第八章-染-色

第八章染色 一 染色的目的任何冰冻切片 石蜡切片等如果不经过染色 在显微镜下只能看到细胞及其它组织成分的轮廓 即使由于组织内部各种物质的折射指数不同 从光线的明暗上能观察到一些组织结构 但也是极其简单有限的 远不能满足观察和借以诊断的目的 染色的目的 将染料配制成溶液 将组织切片浸入染色剂内 经过一定的时间 使组织或细胞及其他异常的成分被染上不同深浅的颜色 产生不同的折射率 便于在光学显微镜下进行观察 因此 染色在组织形态学 特别是病理形态诊断 科研和教学工作中 都具有非常重要的意义和实用价值 二 染色的原理染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程 有关两者结合的原理 学说不同 尚未完全清楚 而只一般基本认为过程是化学反应和物理现象 染色的化学反应在组织细胞内 一般有酸性和碱性区别 酸性物质部分能与溶液中的阳离子结合 碱性物质部分能与溶液中的阴离子结合 在细胞核中 特别是核内染色质 一般有酸性物质组成 其中主要有核酸 故与碱性染料的亲和力很强 易于染色 以氧化苏木素为代表的碱性染料中有染色作用的是阳离子 在细胞浆中则由碱性物质组成 所以胞浆与酸性染料有较强的亲和力 以伊红染料为代表的酸性染料中有染色作用的是阴离子 染色的物理作用1 毛细作用及渗透作用组织有许多小孔 染料由渗透作用进入组织 它与组织没有牢固的结合 所以是单纯的物理作用 不能称为直接染色作用 染色必需是染料留贮于组织内与组织有较稳固的结合 2 吸收或溶液作用组织吸收染料 作牢固的结合 组织的着色与溶液颜色相同 但不是和干燥染料的颜色相同 如复红溶液为红色 所染组织也为红色 而干燥的复红带绿色 3 吸附作用吸附作用是固体物理的特性 它能从周围溶液中吸住一些细小的物质微粒 这些微粒可能是溶于溶液中的化合物 也可能是只在溶液中单独存在的离子 如染液中分散的色素粒子进入被染物质的间隙内 由于分子的引力作用 色素粒子被吸附而染色 三 染色术语的概念 1 普通染色在组织制片技术中 常规制片最广泛应用的是苏木精和伊红染色 又称为常规染色 HE染色 2 特殊染色特殊染色就是为了显示特定的组织结构或其他的特殊成分 是常规染色的必要补充 也是染色技术中不可缺少的部分 它在病理诊断中起到辅助作用 3 单一染色选用一种染料进行的染色 如用铁苏木素染睾丸生精细胞等 4 复染色用两种不同性质的染料进行染色的方法 如用苏木素和伊红分别使细胞核及胞质染成两种颜色 5 多种染色选用两种以上的染料的染色 如Masson三色染色法 6 进行性 退行性染色进行性染色又称渐进性染色 将组织成分着色自浅至深 当达到所需要的强度时 终止染色 此种方法称为进行性染色 一般所采用的染液溶度较低 染色过程中应该不时在镜下观察进行控制 这样才能得到染色强度适中的效果 退行性染色又称退性染色 先将组织浓染过度 使其超过所需的程度 然后再用某些溶液脱去多余的染色剂 以达到适当的深度 并使不应着色的组织 细胞的某些成分脱去色度 这个步骤称为 分化 而最终使应该着色部分达到适宜程度 如常规HE染色中的苏木素染核与盐酸水分化过程就是退行性染色 四 染色与分化剂在退行性染色中 需用某些特定的溶液把附着在组织细胞上多余的染色剂脱去 从而使目的物与周围组织形成鲜明的对比 同时使目的物本身的色泽也深浅适当 这种选择地除去多余染色剂的过程 称为分化 所使用的溶液即为分化剂 分化剂分为三类 酸性分化剂如盐酸 醋酸等 它们能和媒染剂 金属 相结合形成可溶性盐类 从而打开了媒染剂和组织细胞的结合 使组织细胞脱色 氧化分化剂如苦味酸 铬酸 重铬酸钾和过锰酸钾等 属于氧化剂 在染色中经过氧化作用后 使染色剂与组织的某种成分的结合更牢固 媒染分化剂媒染剂能促使组织细胞和染色剂相结合 