F488-95水中细菌总数的试验方法.doc

编号：F 488-95水中异养细菌现场筛选的标准试验方法1. 适用范围1.1 本筛选试验方法涉及用特殊设计的工业仪器检测和计算水样中的细菌。本试验方法只适用于计算在特定试验条件下（例如：介质、温度、时间等）有生存力的细菌。但不适用于厌氧菌的检测。1.2 没有能够计算一个样品中所有的有生存力的细菌数量的细菌培养技术，因为细菌通常是以单一、成对、链状、或群落形式存在，并且没有任何一组生长条件或介质能够满足样品中所有细菌的生理要求。因此，本试验方法不能提供总体细菌的计算，但是能够努力去实现样品中的有生存力的需养细菌和兼性需养细菌的计算。1.3 本试验方法适用于样品或样品稀释液中培养细菌数量每毫升10-160个的操作。1.4 本试验方法设计用于在细菌生物实验室还未准备就位的情况下作为一个简化的现场试验方法。1.5 本标准对所有的安全事项不做阐述，如果有，也是有关于本标准的使用方面的。本标准的用户有责任建立起与之相适应的安全和健康规范，并在使用本标准前确定规章制度限制的适用性。2. 参考文献2.1 ASTM标准：D 1129 与水有关的术语D 1193 试剂水技术规范D 3370 从密闭水道中取水样的实践3. 专用术语3.1 定义：3.1.1 本试验方法中所使用的词条定义请参见“术语D1129”。3.2 本标准特定词条的定义：3.2.1 动态系统：容纳流动水的系统或容器。3.2.2 估计细菌数量：1.0毫升水样中的细菌数量，运用本试验方法中描述的技术能够培养成单一的可数菌落。3.2.3 静态系统：容纳非流动水的系统或容器。例如：装在瓶里或储存罐里的水。3.2.4 CFU：菌落形成单位（colony forming units）。3.2.4.1 评述：以泵驱动水循环系统和流水净化管线做示例。4. 试验方法概要4.1 把工业用取样器（SPC取样器）浸入水样中。1.0毫升量的水会自动通过一个0.45um孔度的细菌保持隔膜过滤器进入到用吸水材料制成的衬垫里。密封在过滤器背面的吸水衬垫含有脱水培养基介质，介质在通过过滤器时水合渗出。然后细菌被圈围到过滤器的表面，取样器开始培养细菌，使其逐渐成长成为可见的菌落。可直接计算菌落数量或使用低倍放大镜进行计算。4.2 对于高细菌数含量的样品，在进行上述4.1试验之前需用适当的稀释液进行稀释。5. 用途及重要性5.1 本试验方法为系统中的细菌污染源的确定提供了鉴别方式。5.2 本方法是一种筛选试验方式，只限用于对系统中的细菌污染程度（水平）进行估计。本试验方法旨在为估计水样中的细菌数量提供一项简单的现场技术。由于本方法使用的是1ml样品，所以不具有统计意义，除非可培养细菌量大于10cfu/ml。5.3 本试验方法适用于水中可培养的需养细菌和兼性需养细菌的检测。6. 仪器设备6.1 易耗品6.1.1 SPC取样器：一种提前消毒的细菌现场试验仪器，由0.45um孔度的细菌保持隔膜过滤器和带有如下描述的脱水培养基介质的吸水衬垫组成。过滤器和培养基介质吸水衬垫被一起封在一个桨状塑料架里（见图1），带有整装细菌培养器。6.1.1.1 M-HPC培养基配方（SPC取样器）（1）胨，2.0克（2）明胶，2.5克（3）甘油，1.0毫升（4）水，100毫升6.2 以下仪器只有在评价高细菌数含量水样（细菌数大于100/ml）而用到稀释液时才可使用。6.2.1 广口取样瓶：容量为至少300ml的容器，带有丝扣盖。取样瓶应能够保存细菌成分，用硼硅玻璃或其他材料制成，能够适应传统消毒程序。6.2.2 稀释瓶：由硼硅玻璃制成，带丝扣盖的耐高压瓶，100毫升容量。6.2.3 量筒：硼硅玻璃材质，10毫升和100毫升，经消毒。6.2.4 滴管：经消毒，可处理，带刻度，塑料或玻璃材质，1毫升容量。6.3 依照实践D 3370 中13.2.1和13.2.2节的步骤，对广口取样瓶和稀释瓶进行清洁和消毒。7. 试剂和材料7.1 试剂的纯度：试剂级的化学药品可用于所有的试验。除非另有说明，所有的试剂应符合美国化学协会分析试剂委员会提出的规范标准。7.2 水的纯度：除非另有说明，水的标准应为试剂水，符合D 1193，III类的规范。7.3 稀释水7.3.1 磷酸盐缓冲溶液，库存料：将34.0克的磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于500毫升的水中。用浓度为40克/升的氢氧化钠（NaOH）溶液调整pH值到7.2，并加水至1000毫升。用0.22um孔度的过滤器过滤消毒，或做热压处理15分钟温度121。放入冰箱储存并保持无菌状态。如果有浑浊或其他杂质出现，丢弃储存。pH值的明显改变说明溶液已被污染。允许的pH值为7.20.1。7.3.2 氯化镁溶液（81.4克/1000毫升）：将81.4克6水合氯化镁（MgCl2.6H2O）溶于1000毫升水中。