成二面角的影响，而J4，J5耦合值常常相等)；而不同耦合值在HMBC中信号的强弱还受到脉冲序列中一个设定参数(CNST13)的影响。总体而言，J3耦合较J2耦合在HMBC中的信号有时会更强一些，而J2有时并不出现，J4，J5无法区分。 本实验中的N1与H2的J2信号在谱图中很明显，而N12与H10的J3耦合信号要远强于其余H11的J2耦合，这导致我一度在信号归属中将H10与H11的归属标反（结合前面H谱分析中关于N14核四极矩引起谱线增宽的判断，这一决定让我着实犹豫了很久），但最终在之后明确的证据下我还是选择了目前的标法，这一点我之后会细谈。H同核去耦谱 与C13CPD对氢的全去耦不同，H同核去耦谱通过照射某个很窄频率的H信号，起到将原先耦合的复杂峰变得单纯化的作用。为了便于讨论，我将上图6.4-7.6 ppm的谱图放大。 通过之前的H谱及J-分辨谱分析我们已经知道，这个范围内的4个峰从做往右依次是H6，H2，H9以及H7。其中H7与H6的J3耦合较大(8.8 Hz)，从而使H6呈现d峰；H9与H7较小的J4耦合(2.4 Hz)使H9呈现d峰；H7同时受到H6和H9的耦合形成如图所示的dd峰。而同核去耦通过照射某个H，使得此H核在短时间内在两种自旋状态中快速变化，以至于相邻的核无法观察到其所处自旋状态，因此达到去耦的目的。 图中红色箭头标示的是照射的H核位置。谱一为普通H谱；谱二通过照射H6，去除了H6对H7的J3耦合，使dd峰型的H7变为d峰；谱三对于H9的照射同样去除了H9对H7的耦合作用。这一结果相对于二维谱快速而直接，对于简化谱图和指认结构耦合关系有一定的作用。不过缺点在于照射的峰必须独立，否则容易“眉毛胡子一把抓”。总体而言，实用性不是太大。F去耦氢谱 与H同核去耦谱相比，F去耦氢谱显得更为实用一些。 由于之前的化合物没有F核，因此在杂核实验中我会临时选用一些新的化合物。熟悉核磁的人都知道，除了H1核外，F19,P31都是较为灵敏的1/2核。尤其是F19，其在自然界100%的丰度以及极为接近H1的旋磁比，使得其在核磁中如H谱一样容易得到，但同时带来了一个问题：F对于H谱造成的影响也不可小视。而与H核的相互耦合不同，F对于H的耦合常数即使相隔多键仍然很大，这就导致了含氟化合物的谱图十分复杂，而当有多个F原子时，即使简单的结构也变得难以辨认。如本例的结构，在未对F去耦前较难对H进行归属，但去耦之后H之间的耦合关系一目了然。常见杂核谱(FNMR,PNMR,SiNMR) F19，P31以及Si29均为在核磁中做的比较多的杂核。与H1及C13一样，这类核在核磁共振检测中有一个很明显的优势均为1/2核，因此谱图线型好，便于分析。通常杂核谱都对H核去耦而去除了H的耦合信息（类比于C13CPD），而通过化学位移来判断结构。由于我们的“单一化合物”并没有这三种核，因此我临时做了三张其他化合物的谱图来做一个简单说明。氟谱(FNMR) F19的核磁灵敏度与H1核相近，一般出峰范围在100负300 ppm之间，通常用CF3Cl来标定0点，也可以用CF3COOH的-78.5 ppm来做标定。通常可以做F谱来判断化合物中是否含有F元素。磷谱(PNMR) P31的灵敏度强于C13但弱于F，但一般在较短的扫描时间内也能得到较为满意的谱图。谱图出峰集中在230负200 ppm范围，通常用H3PO4标定0点。硅谱(SiNMR) Si29灵敏度与C13接近，但是由于其旋磁比为负因此弛豫期间对H照射产生的NOE效应并不利于信号增强(甚至还会减弱)。