但是将已经过染色的切片再放到媒染剂的溶液中 又可使已经和组织相结合的染色剂脱失 这就是媒染剂的另一种功能 称之为媒染分化剂 五 染色中的注意事项 较多的组织切片染色 是经过固定 脱水 透明 包埋 切片 脱蜡等步骤以后 再进行染色 有的是直接冰冻切片后即可染色 这些都是根据不同的目的要求而进行的染色 染色准备工作和染色实验室的设置 都是做好染色工作的必要条件 各种器皿的清洗要严格 按染色方法中的细节去做 染色试剂的配制时间长短和存放 一定要按化学性质与组织的着色能力进行正确掌握使用 实验室常规设置要合理 有条件时 可应有通风设备 实验台和实验柜 各种器皿和染色所需物品必须齐全 具有一定的条理性 是开展染色工作和提高质量的必要条件 在染色过程中 即要按照书本的方法去进行操作 又要根据实际情况进行灵活运用 在实践中 不断地总结经验和教训 才能熟练掌握染色方法和提高实际工作能力 由于染色方法较多 掌握染色种类应多一些 对不同的组织选用针对性较强的方法进行染色 才能提高染色质量 六 染色中的基本原则 一 染色前的处理 脱蜡至水凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱蜡 各级乙醇至水洗的过程 切片脱蜡 二甲苯 各5 10 95 乙醇 各5 75 乙醇5 自来洗水冲 二甲苯和各级乙醇必须保持一定纯度 不能混入其他杂质成分 而使染色受到影响 除去汞盐沉淀物对于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片 切片脱腊后需脱汞 浸入5 碘酒精10 脱碘 5 硫代硫酸钠 流水洗 染色 脱甲醛色素甲醛固定组织时间较长及温度较高情况下 甲醛易氧化自行分解产生甲酸 导致组织成酸性 此时可能有甲醛色素产生 此种色素无光泽 不溶于水 乙醇 二甲苯等 对于这种色素可用下列方法除去 1浓氨水1ml 75 乙醇200ml 切片脱蜡后置溶液中30 或较久 流水洗 染色 21 氢氧化钾1ml 80 乙醇100ml 切片脱蜡后置溶液中10 流水洗5 80 乙醇5 蒸馏水洗 染色 除铬沉着物有些组织用含铬的 enker氏液等固定 致有铬沉淀物 可应用盐酸乙醇溶液 或用5 碘酒和5 硫代硫酸钠水溶液处理 二 染色后的处理 染色后的脱水对于大多数的切片 染色后必需要经过脱水 95 乙醇 各5 100 乙醇 各5 染色后的透明组织经过脱水核透明后会产生一定的折射率 为防止空气中的有色素的细小颗粒沉淀在组织中的不良影响 需加透明处理以使组织切片清晰 二甲苯 各5 透明 三 染色封固剂组织制片需随时检查和保存 故要有盖玻片封固 通常用中性树胶 此封固剂质量已普遍应用 一 苏木素 伊红染色的应用及其配制 一 苏木素染色的应用 1 HE染色在医学领域中的组织学 生物学 病理学及其细胞检查中 是必不可少的最基本染色方法 2 在病理诊断 活检 教学 科研工作中都被广泛应用 对细胞学的观察也具有重要价值 3 HE染色主要显示各种组织正常成份和病变的一般形态结构 病理组织学的基本知识大部分都是从观察HE染色切片中获得的 二 HE染液的配制 苏木素染液苏木素又称苏木精 为植物染料 是从苏木树树心提炼出来的天然染料 淡黄褐色粉末 易溶于酒精 甘油 加热可溶于水 苏木素本身没有染色能力 配制时必须加入含金属的媒染剂 钾明矾 才能达到染色之目的 配制后还需经过氧化成熟产生苏木红才能进行染色 有自然氧化成熟和人工氧化成熟 配制法有下列几种 1 哈瑞氏 harris 苏木素染液最常应用染色时间为5 10 配制 蒸馏水1000ml 苏木素3 5g 碘酸钠1g 钾明矾50 80g 水醋酸20ml优点是 配后即可应用 染色力较强 缺点是 极易产生金属膜沉淀 2 埃利希 