酶工程在制药领域应用.doc

酶工程在制药领域的应用摘要 酶工程是现代生物技术的重要组成部分，它作为一项高新技术将为各工业的发展起重要推动作用。介绍了酶固定化、基因工程菌(细胞)的固定化、植物细胞培养产酶、酶的化学修饰、核酸酶、抗体酶、酶标药物的理论和技术研究的最新进展以及酶工程在医药工业中的应用，对酶工程的发展前景进行了探讨。关键词 酶工程；酶的固定化；核酸酶；抗体酶；医药；应用中图分类号： 文献标识码：A1 酶工程技术1.1 酶和细胞的固定化将酶或细胞通过物理或化学方法固定在水溶性或非水溶性的膜状、颗粒状、管状的载体上，称为固定化酶或固定化细胞。我国研制过的固定化酶（细胞）已有50种左右，分为三种类型：固定化单酶或含特定酶的细胞、固定化双酶、固定化各类激酶构成ATP再生系统。一般能明显地提高酶对热与酸碱度的稳定性。固定化的方法主要有吸附、共价结合、包埋和选择性热变性等。目前又发展了利用光、辐射等物理技术和定点固定化技术固定酶1在制药工业中包埋法应用较多，其次是吸附法。固定化细胞包括微生物细胞（含基因工程菌）、动物细胞和植物细胞，目前更多地注重活细胞和增殖细胞的固定化。植物细胞固定化大多采用包埋法，至今已报道了固定化南洋金花、烟草、胡萝卜等十多种细胞的研究，植物细胞固定化技术在中药有效成分的生产应用研究上有更好的前景。动物细胞只有吸附和包埋法得以成功。目前动物细胞微囊化法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）法，细胞生长密度可达108-109个mL-1 。微囊化细胞主要有两方面的应用：培养微囊化动物细胞生产一些药物；作为药物直接用于治疗或作为药物筛选之用，如用来生产单克隆抗体、干扰素、组织纤溶酶原激活剂（TPA）、白细胞介素、胰岛素生长因子和乙肝病毒表面抗原等。未来将有一大批具有生物活性的蛋白质可依靠固定化细胞在生物体外大规模的合成。应用基因重组技术将生物细胞中存在极少的催化某一生化反应的酶通过基因扩增和增强表达，建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞，从而进一步构建成固定化工程菌或固定化工程细胞的新一代催化剂。如德国BM 公司应用蛋白质工程技术对表达青霉素酚化的基因进行点突变改造，重建了青霉素酚化酶工程菌，从而大大延长了固定化青霉素酚化酶的使用半衰期 其酶柱可连续使用700d以上2 。1.2 酶的化学修饰酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某部分删除或置换，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的。修饰剂的选用和修饰方法分为：（1）修饰酶的功能基团如氨基、羟基、咪唑基等可离解基团，如抗白血病药物天冬酚胺酶3；（2）进行酶分子内或分子间交联，应用某些双功能试剂分子两端的功能基团可使酶分子内或分子间肽链的两个游离氨基分别发生交联，如交联后的人-半乳糖昔酶A，其热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显提高；（3）酶与高分子化合物结合后，可以增加酶的稳定性活力。例如抗白血病药物天冬酚胺酶经游离氨作用、酚化反应进行修饰后，在血浆中的稳定性有很大提高；胰凝乳蛋白酶与水溶性大分子化合物右旋糖酐结合后，其催化活力提高4倍4。常用修饰剂主要有乙酸酐、氮芥类、磷氧酰氯、环氧丙烷、重氮盐类、羟胺等5。1.3 核酸酶和抗体酶核酸类酶(Ribozyme)是一类由核糖核酸(RNA)组成的酶，具有核酸序列的高度特异性，从而具有很大的应用价值。只要知道某种核酸酶的核苷酸序列，就可以设计合成催化其自我切割和断裂的核酸组成，根据这些基因组的全部序列，就可以设计并合成出防治由这些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核酸酶，如能够防治流感、肝炎、艾滋病和烟草花叶病等。核酸酶也可以治疗某些遗传病和癌症，还可以用作研究核酸图谱和基因表达的工具4。抗体酶（Abzyme）又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子，可以采用诱导法和修饰法获得。抗体酶已经用于酶作用机理的研究、手性药物的合成和拆分、抗癌药物的制备4等。1.4 酶标药物近来，人们可以根据药物在生物体内可能的作用目标如（酶或受体）来设计药物，由此获得的药物被称为酶标药物。目前，这种设计方法已成为药物设计的主流，在新药设计中发挥了巨大作用。血管紧张素肽转换酶（ACE）抑制剂是酶标药物的一个成功的实例，ACE抑制剂已经成为重要的常用降压药物。