核磁管玻璃中的Si信号通常会对谱图产生干扰，因此需要核磁人员小心地进行基线处理扣除背景信号。Si谱的出峰集中在100负400，和大部分氢谱一样，TMS作为0点的标定。 总体而言，这三种1/2核是核磁常做的3种杂核，通常可以利用核磁来做一个快速的判断。而N15由于灵敏度太低通常需要同位素标记或富集后长时间扫描得到，之前提及的反向检测技术(见H-N HSQC/HMBC)在应对周围连有H的N核有特效。氘谱(DNMR) 与N14相比，氘的核四极效应要小的多，从而能被核磁检测到。不过由于大部分核磁以D核作为锁场匀场观测核，因此采集D谱通常只能在脱锁状态下进行(有些专门做D谱的仪器则以F来锁场)。上图为我在脱锁状态下做的氘谱，2.5的单峰是氘代DMSO的甲基峰，核四极作用对峰型宽度影响不大。从图中可以看到，氘谱中D出峰的化学位移值与H几乎相同。溶剂峰压制 溶剂峰压制在核磁中是一个很重要的技术，尤其在做生物大分子或者LC-NMR联用时，溶剂信号甚至会是样品信号的10万倍，由于采样计算机的位数是固定的，大量的溶剂信号会几乎占满计算机的动态范围，而只留下很少的位数用来描述夹杂在噪音峰中的目标峰。上图中是回收乙腈的核磁谱图，在溶剂压制之前，几乎只能看到乙腈和水的信号；而在压制了两个溶剂峰之后，回收溶剂中的杂质峰渐渐显现。C溶剂峰压制 Bruker官方给出的标准脉冲中并没有碳溶剂峰压制实验，所以我自己编了一个碳溶剂压制脉冲，依然是拿我们的“标准化合物”下手。不过这一实验在我们高浓度的样品峰下除了能让谱图看起来更加直观，并没有任何效果。但是可以预计，在稀浓度的样品中，这一实验将会有它的用武之地。H-H COSY(DQF) H-H COSY给出的是相邻质子间的耦合关系，是一种非常重要的二维实验。 与之前所介绍的HSQC不同在于，H-H COSY的横向(F2维)和纵向(F1维) 表征的都是质子的化学位移，这使得这类谱图呈现与对角线呈对称分布的相关峰(因为耦合作用是相互的，Ha对Hb的耦合等于Hb对Ha)。这一性质在谱图处理中十分有用，后面我会提到经过对称化处理的COSY谱图给出的耦合信息是恐怖的！这类谱图的解谱类似于HSQC，在相关点的横纵两个方向对应的质子存在耦合关系。图中对角线我用红线标示，由于对角峰是同一质子相关，因此并没有任何实际用处，相反由于这部分信号很强常常会严重干扰到化学位移相近的相关峰之间的指认(如图中的6-8 ppm)。早期的相敏COSY实验需要做很好的相位校正来减小对角峰的影响，而DQF-COSY通过过滤掉单自旋的信号使得沿对角峰附近谱图的解释变得更为容易。因此通常而言，如不特殊说明，目前的COSY实验通常为DQF-COSY。 关于二维谱图，我想单独插一句，由于单次采样时间较短以及仪器本身固有的缺陷，COSY等常见的二维谱的信噪比往往比一维要低，虽然可以通过一些软件处理突出我们希望看到的信号，但信号与噪音的区别往往伴随着二维解谱的整个过程。核磁操作人员对于这一点的体会要比解谱人员深刻的多，很多时候谱图一些重要信号的“出”与“不出”只在操作者鼠标滚轮的毫厘之间。我以上图F2维4-10 ppm，F1维2-8 ppm单独放大如下： 在左图的阈值调节下，环上质子之间的耦合关系较为清晰，但其与甲基以及亚甲基之间的相关信息远少于右图相应部分；但右图的阈值调节导致了环上质子相关信号过强而相互干扰，在5-6 ppm之间出现了假信号。由于核磁人员通常为了照顾整张图的信号而必须做出阈值的取舍，因此解谱人员掌握对二维谱图原始数据(topspin的ser文件)的简单处理还是很有必要的。 