Ehrlich 苏木素染液配制 无水乙醇100ml 甘油100ml 苏木精2g 钾明矾2 3g 醋酸5 10ml置于阳光下自然氧化3个月左右成熟 其优点是 染色结果甚佳 贮存愈久染色愈强 而且不需分色 伊红染液苏木素染色后 需用伊红染料作对比染色 伊红着色深浅不一 如胶元纤维粉红色 肌纤维深红色 红血球橙色 这样细胞核 细胞桨着色清晰 鲜明 便于鉴别 伊红常用配制有两种1 0 5 1 水溶性伊红乙醇液伊红0 5 1g 95 乙醇25ml 蒸馏水75ml 醋酸1 2滴 2 伊红B0 5g 80 乙醇100ml溶解后用 组织切片H E染色步骤 二甲苯 10min 二甲苯II 无水乙醇 10min 2min 无水乙醇II 2min 95 乙醇I 1min 90 乙醇 1min 80 乙醇 1min 流水冲洗 苏木精染液 5min 1min 1 盐酸乙醇 快 流水冲洗 10min 伊红染液 1min 流水冲洗 30s 85 乙醇 20s 90 乙醇 30S 95 乙醇I 95 乙醇 2min 1min 无水乙醇I 2min 无水乙醇II 2min 二甲苯I 2min 二甲苯II 2min 中性树胶盖玻片封片 切片观察 流水冲洗 2min 三 染色时应注意事项一张优质的HE染色切片 绝非仅指染色而言 它包括很多方面 首先应重视 固定 环节 其次注意脱水 透明 组织浸蜡 包埋和切片等各个步骤 一张因固定 脱水等步骤有所缺陷的切片 染色是不可能鲜艳 透明 层次分明的 解决上述各细节问题的方法已在前面各章节中均提到过 但在进行HE染色时还应注意以下问题 1 组织切片的脱蜡步骤应彻底 否则无论进行那种染色都会发生困难 脱蜡时间要充分 若溶蜡剂使用过久应及时更换以免效率降低 若室温过低 可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡 2 苏木素染液使用一段时间后表面易出现亮晶状飘浮物 这可能是液体表面的过氧化物 必须过滤除去 以防沉渣污染组织切片 苏木素液一般染过三 四百张切片后 着色力会减弱 着色不鲜艳 呈灰蓝色时应及时更换新液 3 染色的时间长短需依据 染剂对组织的染色作用 室温条件 切片厚薄 固定液的类别 染液的新旧而进行调节 所以在染色时必须使用显微镜观察染色程度以利掌握时间 4 分化十分重要 分化步骤的准确也是染色成败的关键 若分化失当则必然引起染色不匀或过淡 过深等现象 因此分化后一定要镜检 观察胞核是否清晰 胞浆呈淡白色 否则需再次分化 不然一旦复染后 组织会呈紫蓝色即 蓝盖红 现象 5 还原液不宜过浓 若碱性太强易使组织脱落故以淡为宜 6 伊红宜淡染 复染过深胞核会不清晰 影响镜检 7 若脱水 透明等步骤不够彻底 则组织表面会有一层雾状膜 若有这一现象 应立即更换纯酒精脱水 再次透明 在潮湿的季节里应注意酒精的浓度 若降低要及时更换 8 染色后的组织切片 要将组织四周的污染物痕迹擦掉 以免影响美观 9 封固剂要适量 滴加时应小心倾滴 盖玻片要轻轻放置 以免气泡产生影响镜检 盖玻片大小选择要合适 一般要大于组织块 以防封盖不全 盖玻片要放正 标签贴牢 编号清楚 从而保证切片的封藏和美观 10 染好的切片应妥为保存 更应避免日光照射 否则切片容易褪色 二 冰冻切片的快速染色方法 切片固定30秒 1分钟 水洗 染苏木素3 5分钟 分化 于碱水中返蓝20秒 伊红染色10 20秒 脱水 透明 中性树胶封固 冰冻组织1 2分钟 切片1分钟 固定1分钟 染色共五分钟 总共在10分钟内完成快速制片过程 常规方法 1 冰冻切片固定10 30s 2 稍水洗1 2s 3 苏木精液染色 60 30 60s 4 流水洗去苏木精液5 10s 5 1 盐酸乙醇1 3s 6 稍水洗1 2s 7 促蓝