近来的研究发现，艾滋病的感染和传播，主要是由艾滋病病毒颗粒表面的蛋白酶引起的。因此，艾滋病病毒蛋白酶的研究成为一个热点，人们希望通过对艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的研究，寻找出防止艾滋病病毒感染和治疗艾滋病的方法6。1.5 植物细胞培养产酶首先选择适宜的植物外植体，经诱导、选育得到优良的植物细胞，再在人工控制条件的生物反应器中培养植物细胞，以生产色素、香精和药物等次级代谢物。植物细胞培养不受地理环境和气候条件等的影响，具有生产周期短、产率高等显著特点，已经发展成为生物工程研究和开发的重要领域。郭勇7先后进行了植物细胞培养生产次级代谢物的研究，选育出了优良的木瓜细胞、大蒜细胞、鼠尾草细胞、玫瑰茄细胞、黄花蒿细胞、胡萝卜细胞、巴戟天细胞和银杏细胞等，分别用于生产木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等药用酶以及色素、药物等次级代谢物。曾庆平等8在国内外首次采用植物细胞培养技术，从木瓜外植体的木瓜细胞中经细胞培养生产木瓜凝乳蛋白酶。该成果已申请中国发明专利。2 酶工程技术在医药工业中的应用现代酶工程具有技术先进、投资小、工艺简单、能耗粮耗低、产品收率高、效率高、效益大和污染小等优点，成为化学、医药工业应用方面的主力军。以往采用化学合成，微生物发酵及生物材料提取等传统技术生产的药品，皆可通过现代酶工程生产，甚至可获得传统技术不可能得到的昂贵药品，如人胰岛素、McAb、IFN、6-APA、7-ACA 及7-ADCA 等。固定化基因工程菌、工程细胞以及固定化技术与连续生物反应器的巧妙结合，将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本性变革。2.1 应用酶工程制备生物代谢产物应用固定化细胞可大量生产各种初级或中间产物，如糖、有机酸和氨基酸等。产品有D-葡萄糖、D-果糖、甘油、1 6-二磷酸果糖、柠檬酸、苹果酸、富马酸、乳酸、右旋糖酐、丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸等。利用酶工程技术生产抗菌素、色素、生物碱、性引诱剂、信息素等生物次级代谢产物，典型的产品有6-氨基青霉烷酸（6-APA）7-烷基头孢烷酸（7-ACA）及7-氨基脱乙酚氧头孢烷酸（7-ADCA）麦角生物碱、羟化孕酮、可的松和肉瘤碱等。我国用固定化大环内酯-4-丙酯化酶将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素，用固定化生产米卡链霉菌突变菌株也可完成产品的转化。2.2 应用酶工程技术转化甾体利用微生物酶工程技术不仅研究提高某一步转化反应的专一性和收率或寻找某一转化反应代替某一个用化学合成法难以进行的反应，而且进一步综合应用了酶抑制剂、生化阻断突变株和细胞通透性的改变等生物技术从而制得了雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）、雄甾-4-烯-3，17-二酮（4AD）和3-氧联降胆甾-1，4-二烯-20酸（BDA）等关键中间体，使复杂的天然资源经过几步反应就合成了各种性激素和皮质激素。应用固定化微生物细胞技术可生产强的松、11-去氧强的松、氢化可的松、-胆舀烯酮 -雄二烯-3，17-二酮等甾体化合物。2.3 应用酶工程生产抗生素应用酶工程可以制备6-APA（青霉素酚化酶）、7-ACA（头孢菌素酚化酶）、头孢菌素IV（头孢菌素酚化酶）、7-ADCA（青霉素V酚化酶）、脱乙酚头孢菌素（头孢菌素乙酸酯酶，近年来还进行固定化产黄青霉青（霉素合成酶系）细胞生产青霉素的研究，合成青霉素和头孢菌素前体物的最新工艺也采用酶工程的方法。2.4 应用酶工程生产氨基酸和有机酸生产DL-氨基酸（氨基酚化酶）、L-赖氨酸（二氨基庚二酸脱羧酶或氨基-己内酚氨水解酶和消旋酶、尿酐酸（L-组氨酸氨解酶）、L-酪氨酸及L-多巴（B-酪氨酸酶）、L-天冬氨酸（天冬氨酸合成酶）、L-苯丙氨酸（L-苯丙氨酸氨解酶）、L-谷氨酸（L-谷氨酸合成酶）、L-丝氨酸（转甲基酶）、L-色氨酸（色氨酸合成酶）天冬酚胺（天冬酚胺合成酶）、谷肌甘肽（复合酶系）-氨基丁酸（谷氨酸脱羧酶）、谷氨酚胺（谷氨酚胺合成酶）等氨基酸。生产乳酸（乳酸合成酶系）葡萄糖酸（葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶）、 L-苹果酸（延胡索酸酶）、长链二羧酸（加氧酶和脱氢酶）衣康酸（复合酶系）L（+）-酒石酸（环氧琥珀酸水解酶）等有机酸。