另一方面，H-H COSY信号的对称性使得对称化处理在谱图的“去伪存真”方面发挥着很重要的作用。以6.6-7.6 ppm的谱图对称化处理前后为例： 从图中可以看到，对称化处理将拥挤的“迷雾”拨开，显露出H6与H9之间的J5耦合关系(这与之前J分辨谱的结果一致)，此外，H2与H7之间的J6耦合亦得以显现！在大共轭体系下，这类超长距离的耦合关系在COSY中并不罕见。 最后这张图体现了H-H COSY在H归属中的作用：高场氢与H2较强的相关信号暗示了这一氢可能与H2键隔更短而有较大可能为H10。随后给出的HMBC结果更是增强了这一判断。C-H COSY(HETCOR) 与H-H COSY不同，这一实验给出的是C-H直接相关的信息，类似于HSQC或HMQC。但与后者的区别在于，这一实验没有采用反向检测技术，直接采集的是C的信号，因此C维分辨率一般要好于HSQC，但却要付出更多扫描时间的代价。下面给出同一范围内的C-H COSY与HSQC谱图。 很明显可以看到，两种实验在C维和H维分辨率上各有优势，但因为灵敏度的原因，采用反向检测的HSQC在H-C一键关系的指认上用的要广泛的多。TOCSY TOCSY又称全相关谱(Totally Correlation SepctoroscopY)，给出的是某一自旋体系内所有核之间的相关信号。 TOCSY在解谱上与H-H COSY没有任何区别，沿对角峰对称分布着质子之间的相关信号。但不同在于，COSY的相关峰需要质子间有直接的耦合作用，但TOCSY中的相干峰来源于接力相干转移，简而言之在参数设置合适的情况下，TOCSY能比COSY反应相隔更多键的质子之间的关系前提是这些质子必须在同一自旋体系下。TOCSY的这一奇特性质来源于一种称为“自旋锁定”的脉冲，这一脉冲通过混合期长时间的照射将宏观磁化矢量锁定在y轴从而使得磁化矢量沿着自旋核一个个传递下去：混合期自旋锁定时间越长，相干传递的越远，但弛豫引起的整体信号损失也越大因此混合时间并不是越长越好。 遗憾的是，这一化合物中TOCSY与COSY相比优势并没有很好地体现出来(之前对称化处理后的COSY过于“霸道”而将TOCSY的信号都出全了，大家有兴趣可以自己做下归属)，为了更好地解释TOCSY与COSY的不同点，请允许我引用一书的两张图做一个简单阐述： 假设有AMX与AMX两个三自旋系统，巧合的是M与M的化学位移恰好重叠，由于COSY只能体现A-M,M-X及A-M,M-X的直接耦合，导致COSY谱无法将这个自旋体系区分开来；但TOCSY的相干传递将A-X及A-X这块“拼图”补全，从而将两个自旋体系完美地剥离。 最后补充说明的一点是，由于TOCSY与之后要提及的ROESY脉冲序列形式相同(仅自旋锁定时间和锁定脉冲有所区别)，导致在两者之间偶尔夹杂彼此的信号。而ROESY又与EXSY(化学交换谱)相同，因此图中COSY本没有出现的H1与H12的信号，有可能是NH2与NH活泼氢相互交换，也可能是两者在空间上相互靠近导致。二维实验的参数设置以COSY为例简单讲一下解谱人员感兴趣的二维实验参数设置部分。TD2：即图中上数第一个TD是F2维采样维度的采样点数，取值大，F2维fid分辨率就越大。二维实验中这一值的变化对实验时间影响不大，但通常而言没有必要取太大值。NS：累加次数。这一值仅作用于采样维值越大，信号信噪比越大，对于NOESY,HMBC这类信噪比比较低的实验可以通过增加NS值使原先不出的信号出现。但NS的大小直接关系到实验时间(NS加倍，实验总时间加倍)。