混合均匀，并过滤消毒或做热压处理15分钟121。放入冰箱储存。如果有浑浊或其他杂质出现，丢弃储存。7.3.3 磷酸盐缓冲稀释水：把储存的1.25毫升磷酸盐缓冲溶液和5毫升的氯化镁溶液加入到1000毫升的试剂水中在容量瓶里混合均匀。最终pH值应为7.2。把缓冲稀释水以每份992毫升的量，消毒后平均分配到丝扣盖稀释瓶中，或更大容积的容器中，可做清洗水使用。立即消毒。7.3.4 胨稀释水：准备10%的胨水溶液。稀释一定量的溶液到浓度0.1%。最终pH值应为6.8。8. 取样8.1 动态系统：8.1.1 打开需测试的水系统出口阀，当系统水流出阀门时，用至少500毫升的清水冲洗阀门。冲洗完阀门后再让系统水继续流出几秒钟；然后直接用取样器的塑料套接水，水位至塑料套上刻度线为止（见图2）。8.1.2 在首次试验中，过滤器上显示细菌过量成长或有合流菌落，如细菌数量大于160，重新试验，取样器塑料套中的水位只需达到塑料套下刻度线。然后，加入经消毒的磷酸盐稀释水或胨稀释水。水位至塑料套的上刻度线即产生样品1比10的稀释液。8.1.3 如果在进行了上述8.1.2中1比10的稀释后，细菌仍然过量成长或有合流菌落，运用6.3节所描述的仪器，准备出样品1比100，1比1000的稀释液各一份。8.1.3.1 制备1：100的稀释液，加入1毫升试验样品到盛有99毫升经消毒的磷酸盐缓冲稀释水（见7.3.3）或胨稀释水（见7.3.4）的稀释瓶中。旋紧瓶盖。用力晃动瓶子30次，再把此经稀释的样品倒入取样器的塑料套至其上刻度线。8.1.3.2 按照8.1.3.1的方法制备1：1000的稀释液，但只需加入0.1毫升的试验样品到99.9毫升的稀释水中。8.2 静态系统：8.2.1 把水样直接装入取样器的塑料套至其上刻度线。8.2.2如果由于细菌含量过高需要把样品稀释，则按照8.1.2节或8.1.3节所描述的稀释程序进行。8.3 样品收集到后应尽快进行分析，取样与分析的间隔不能超过4小时。9. 操作步骤9.1 把桨状隔膜过滤器和衬垫架从塑料套中取出，全部浸入第8节所制备好的水样中保持30到60秒后取出，并甩去多余水分。清空塑料套，把衬垫架再牢固的装回塑料套中，如图2所示。注1：衬垫中培养基的水合将导致1.0毫升的水样自动过滤。9.2 把有取样器的塑料套放入细菌培养器，带有过滤器那一面朝上，进行482小时的培养，温度应设在302，然后把取样器从培养腔中取出。如果时间允许，培养期适当延长效果会更佳。在任何情况下，无论使用何种培养期，应保持这一时间期限的长短一致，并且在监测每一种类型的条件时重复使用这一时间期限。所使用的温度也必须一致。9.3 采用直接光照法计算过滤器上所有的菌落数量，并记录数据。注2：所出现的菌落为1到2毫米直径，边缘清晰，白色或彩色的圆点，在深色的过滤器上很容易看见。每个菌落代表了从1毫升水样中收集的一个细菌。注3：使用低倍放大镜（5-10倍）有助于菌落的计算。如果菌落体积小或在过滤器上分布很密集，建议使用放大镜。10. 计算10.1 如果使用1比10的稀释液，把9.3节中计算到的菌落数乘以10，并记录结果。如果使用的是1比100的稀释液，则应把菌落数乘以100。11. 精密度及偏差11.1 合作试验：本试验方法经七名试验人员在四个不同的实验室进行了评价。在研究中使用了两个原始湖水水样和一个细菌培养样。每个试验人员用每个水样做了三次试验。异点测试说明所有的数据都能够被运用到精密度的分析中（见图3）。11.2 以上样品试验的整体精密度（St）和单人试验（Op）精密度数据如下： 最 终 数 据 样品1 样品2 样品3平均（CFU） 84 25 81整体St 41 11 36单人Op 21 7 1411.3 由于未将本试验方法与已知的细菌含量试验方法进行比较和评估，所以在此不做偏差阐述。12. 关键词12.1 稀释；现场方法；异养细菌；筛选；SPC取样器图1：SPC取样器 过滤器；吸水衬垫图2：样品试验（a） 把取样器完全浸入塑料套的水样中30秒（）（b） 取出取样器并把多余的水分甩掉。（c） 清空塑料套。（d） 把取样器插入已清空的塑料套内然后放入细菌培养器。图3：整体试验和单人试验的标准偏差关于与本标准中的任何项目有关的任何专利权效力的保护，美国试验与资料协会不发表意见。特提醒本标准的用户，任何此类专利权效力的保护，以及侵犯此类专利权的风险，纯属用户自身的责任。本标准由负责的技术委员会进行修改，并每5年评审一次，如果未进行修改，则应重新审批或收回。欢迎广大用户直接向ASTM总部针对本标准或其余标准提出修改意见。您的意见将由负责的技术委员会进行慎重的考虑和讨论，届时邀请您参加。如果您认为您的意见未被正确采纳，您可致函：ASTM Committee on Standards, 100Barr Harbor Drive