2.5 应用酶工程生产维生素制造2-酮基-L-古龙糖酸（山梨糖脱氢酶及L-山梨糖醛氧化酶）、肌醇（肌醇合成酶）、L-肉毒碱（胆碱酯酶）、 CoA（CoA 合成酶系）等。 由山梨醇和葡萄糖生产维生素及丙烯酚胺的生产也采用酶工程的方法9。2.6 应用酶工程生产核苷酸类药物腺嘌呤核苷酸（AMP）由产蛋白假丝酵母菌体用热水提取核酸，再经核酸酶水解制得。脱氧核苷酸由鱼白提取脱氧核糖核酸（DNA）后，经5-磷酸二酯酶酶解制得。先由富含核酸的动植物（花粉等）提取核糖核酸（RNA）再用5-磷酸二酯酶酶解为磷酸腺苷（AMP）、磷酸胞苷（CMP）、磷酸尿苷（UMP）及磷酸鸟昔（GMP）制得混合核苷酸。肌苷酸由腺苷脱氨酶制得。ATP和AMP分别由氨甲酰磷酸激酶、激酶加乙酸激酶制得。3 应用酶工程生产手性药物在生产小分子的药物及中间体时，酶工程和传统的化学方法最显著的区别就是非常有效地不对称合成手性化合物。手性是生物体的基本特征，手性药物是指有药理活性的光学纯化合物，体内许多内源性化合物，包括与药物发生作用的天然大分子都具有手性。人体的手性环境可以识别手性药物对映体，使对映体的药代动力学和药理学出现差异。不同手性的药物作用于生物体时，它们所起的作用是不同的，在活性、代谢过程及毒性等方面存在显著差异。正是基于这一原因，开发单一对映体形式的合成药成为近几年的研究热点。3.1 应用脱氢酶Bommarius等10利用亮氨酸脱氢酶，以不同的酮酸为底物合成了一系手性列氨基酸。在这一方法中，辅助因子通过甲酸脱氢酶再生。Omapatrilat酶的抑制剂，临床上可用于治疗高血压。L-6-羟基己氨酸是用于合成Omapatrilat的手性中间体，分别以氨基酸氧化酶和谷氨酸脱氢酶为催化剂，通过两步反应可将外消旋-6-羟基己氨酸转化为L-6-羟基己氨酸，转化率为97%，对应体过量（e.e值），大于98%11。3.1应用过氧化物酶 佳息患是HIV-I蛋白酶抑制剂，临床上用于爱滋病的治疗!生产佳息患的一个关键中间体反-1S,2R-氨基茚醇能以手性的-1S,2R-环氧茚为前体合成，而以Curvularia protuberateMF5400中的溴过氧化物酶和脱氢酶为催化剂，可直接将茚转化为-1S,2R-环氧茚12。内酯化合物是重要的手性构架。Stewart等13将Acinetobacter NCIB 9871中的环己酮单加氧酶在面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)中进行表达，并以该酵母全细胞为催化剂催化不对称的拜尔-维利格氧化反应，合成了一系列的内酯化合物。4 小结酶工程作为生物工程的重要组成部分，其作用之重要、研究成果之显著已为世人所公认。充分发挥酶的催化功能、扩大酶的应用范围、提高酶的应用效率是酶工程应用研究的主要目标。 21世纪酶工程的发展主题是：新酶的研究与开发、酶的优化生产和酶的高效应用。除采用常用技术外，还要借助基因组学和蛋白质组学的最新知识，借助DNA重排和细胞、噬菌体表面展示技术进行新酶的研究与开发、目前最令人瞩目的新酶有核酸类酶、抗体酶和端粒酶等。要采用固定化、分子修饰和非水相催化等技术实现酶的高效应用，将固定化技术广泛用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究使酶工程技术在医药工业中发挥更大的作用。5 参考文献1 邓红涛 吴健 徐志康 等.酶的固定化及其应用的研究进展 J .膜科学与技术 2004 24 3 48-53.2 吴梧桐.酶工程技术的研究及其在医药领域的应用 J .药学进展 1994 18 3 129-134.3 王正祥 刘吉泉 诸葛健.微生物酶的分子改性和人工进化的研究进展 J .生物工程学报 2000 16 3 301-303.4 郑成.酶工程的研究进展简述 J .韶关学院学报 自然科学版2001 22 6 39-44.5 居乃琼.21世纪工程研究的新动向 J .工业微生物 2001 31 137-45.6 马晓建 白净 任呵 等.酶工程研究的新进展 J .化工进展2003 22 8 813-817.7 郭勇.酶工程研究进展与发展前景 J .华南理工大学学报 自然科学版 2002 30 11 130-133.8 曾庆平 郭勇.植物细胞对环境胁迫的适应性应答I.水杨酸对大蒜培养细胞中超氧化物歧化酶的增效诱导 J .应用与环境生物学报 1999 5 2 152-159.9 穆小民 吴显荣.酶的开发利用与酶工程 J .生物技术 1995 54 5-8.10Bommarius A S，Schwarm M，Drauz K.Biocatalysis to amino acid-based chiral phar