DS：空扫次数。普通一维实验中同样有空扫次数的设定，但是在二维实验中往往更为重要。适当的空扫能使系统在正式采样前进入相对平衡的状态。SWH：谱宽。F2维和F1维有各自的谱宽，其取值将直接决定实验观测的谱图范围。TD1：图中第二个TD是F1维间接维的采样点数。这是二维实验所特有的参数，其取值直接影响F1维的分辨率。由于TD1和NS一样直接影响到实验时间，因此通常限于时间并不能取太大数值。但有些时候，当F1维峰之间化学位移相近时，为了做出正确判断，增加TD1是必须的。FnMODE：这是间接维的采样模式。常见的QF采样使得二维谱的峰相位不可调。总体而言，在直接采样维度(F2维)二维谱的TD,NS,DS,SWH等参数与一维谱意义相同，但间接维的一些参数有其特有的意义。HSQC-TOCSY 核磁的发展总是迅速得让人惊喜，当我们还在为TOCSY的接力传递赞叹不已时，一种被称为HSQC-TOCSY的二维实验已然将这一系列又推进了一步。与TOCSY相比，HSQC-TOCSY能够在C的维度将原先重叠的信号分开(相较于H,C的谱宽范围很大)，在应对大分子化合物时，这一技术有着相当实用的功效。 如图所示，横向F2维与TOCSY相同，而相关点的纵向F1维是与F2质子处在同一自旋体系中的H直接相连的C的信号。这么说可能有些拗口，结合下面这张图可能更为形象一些。 图中与C直接相连的H经过TOCSY接力传递，将整个自旋体系内的质子与C关联了起来。而这一传递被没有与H相连的C及杂原子(N)所阻断。但这只是理论上的情况，实际操作中我们经常可以看到这一传递会越过这些核传的更远，如本例中的H6与C9。 为了便于说明HSQC-TOCSY在重叠峰辨认方面的优势，我将7.0-7.3 ppm处的信号放大如下： TOCSY中H2与H10,H11的远程耦合由于后者化学位移的相近而无法区分，但在HSQC-TOCSY中C10与C11在碳谱上完全分开，使得相应的信号不再重叠而变得清晰可辨。在应对复杂结构的化合物时，这一技术会显得更为重要。 需要注意的是，HSQC-TOCSY实验中除了TOCSY信号外，HSQC信号以及少量的HMBC信号会干扰谱图的解析(如图中很强的H2-C2信号)。为了排除这部分的干扰，需要结合HSQC实验做出判断。-celan 语：LZ说：需要注意的是，HSQC-TOCSY实验中除了TOCSY信号外，HSQC信号以及少量的HMBC信号会干扰谱图的解析(如图中很强的H2-C2信号)。为了排除这部分的干扰，需要结合HSQC实验做出判断。LZ的强调对初次应用HSQC-TOCSY的朋友很重要也很贴心。我也有这样的体会。有时HSQC-TOCSY不是一次就能满意的，建议LZ谈谈设置mix time的经验。请继续精彩！_ 谢谢汪老师的鼓励，其实对于稍微复杂的实验我也经常是摸着石头过河。不过对于HSQC-TOCSY而言，有一种称为HSQC-TOCSY(edit)的谱图能够将HSQC信号与TOCSY信号分开。 与之前的HSQC-TOCSY谱图相比，edit实验将两种信号以相反的相位区分，即使同为HSQC信号，根据C连接H个数的不同，相位也不相同。如图中6-8 ppm处的CH以及甲基的CH3在图中的HSQC信号以黑色表示，而TOCSY信号为红色；但2-3 ppm中亚甲基的HSQC却是红色，TOCSY则为黑色，HSQC的规律与DEPT135相同。 对于HSQC-TOCSY实验的混合时间对谱图杂峰的影响，我没有比较过，不过至少我觉得有和TOCSY实验相似的效果混合时间（即自旋锁定时间）越长，信号传得越远但整体信号越弱，具体取值要看实验人员的需要。