分光光度法测定胆固醇含量.doc

实验八、分光光度法测定胆固醇含量一、实验目的1、学习721分光光度计的使用2、掌握分光光度法测定胆固醇含量的原理3、学习并掌握利用分光光度法制作胆固醇含量标准曲线的方法二、实验原理当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液。假设入射光强度为I0，透过光强度为It，溶液的浓度为C，液层宽度为b，则TI0It（透光度或透光率） （朗伯比尔定律的数学表达式）式中：A为吸光度，没有单位K随C、b的单位而不同 C：g/L, b : cm , k: L/gcm ,为吸光系数；C：mol/L, b : cm , k: L/molcm ,为摩尔吸光系数以上式子表明：当一束单色光通过有色溶液时，其吸光度与溶液浓度及宽度成正比。当k、b都一定时，A与C成正比，因此若已知浓度溶液（即试样溶液）的吸光值As，在相同条件下测出未知浓度溶液的吸光值Ax，则试样溶液的浓度Cx可通过下式求出：（标准对照法，适用于非经常性的分析工作）若是经常性的批量测定，则应用标准曲线法，即配制一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处，用同样的比色皿分别测其吸光值。作出“吸光值/含量”的标准曲线，在相同条件下测定未知浓度试样的吸光值，直接可从标准曲线上查出相应的浓度。三、实验药品及仪器药品: FeCl36H2O ，磷酸(A.R. 即“分析醇”) ， 浓硫酸（A.R.）， 胆固醇（C.P.）， 无水乙醇。试剂：10三氯化铁溶液：10g FeCl36H2O溶于磷酸，定容至100ml，存棕色瓶中，冷藏磷硫铁试剂（P-S-Fe试剂）：取1.5ml 10三氯化铁溶液于100ml棕色容量瓶加浓硫酸至刻度。胆固醇标准溶液（0.08mg/ml）：称取80mg胆固醇溶于无水乙醇定容至100ml，配制成10的标准贮存液。10贮存液用无水乙醇稀释10倍，即为胆固醇标准溶液。 仪器：721分光光度计 ， 比色皿 ， 试管 ， 移液管四、仪器使用（721分光光度计）1.接通仪器电源开关，打开比色皿暗箱盖，选择所需的单色光波长,预热20分钟；2.将盛溶液的比色皿装入暗盒中（一般装空白溶液的比色皿放在第一格，装待测溶液的比色皿放在后面）3.打开比色皿暗箱盖（光门自动关闭），调节“0”电位器，使电表指针指“0”（透光率为0），然后将盖子盖上（光电管受光），这时空白溶液的比色皿须正对于光路上，调节“100”电位器，使电表指针指在“100”（透光率100%），若调不到100，可提高灵敏度。4.连续几次调“0”和“100”后，就可以进行测定。测定时，将比色皿拉杆轻轻拉出一格，使第二个比色皿内的待测溶液进入光路，此时指针所指的读数就是该溶液的吸光度。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。5实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净。注意事项：1.读数时，视线要正对着指针，表上两排数据不要读错，小数点也不要读错！2.放大器灵敏度有五档，“1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100”情况下，尽可能采用低灵敏度，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后须重新调“0”和“100”。3.拿比色皿时用手捏住毛玻璃两面，切不可触摸光面。每次使用完毕，应洗净，滤纸吸干，不可用碱液和强氧化剂洗比色皿，避免腐蚀玻璃或使皿粘结处脱胶。4.比色皿放入比色皿架前，须用擦镜纸吸干外壁的水珠。五、实验内容1、配制10三氯化铁溶液、磷硫铁试剂、胆固醇标准溶液2、打开721分光光度计预热20分钟3、取6根试管，编号1-6， 各管分别加入0.08mg/ml胆固醇标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，以无水乙醇补足至2.0ml，然后1-6管均各加入2.0ml磷硫铁试剂，摇匀。10分钟后分别转移到0.5cm光径的比色皿内，用721分光光度计在560nm波长的单色光下，先用1号管的空白对照调“0”和“100”，然后同等条件下分别测定2-6管的吸光值 A，记录数值。 4、算出各管胆固醇的实际浓度（单位：mg/ml）,然后以胆固醇浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，作标准曲线。 备注:各管胆固醇实际浓度C的计算公式C实际=胆固醇标准液原浓度移取的胆固醇标液体积V各管总体积 =0.08 V（胆固醇体积）4 (单位为:mg/ml )六、实验数据记录管号0.08mg/ml胆固醇标准液体积V（ml）无水乙醇体积（ml）磷硫铁试剂体积（ml）各管总体积 (ml)各管胆固醇实际浓度C实际(mg/ml)各管吸光值A102.02.04.020.41.62.030.81.22.041.20.82.051.60.42.062.002.0用坐标纸画出标准曲线（1）胆固醇的生理功能：参与血浆蛋白的组成；细胞膜的结构成分；胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等的前体。（2）临床意义：血清中总胆固醇的浓度可作为脂类代谢的指标，但脂类代谢又常与糖类及激素的代谢密切相关，故在其他物质代谢异常时亦可影响血清总胆固醇的浓度。胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，主要来自体内合成，一部分直接从食物中摄取。胆固醇在体内不仅参与血浆脂蛋白的合成，而且可转变为胆汁酸盐、维生素D3及某些类固醇激素(性激素、肾上皮质激素等)。血液中的胆固醇包括游离胆固醇及其酯两种，二者总称“总胆固醇”，其中胆固醇酯占7075%。糖尿病昏迷患者几乎都有血清胆固醇浓度的增加。胆固醇增加还见于动脉粥样硬化、肾病综合症，总胆管阻塞及粘液性水肿。粘液性水肿胆固醇增加的主要原因是甲状腺机能减退而垂体前叶有继发性活动过度所致。其它如肥大性骨关节炎、老年性白内障、牛皮癣等，血清胆固醇浓度间或也有增加。在恶性贫血、溶血性贫血以及甲状腺机能亢进时，血清胆固醇含量降低。其它如严重肝病、感染、营养不良等情况，胆固醇总量常见降低。近年来大量文献报导表明，血胆固醇含量过高与动脉粥样硬化的发病机制有关，更引起了人们的注意。增高常见于：甲状腺功能减退、动脉硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病及高脂血症等；糖尿病患者，特别是并发糖尿病昏迷时几乎都有总胆固醇升高；慢性肾炎肾病期、肾病综合征、类脂性肾病等；胆总管阻塞(如结石、肿瘤)时，总胆固醇增高且伴有黄疸，但胆固醇酯与总胆固醇的比值仍正常；长期高脂饮食、精神紧张或妊娠期，总胆固醇也可升高。降低临床可见于：严重的肝脏疾病患者，如急性肝坏死或肝硬化时，血清总胆固醇降低，胆固醇酯与总胆固醇比值也降低；严重的贫血病人，如再生障碍性贫血、溶血性贫血、缺铁性贫血等，因骨髓及红细胞合成胆固醇的功能受到影响，血清总胆固醇降低；甲状腺功能亢进或严重营养不良时，总胆固醇降低。（3）参考值：成人胆固醇 2.86-5.98mmol/L (110-230mg/d1) 儿童胆固醇 3.12-5.2mmol/L (120-200mg/d1)722型分光光度计的使用（1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。（为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。）（2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。（3）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。（4）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。（5）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。（6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测