不过我一般用默认的60ms，下次有机会再做一个系列看下对HSQC-TOCSY的影响。一书中对于混合时间的不同取值对线性4自旋体系在TOCSY中各峰强度的影响有一张不错的比较图，我借过来用一下。其中横坐标是混合时间，纵坐标是各自旋核的信号相对强度。 不过NOESY及HSQC-NOESY 的混合时间取值倒有一个优化的方案，一般与分子的T1时间大致相当。这一版块【分享】NOESY实验的参数优化 贴中讲的较为详细。一维选择性TOCSY 作为TOCSY的1D版本，这一实验能在很短的时间内，通过选择性脉冲，观测到与激发峰相关的H-H远程耦合信号。 如图所示，红色箭头所标示的是选择性激发的核，随着自旋锁定下接力相干传递，相关峰在谱图上以正相位显现出来。在混合时间相同的情况下，实验结果与2D实验一致。需要注意的是，当激发的H与相邻峰靠的比较近时，需要调节选择性脉冲的激发范围来避免“误伤”。 1D实验极大地缩短了实验时间(尤其在之后要提到的NOESY中)，专一地提高了感兴趣信号的信噪比(与2D相比，NS可以设的很大)，在不需要得到结构所有相关信号的情况下发挥着比其2D版本更为实用的作用。HMBC H-C HMBC实验给出的是H-C多键耦合的信息。这一谱图的解谱方式与之前介绍的H-N HMBC相似：横向F2维为H，纵向F1维为C，相关点表示F2与F1维的H-C之间J2以上的耦合关系，作为最常见的二维实验之一，H-C HMBC在结构指认上极为重要。 上图为常规HMBC，如果不特殊说明，核磁人员一般给大家的是这种谱图。这种谱图有一个需要注意的地方，由于脉冲中并没有过滤掉CH一键耦合信号，因此在C14所在的F1维化学位移处，沿着H14会对称出现两个小点，两点之间的距离为J1CH的大小(图中145HZ)。这一特征在各氢化学位移离的较远时不会造成太大影响，甚至还能附带给出CH耦合常数，但一旦各H化学位移相近甚至重叠将会对解谱造成一定影响，如图中局部放大的6-8 ppm处，红线连接的即为CH耦合所造成的对称峰，有一些已经与远程耦合的信号叠加在了一起。 因此，我平时更喜欢用一种能去除一键耦合干扰的HMBC实验。HMBC(J-filter) 与普通HMBC相比，J-filter后的谱图显得更为清晰(注意，只是J1的相对强度变弱了，有些时候还是能看到部分逃过筛子的J1信号，此时要注意区分)。下面我以上图局部为例说明HMBC在结构指认上的作用。 结果如图。可以看到，HMBC使之前较难判断的H10与H11有了新的线索：高场的H由于与C2与C4的远程耦合而更接近于H10。之前在H-N HMBC中已经讨论过，HMBC系列对J3经常表现出比J2更大的”偏好“，而J4，J5由于耦合值相似而无法在HMBC上做出明确判断，因此在解HMBC时要较为灵活不能过于教条，要结合多方面的信息做出最为合理的判断。 最后提一点，有一个与需要观察的CH远程耦合值相关的参数对HMBC的实验优化十分重要。比如想要看多键耦合关系，就把这个值调小一点，但这样也将付出整体信号降低的代价。以后有机会我会单独就这个化合物在此参数不同取值下的谱图做一个专帖说明。1D-INADEQUATE 其实对判定结构而言，C核比H核更为重要，因为C是构成有机物的骨架，而H只是骨架上生出来的枝叶。遗憾的是，98.9%的C12由于自旋为0而不能被核磁检测到，而余下1.1%的C13因为旋磁比仅为H的1/4以及较长的弛豫时间导致核磁学家最终将H作为核磁实验中最重要的核。但C核绝没有被忽视。 之前已经提过，为了得到占C元素1.1%的C13信号，需要付出比H核多出数千倍的扫描时间。那么C-C相关信号呢？这个问题等价于分子中两个C13正好挨在一起的几率为多大1.1%的平方。也就是说，10000个分子中只有一个分子某两个C13正好相邻，而要观察到这一个分子的CC相关，难度不仅在于如何“万里挑一”将这个很弱的信号采集出来，更在于如何“以一敌万”排除余下9999个分子大军的信号干扰。而描述这一问题的实验，科学家称之为INADEQUATE。 先给出这一结构的1D-INADEQUATE谱图。与2D相比，1D时间所花费的时间要少的多，但即使如此，这张谱图依然花费了我数小时的时间(还是在样品很浓的情况下)。由于脉冲演化的关系，1D-INADEQUATE实验中的信号常以反相位双重峰来呈现(其实稍微修改一下脉冲就可以实现相位同一化，但是我觉得这样反而不利于谱图解析)，这是因为不管碳链多长，我们观察到的C-C相关通常就是一键相关(三个C13恰好相连的概率有多大？)，而双重峰的波峰与波谷间距离是CC耦合常数，但遗憾的是，在1D-INADEQUATE中要分辨这一信号并不容易。 大家或许还记的之前在H归属中对于H10以及H11的归属曾经一度出现困难HNMR中N14核四极矩造成的展宽以及H-N HMBC中相关信号的强弱都支持将高场H定为H11，但HMBC,COSY都明确给出了与之相反的结论。其实从C-C角度上来看这个问题会简单很多C11仅受C10耦合，而C10却要受到C11和C3的耦合作用。图一中C10能明显读出49HZ的耦合作用，而红线标出的37HZ的反相位峰显得很弱，需要注意的是，在两个反相位双重峰中间位置出现的峰并不是三重峰，而是没有压制完全的C13单峰。 图二给出的C11峰信号较弱，这可能是与之直接相连的N14所引起，34HZ的耦合值暗示着C10与C11的耦合关系。C3由于与C6与C7相互重叠，耦合变得难以辨认，使这一实验在解决C归属问题上不够严密，而我之后讲到的选择性1D-INADEQUATE将解决这个问题。SELINA 被称之为SELINA的选择性1D-INADQUATE实验通过软脉冲照射特定核(其实照射的是某一C13的两个C13卫星峰)来观察与之相连的C13信号。 图一为普通碳谱。 图二为照射C11后的谱图，与C11相连的C10呈现反相位双重峰，双重峰的中间位置正好是图一中C10的化学位移。 图三在照射C10后除了出现C11的反相位峰外，远处的C3亦被激发(为了使信号更明显，这里我没有校正C3的一级相位)。 图四中对C3的激发，使与之相连的C10得以呈现。 四张谱图均给出了CC耦合常数，连接关系一目了然。2D-INADEQUATE 2D-INADEQUATE才是真正“inadequate“的实验，但是却能给出最完全的C-C耦合信息。这一实验巧妙地将本不能观察到的双量子相干转化为能被看到的单量子相干，但“积化和差”后F1维的谱宽也随之成为F2维的2倍。与之前介绍的二维谱不同，这一谱图的对角线方程是1=2*2，相关信号沿着这一奇特的对角线对称分布在本实验中直接相连的碳出现在同一横行的蓝色对角线两边，图上我已经给出了标示。限于时间原因(扫了整整一个晚上)，谱图的信噪比并不足以观察到所有C-C耦合，但即使如此，我们已经可以从图上明确看到之前关于C10，C11，C3归属的证据，大家可以自己体会一下。 有意思的是，2D实验中对称信号强度并不相同，这给了我如下启发：可以尝试着将图中没有